低溫脅迫下不同耐低溫性中國(guó)南瓜苗期生理差異分析

邱喜巖 段 穎 張 碩 張 蒙 疏 琴 孫雅佩 何亞迪 廖青桂 王長(zhǎng)林，2* 薄凱亮*

〔1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2 中蔬生物科技（壽光）有限公司，山東壽光 262700〕

中國(guó)南瓜（Duch.）具有適應(yīng)性強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)等特點(diǎn)，常被用作嫁接砧木，可以提高西瓜、黃瓜等重要葫蘆科作物的抗病性和抗逆性。尤其在北方保護(hù)地黃瓜生產(chǎn)中，以南瓜為砧木進(jìn)行嫁接栽培已被廣泛應(yīng)用。大量研究證明，使用耐低溫性強(qiáng)的砧木可有效提高嫁接苗對(duì)低溫脅迫的耐受性（Aloni et al.，2010；Schwarz et al.，2010）。因此篩選耐低溫中國(guó)南瓜種質(zhì)資源，培育耐低溫的新品種，是砧用南瓜的重要育種目標(biāo)之一。

低溫脅迫嚴(yán)重影響蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，是制約北方冬春季保護(hù)地蔬菜生產(chǎn)的重要環(huán)境因素之一。在低溫條件下，植物細(xì)胞膜最先感知溫度的變化，然后通過信號(hào)傳遞，產(chǎn)生一系列反應(yīng)來抵御低溫脅迫，例如：①增加細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量從而維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性（Yadav，2010；Theocharis et al.，2012）；② 積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸等來調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢(shì)（王芳 等，2019）；③升高POD、SOD、CAT 等抗氧化酶活性，清除體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧（趙春梅 等，2014）。低溫脅迫下，植物光合指標(biāo)也會(huì)發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為葉綠素含量的降低，凈光合速率和最大PSⅡ光能轉(zhuǎn)換效率（Fv/Fm）等指標(biāo)的降低（Fu et al.，2016）。研究表明，耐低溫性強(qiáng)的南瓜品種中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶活性、葉綠素含量和光合速率均高于低溫敏感品種（李凱，2008；梁雨昕等，2014；許小江 等，2015）。

目前，關(guān)于不同南瓜材料對(duì)于低溫脅迫的響應(yīng)已有報(bào)道，主要集中在不同種質(zhì)生理指標(biāo)的變化規(guī)律上，但相關(guān)研究還不夠系統(tǒng)和深入，尚不能深入解析南瓜耐低溫的生理機(jī)制。本試驗(yàn)以2 份耐低溫材料和2 份低溫敏感材料為試材，在人工氣候室中進(jìn)行晝/夜為10 ℃/2 ℃（12 h/12 h）的低溫脅迫處理，以晝/夜為25 ℃/15 ℃（12 h/12 h）作為常溫對(duì)照，測(cè)定不同材料在低溫脅迫下相關(guān)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、葉綠素、光合作用參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等指標(biāo)，比較、分析各項(xiàng)指標(biāo)間的差異及其相關(guān)性，以期為解析中國(guó)南瓜耐低溫性機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試中國(guó)南瓜2 份耐低溫種質(zhì)（N1 和N2）和2 份低溫敏感種質(zhì)（N3 和N4）均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南瓜遺傳育種課題組保存的自交6 代以上純合自交系。N1 為柿餅?zāi)瞎?，N2 為紅皮架瓜，N3為C05，N4為西班牙南瓜。前期研究發(fā)現(xiàn)，這4 份種質(zhì)在耐低溫性方面存在顯著差異。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2021 年10—11 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。4 份材料分別播種于營(yíng)養(yǎng)缽中，置于常溫人工氣候室中，晝/夜為25 ℃/15 ℃（12 h/12 h），每份材料播種80 粒。待幼苗第1 片真葉完全展開，第2 片真葉剛剛露頭時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)整齊一致的幼苗，分為2 組，每組30 株，一組進(jìn)行低溫脅迫處理，另一組作為常溫對(duì)照。低溫脅迫處理溫度設(shè)置晝/夜為10 ℃/2 ℃（12 h/12 h），常溫對(duì)照晝/夜為25 ℃/15 ℃（12 h/12 h），光照強(qiáng)度均為400 μmol·m·s。處理后第0、3、7、10 天對(duì)幼苗表型進(jìn)行觀察拍照，并分別取從上往下第2 片真葉測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)；每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)3 株。

