聚乙烯醇-細(xì)菌纖維素復(fù)合可吸收生物屏障膜的制備及理化性能研究

趙正宜，肖劍虹，劉重遠(yuǎn)，鄒多宏，2

引導(dǎo)性骨再生(guided bone regeneration, GBR)技術(shù)已經(jīng)成為牙槽骨缺損修復(fù)與再生的常規(guī)及有效的治療方案。目前臨床常應(yīng)用的屏障膜為可吸收生物膜，存在機(jī)械強(qiáng)度弱，容易穿孔并破裂等缺點(diǎn)[1]。聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)是一種由聚醋酸乙烯酯水解而成的，無色、無毒、無腐蝕性、可降解的水溶性有機(jī)高分子聚合物。PVA所表現(xiàn)出來的性能在生產(chǎn)、生活中具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用，例如造紙、紡織品、粘合劑、涂料、薄膜以及藥物輸送等[2-4]。細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose, BC)是一種天然纖維素，由醋酸桿菌、固氮菌、根瘤菌及假單胞菌等細(xì)菌產(chǎn)生[5]。BC不同于植物纖維素，其具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性，如高化學(xué)純度、高楊氏模量、高吸水能力以及超細(xì)的網(wǎng)狀纖維狀結(jié)構(gòu)，在醫(yī)用敷料、組織工程及納米合成功能材料等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[6-7]。該研究主要采用溶液共混的方法將PVA與BC共混，制備PVA-BC可吸收生物屏障膜，并對(duì)其物理性能和生物相容性進(jìn)行研究，探索其作為新型骨組織工程生物屏障膜的可行性，為將來臨床應(yīng)用提供一種選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料PVA 1 750±50(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，BC(生化級(jí)，阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)，鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH/3T3細(xì)胞，中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。

1.2 試劑和儀器DMEM、胰酶消化液(美國Hyclone 公司)；胎牛血清(美國Gibco 公司)；CCK-8試劑盒(日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所)；力學(xué)萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)(5565A，美國英斯特朗公司)；CO2孵箱(美國Thermo 公司)；掃描電鏡(Supra40，德國蔡司公司)；X 射線衍射儀(X′Pert3 Powder，荷蘭帕納科公司)；傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet 8700，美國熱電尼高力儀器公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-tek 公司)。

1.3 薄膜制備首先配制1 g/L PVA溶液，稱取PVA固體加入去離子水中，放入磁子，在90 ℃下攪拌3 h獲得透明PVA溶液。將BC以不同含量加入到PVA溶液中，分別制備PVA∶BC質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為10 ∶3、10 ∶5、10 ∶7、10 ∶9的溶液，攪拌2 h形成均勻的PVA/BC二元共混液，置于真空箱內(nèi)多次去除氣泡，然后將混合液倒入培養(yǎng)皿中，置于恒溫加熱臺(tái)等待24 h干燥成膜，見圖1。

圖1 PVA-BC復(fù)合膜的合成方案及形貌

1.4 力學(xué)測(cè)試薄膜拉伸實(shí)驗(yàn)使用萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(Instron 5565，美國) 進(jìn)行測(cè)試，使用500 N重力傳感器，速度為0.01 mm/s。條形樣品(50 mm×3 mm) 在室溫條件下進(jìn)行拉伸。每組樣品重復(fù)測(cè)試6次。取抗拉強(qiáng)度最大的復(fù)合膜組，重新制備待測(cè)樣品后浸泡于去離子水中1 h，同樣的方法測(cè)量濕態(tài)樣品抗拉強(qiáng)度，最后繪制出相應(yīng)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線和斷裂應(yīng)力值圖。

1.5 樣品表征選取抗拉強(qiáng)度最大的復(fù)合膜組和純PVA膜組樣品，力學(xué)測(cè)試后收集斷裂截面，經(jīng)過制樣、噴金等步驟，用掃描電鏡觀察兩組截面的微觀結(jié)構(gòu)。采用X射線衍射分析儀掃描檢測(cè)PVA、BC和PVA-BC薄膜，掃描速度為0.2°/min，在5°～55°(2θ)范圍內(nèi)進(jìn)行分析。分別將PVA、BC和PVA-BC薄膜樣品在傅里葉變換紅外光譜儀上進(jìn)行各成分分析，采集波長范圍為500～4 000 cm-1。