可溶性糖含量測(cè)定：采用北京索萊寶科技有限公司植物可溶性糖含量檢測(cè)試劑盒，使用蒽酮比色法測(cè)定，具體方法參照說明書。

可溶性蛋白含量測(cè)定：采用北京索萊寶科技有限公司植物Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，使用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定，具體方法參照說明書。

葉綠素含量測(cè)定：采用乙醇浸提法測(cè)定葉片葉綠素含量（林宏輝，2012）。

光合氣體交換參數(shù)測(cè)定：使用美國(guó)PP SYSTEMS CIRAS-3 便攜式光合儀測(cè)定植物的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr），測(cè)定光強(qiáng)為800 μmol·m·s，CO濃度為400 μmol·mol，葉室溫度為25 ℃，流速為500 μmol·s。選取從上往下第2片功能葉，之后每次測(cè)定相同的葉片，分別于第0、3、7 天測(cè)定，每次測(cè)定4 株。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定：使用北京澳作生態(tài)儀器有限公司的OS5p 調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定前將待測(cè)葉片進(jìn)行暗適應(yīng)20 min，避開葉脈，測(cè)定葉綠素的初始熒光（F）和最大熒光產(chǎn)量（Fm），計(jì)算光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）和PSⅡ潛在活性（Fv/F）。選取從上往下第2 片功能葉，之后每次測(cè)定相同的葉片，分別于第0、3、7 天測(cè)定，每次測(cè)定4 株。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，運(yùn)用SPSS 軟件進(jìn)行生理生化指標(biāo)分析，采用LSD 法進(jìn)行差異顯著性分析；利用SAS 9.0 軟件對(duì)脅迫耐受系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

脅迫耐受系數(shù)=低溫處理測(cè)定值/對(duì)照測(cè)定值

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)不同耐低溫性中國(guó)南瓜幼苗表型的影響

低溫脅迫后，不同的中國(guó)南瓜材料葉片表型之間差異明顯（圖1）。在經(jīng)過低溫脅迫處理3 d 后，葉片均出現(xiàn)了不同程度的干枯、卷曲；低溫脅迫7 d 后，N3 和N4 受害較N1 和N2 嚴(yán)重，N3 葉片邊緣失綠褪色，向內(nèi)卷曲，N4 葉片大面積干枯，N1受害情況不明顯，葉片有輕微失綠，N2 葉片邊緣略有干枯，面積較小；低溫脅迫10 d 后，N1 葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，N2 葉片與7 d 相比差異不大，葉片邊緣干枯，N3 和N4 葉片受害嚴(yán)重，干枯程度加重。由此可以看出，低溫敏感種質(zhì)N3 和N4 的受害程度明顯重于耐低溫種質(zhì)N1 和N2，在低溫脅迫7 d后二者受害程度差異較為明顯。

圖1 低溫脅迫后不同中國(guó)南瓜材料幼苗葉片表型變化

2.2 低溫脅迫對(duì)不同耐低溫性中國(guó)南瓜幼苗可溶性糖含量的影響

低溫脅迫后，4 份中國(guó)南瓜材料的可溶性糖含量與同時(shí)期對(duì)照相比均升高，增長(zhǎng)幅度不同材料間存在差異（表1），與常溫對(duì)照相比N1、N2、N3和N4 在低溫處理7 d 時(shí)可溶性糖含量分別上升到對(duì)照的8.41、8.74、5.78 倍和4.24 倍，耐低溫種質(zhì)可溶性糖含量的上升幅度明顯大于低溫敏感種質(zhì)；處理10 d 時(shí)，耐低溫種質(zhì)N1 和N2 的可溶性糖含量仍明顯高于低溫敏感種質(zhì)N3 和N4。

表1 低溫脅迫對(duì)不同中國(guó)南瓜材料可溶性糖含量的影響 mg·g-1

2.3 低溫脅迫對(duì)不同耐低溫性中國(guó)南瓜幼苗可溶性蛋白含量的影響

從表2 可以看出，低溫脅迫后，4 份中國(guó)南瓜材料的可溶性蛋白含量均呈先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)，但與同時(shí)期對(duì)照相比無明顯規(guī)律。N4低溫脅迫3 d 時(shí)，可溶性蛋白含量迅速升高，且與常溫對(duì)照存在極顯著差異；低溫脅迫7 d 時(shí)，N1、N2 和N4 與同時(shí)期常溫對(duì)照相比存在顯著或極顯著差異。不同種質(zhì)在經(jīng)過低溫脅迫后可溶性蛋白含量變化差異較大，但耐低溫種質(zhì)與低溫敏感種質(zhì)間無明顯差異。

表2 低溫脅迫對(duì)不同中國(guó)南瓜材料可溶性蛋白含量的影響 mg·g-1

2.4 低溫脅迫對(duì)不同耐低溫性中國(guó)南瓜幼苗葉片葉綠素含量的影響

由表3 可知，4 份中國(guó)南瓜材料幼苗的葉片葉綠素含量總體上呈隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低的變化趨勢(shì)，最終均極顯著低于同時(shí)期常溫對(duì)照。低溫脅迫3 d 時(shí)，4 份材料均與常溫對(duì)照無顯著差異；低溫脅迫7 d 時(shí)N3、N4 與常溫對(duì)照達(dá)極顯著差異，而N1 和N2 則在低溫脅迫10 d 時(shí)才與常溫對(duì)照達(dá)到極顯著差異水平。低溫脅迫10 d 時(shí)，N1 的葉綠素含量最高；N2 在常溫處理0、3 d 和7 d 時(shí)，與其他材料相比葉綠素含量均較低，低溫脅迫后的降低幅度也較小。表明，耐低溫種質(zhì)能夠在低溫脅迫下更好地維持葉片葉綠素的含量。

表3 低溫脅迫對(duì)不同中國(guó)南瓜材料葉片葉綠素含量的影響 mg·g-1

2.5 低溫脅迫對(duì)不同耐低溫性中國(guó)南瓜幼苗光合氣體交換參數(shù)的影響

低溫脅迫對(duì)不同耐低溫性中國(guó)南瓜種質(zhì)相對(duì)凈光合速率的影響見表4，隨著低溫脅迫天數(shù)的增加，4 份材料的凈光合速率均顯著下降，脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，凈光合速率越??；低溫脅迫后，4 份材料與同時(shí)期常溫對(duì)照均達(dá)極顯著差異，說明低溫脅迫嚴(yán)重影響中國(guó)南瓜幼苗的光合作用，導(dǎo)致凈光合速率極顯著降低。此外，經(jīng)過低溫脅迫后，耐低溫種質(zhì)的凈光合速率在脅迫后同一處理時(shí)間均高于低溫敏感種質(zhì)，表明低溫脅迫下低溫敏感的中國(guó)南瓜幼苗光合能力受到的抑制更為嚴(yán)重。

表4 低溫脅迫對(duì)不同中國(guó)南瓜材料光合氣體交換參數(shù)的影響

氣孔導(dǎo)度、胞間CO濃度和蒸騰速率作為重要的光合參數(shù)影響植物進(jìn)行光合作用。由表4 可知，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，4 份材料幼苗葉片的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均明顯下降，胞間CO濃度呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。

2.6 低溫脅迫對(duì)不同耐低溫性中國(guó)南瓜幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

Fv/Fm 表示植株P(guān)SⅡ的最大光化學(xué)效率，在逆境脅迫條件下變化明顯；Fv/F表示PSⅡ的潛在活性，反映了植物潛在的最大光合能力（張守仁，1999）。由表5 可知，低溫脅迫后，4 份中國(guó)南瓜材料的Fv/Fm 和Fv/F均出現(xiàn)了不同程度的下降，其中N3 下降幅度最大，N1 下降幅度最小。低溫脅迫7 d 時(shí)，N3 和N1 的Fv/Fm 值分別下降到同時(shí)期常溫對(duì)照的37.33%和60.00%，F(xiàn)v/F分別下降到同時(shí)期常溫對(duì)照的13.73%和30.84%，表明耐低溫種質(zhì)在經(jīng)過低溫脅迫后可保持較高的光能轉(zhuǎn)化效率，抗寒性較強(qiáng)。

表5 低溫脅迫對(duì)不同中國(guó)南瓜材料葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.7 中國(guó)南瓜幼苗低溫脅迫下生理指標(biāo)之間的相關(guān)性