1.6 細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法測(cè)定薄膜對(duì)細(xì)胞增殖能力和活力的影響。取抗拉強(qiáng)度最大的復(fù)合膜組和純PVA膜組，兩組分別作為實(shí)驗(yàn)組和陰性實(shí)驗(yàn)組，按照國際標(biāo)準(zhǔn)組織(ISO/EN 10993-12)[8]規(guī)定提取浸提液。將滅菌后的上述兩組樣品分別浸泡于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，樣品與培養(yǎng)基的比例為1 g/10 ml，24 h后獲得浸提液。使用96孔板，NIH/3T3細(xì)胞播種，細(xì)胞密度為每孔1×104個(gè)，空白對(duì)照組細(xì)胞僅用培養(yǎng)基培養(yǎng)，陰性實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁后分別更換為每孔100 μl的純PVA膜和抗拉強(qiáng)度最大的復(fù)合膜浸提液，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在第1、4、7天，配置含10% CCK-8的DMEM，每孔加100 μl，37 ℃、5%CO2培養(yǎng) 2 h。用酶標(biāo)儀在 450 nm 處讀取吸光度(optical density, OD)值。

2 結(jié)果

2.1 各組膜抗拉強(qiáng)度的比較圖2為各組薄膜樣品應(yīng)力-應(yīng)變曲線及斷裂應(yīng)力值。在一定范圍內(nèi)，隨著BC含量的增加，PVA-BC復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度也增加，當(dāng)PVA與BC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為10 ∶7時(shí)，復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度達(dá)到最大(155.5±14.7) MPa，顯著高于純PVA薄膜(56.0±6.7) MPa。隨后繼續(xù)增加BC的含量，抗拉強(qiáng)度開始下降，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=67.239，P<0.001)；兩兩比較顯示，純PVA膜組與10 ∶3、10 ∶5、10 ∶7、10 ∶9 PVA-BC組組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，10 ∶7 PVA-BC組與10 ∶3、10 ∶5、10 ∶9 PVA-BC組組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即當(dāng)PVA與BC質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為10 ∶7時(shí)，復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度最大。考慮到GBR膜實(shí)際使用為體內(nèi)濕態(tài)環(huán)境，取干態(tài)抗拉強(qiáng)度最大的10 ∶7 PVA-BC膜組進(jìn)行濕態(tài)下的力學(xué)測(cè)試。圖2C、2D顯示濕態(tài)下的復(fù)合膜強(qiáng)度達(dá)到(13.8±1.2) MPa。

圖2 PVA-BC復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度測(cè)試A:各組樣品的典型拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線；B:各組樣品的斷裂應(yīng)力值；與PVA組比較：#P<0.05；與10 ∶7組比較：*P<0.05；C：PVA-BC復(fù)合膜的典型拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線干濕態(tài)對(duì)比；D：PVA-BC復(fù)合膜的斷裂應(yīng)力值干濕態(tài)對(duì)比

2.2 試件表征純PVA薄膜和PVA-BC復(fù)合膜的橫斷面電鏡下觀察結(jié)果顯示，PVA薄膜的斷面光滑致密，幾乎無孔(圖3A、3B)，共混膜PVA-BC的橫斷面形貌略粗糙于純PVA膜，厚度約為30 μm，BC的加入降低了材料的延展性，形成強(qiáng)韌的薄膜。結(jié)果表明，PVA薄膜加入BC后韌性和拉伸強(qiáng)度均有提高，未觀察到團(tuán)聚和宏觀上的分離情況，表明薄膜中PVA和BC分散良好(圖3C、3D)。XRD結(jié)果顯示混合薄膜顯示出多個(gè)衍射峰，分別為PVA的特征峰19°和BC的3個(gè)特征峰14°、16°和22°。圖3F顯示復(fù)合膜在3 410 cm-1處有1個(gè)寬闊的吸收峰，在 2 939 cm-1、1 424 cm-1、1 142 cm-1、1 093 cm-1和851 cm-1均存在吸收峰，表明復(fù)合膜與PVA結(jié)晶度相關(guān)。復(fù)合膜在3 400 cm-1、2 920 cm-1、1 643 cm-1及1 064 cm-1附近有明顯吸收峰，表明所得產(chǎn)物具有纖維素的特征峰(圖3E)。

圖3 PVA-BC復(fù)合膜的微觀結(jié)構(gòu)和成分分析A、B：純PVA薄膜截面；C、D：PVA-BC復(fù)合膜截面；E：PVA-BC復(fù)合膜的X射線衍射結(jié)果；F：PVA-BC復(fù)合膜的傅里葉變換紅外光譜結(jié)果

2.3 細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，在共培養(yǎng)的第1、4、7天的相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，NIH/3T3細(xì)胞在空白對(duì)照組、陰性實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)組都保持了較高的增殖水平，相同時(shí)間點(diǎn)各組OD值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ，見表1。說明PVA-BC薄膜具有良好的生物相容性。

表1 各組材料與NIH/3T3細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間后的OD值比較

3 討論

GBR技術(shù)中的屏障膜將快速增長的軟組織與緩慢生長的骨組織分離開，以達(dá)到屏障的作用，最終達(dá)到牙槽骨組織的修復(fù)與再生的效果。目前使用的GBR膜可分為可吸收膜和不可吸收膜，不可吸收膜雖然具有更加穩(wěn)定的機(jī)械性能以提供穩(wěn)定的骨修復(fù)環(huán)境，但卻需要二次手術(shù)取出，另外也存在術(shù)后暴露的問題，從而增加了患者的二次創(chuàng)傷及骨增量失敗的風(fēng)險(xiǎn)[9]；可吸收膜由天然或合成材料制成，植骨術(shù)后一定時(shí)間(2周至幾個(gè)月不等)完成吸收，無需二次手術(shù)取出，在一定時(shí)間內(nèi)有效阻止了軟組織進(jìn)入骨修復(fù)區(qū)域，從而促進(jìn)了新骨形成。但可吸收生物屏障膜存在機(jī)械強(qiáng)度不足的問題，這樣不利于牙槽骨修復(fù)的效果，特別針對(duì)大面積骨缺損的修復(fù)重建(高度/寬度>5 mm)。

因此，本研究將PVA溶液和BC溶液以不同比例混合攪拌制備PVA-BC薄膜，旨在制備出新型可代謝高機(jī)械性能GBR膜。PVA本身具有高親水性和優(yōu)異的力學(xué)性能，無毒且溶于水，具有良好的可降解性，是一種生物相容性良好的水凝膠，具有生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用所需的特性[10]。BC在生物材料領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，其具有生物相容性好、親水性強(qiáng)、機(jī)械強(qiáng)度高、比表面積大等優(yōu)點(diǎn)，已有多項(xiàng)研究[11-12]表明，向聚合物網(wǎng)絡(luò)中引入BC可大大提高復(fù)合物的機(jī)械性能，可充當(dāng)納米復(fù)合材料的增強(qiáng)添加劑[13]。因此，本研究旨在制備一種基于PVA的復(fù)合材料，由PVA作為連續(xù)相，添加BC作為增強(qiáng)納米材料，BC可通過廣泛形成氫鍵與PVA聚合物基體發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使PVA和BC納米纖維表面形成牢固的界面，形成非常堅(jiān)固的納米復(fù)合材料[14]。完成制備后進(jìn)行拉伸測(cè)試，當(dāng)PVA與BC質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為10 ∶7時(shí)，復(fù)合膜抗拉強(qiáng)度達(dá)到最大(155.5±14.7) MPa，此外，PVA和BC的高保水性使薄膜具有足夠的柔韌性和濕潤性，取該最強(qiáng)組，測(cè)試濕態(tài)下抗拉強(qiáng)度為(13.8±1.2) MPa，顯著高于市售Bio-Gide膠原膜1.16 MPa[10]。因此，該復(fù)合膜在濕態(tài)情況下也具備一定強(qiáng)度。生物相容性實(shí)驗(yàn)表明PVA-BC膜具有良好的生物相容性。

綜上所述，本研究通過溶液共混法制備出PVA-BC復(fù)合膜，并探索出最佳機(jī)械性能比例，對(duì)其結(jié)構(gòu)、成分、形態(tài)進(jìn)行表征，并進(jìn)行生物相容性檢測(cè)。結(jié)果表明，這種復(fù)合膜具有較高的機(jī)械性能，且生物相容性良好，具備成為GBR膜候選材料的潛力。下一步將通過體內(nèi)大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確其在牙槽骨缺損修復(fù)與再生中的作用。