低溫脅迫7 d 時(shí)，葉片表型受害明顯，4 份中國(guó)南瓜材料的多個(gè)指標(biāo)與同時(shí)期常溫對(duì)照差異達(dá)顯著水平，且葉綠素?zé)晒鈪?shù)未測(cè)定第10 天數(shù)據(jù)，故挑選低溫脅迫后第7 天測(cè)定的生理生化指標(biāo)進(jìn)行脅迫耐受性指標(biāo)的相關(guān)性分析。由表6 可知，胞間CO濃度與蒸騰速率呈極顯著正相關(guān)，與Fv/F呈極顯著負(fù)相關(guān)；Fv/F與蒸騰速率呈顯著負(fù)相關(guān)，與Fv/Fm 呈顯著正相關(guān)；Fv/Fm 與氣孔導(dǎo)度呈顯著負(fù)相關(guān)；凈光合速率與葉綠素含量和可溶性糖含量分別呈顯著正相關(guān)和極顯著正相關(guān)；可溶性糖含量和葉綠素含量呈顯著正相關(guān)。以上結(jié)果表明，蒸騰速率和胞間CO濃度與大部分指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，起到負(fù)面作用，其值越高，種質(zhì)的耐低溫性越差；凈光合速率、可溶性糖含量、葉綠素含量、Fv/F和Fv/Fm 等對(duì)種質(zhì)的耐低溫性起到正向作用，其值越高，耐低溫性越強(qiáng)。

表6 中國(guó)南瓜幼苗低溫脅迫耐受性指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與植物的耐低溫性密不可分。植物體內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)包括可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸等有機(jī)溶質(zhì)以及Ca、K、Mg等無機(jī)離子。植株遭受低溫脅迫時(shí)，通過主動(dòng)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，提高細(xì)胞液的濃度來降低細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的可能性，增強(qiáng)植株的抗寒性（頡建明等，2009）。研究表明，植物在受到低溫脅迫后，耐低溫性強(qiáng)的品種較冷敏感品種會(huì)積累更多的可溶性糖和可溶性蛋白（許娟 等，2016；王玉賢 等，2021）?？扇苄蕴?，例如葡萄糖、果糖和蔗糖，在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物代謝過程中起著重要作用。一方面，作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，并為植物提供營(yíng)養(yǎng)；另一方面，作為代謝信號(hào)分子激活下游基因的表達(dá)（Lu et al.，2020）。本試驗(yàn)中，耐低溫種質(zhì)在低溫脅迫后，可溶性糖含量的增加幅度明顯高于低溫敏感種質(zhì)，表明增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是提高中國(guó)南瓜種質(zhì)耐低溫性的重要途徑。同時(shí)，隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，4 份材料的可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)先增加后降低再增加的變化趨勢(shì)，但不同耐低溫性種質(zhì)之間無明顯差異，表明中國(guó)南瓜在低溫脅迫后，合成的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)種類可能存在多樣性。經(jīng)相關(guān)性分析，在低溫脅迫7 d 時(shí)，可溶性糖含量與凈光合速率和葉綠素含量呈極顯著或顯著正相關(guān)，表明可溶性糖含量的增加對(duì)穩(wěn)定葉綠素含量及光合作用具有重要作用。因此，可溶性糖含量、葉綠素含量和凈光合速率可以作為中國(guó)南瓜種質(zhì)耐低溫性鑒定的可靠指標(biāo)。

低溫脅迫下，植物被抑制的第一個(gè)代謝過程就是光合作用，光合器官的結(jié)構(gòu)、光合作用相關(guān)的酶、光合電子傳遞以及碳同化過程都會(huì)受到影響（宋靜爽 等，2019）。許多研究結(jié)果均表明，低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致植物葉綠素等光合色素含量的降低，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO濃度等光合參數(shù)以及Fv/Fm 和Fv/F葉綠素?zé)晒鈪?shù)的下降（余叔文，1992；劉建 等，2009；徐曉昀 等，2016）。而低溫脅迫后保持較高水平的光合作用有助于提高植物的耐寒性（Chen et al.，2015）。本試驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致（Farquhar &Sharkey，1982；周艷虹 等，2004；劉慧英 等，2007；郝平安 等，2018；段青青 等，2020；劉會(huì)芳 等，2020）。在本試驗(yàn)中，低溫脅迫后，4 份中國(guó)南瓜材料的幼苗葉片葉綠素含量均呈下降趨勢(shì)，葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（Tr）均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，而胞間CO濃度（Ci）呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，由此說明光合速率的下降主要是由非氣孔因素引起的，較高的葉綠素含量是保持較高光合速率的重要因素。低溫脅迫后，4 份材料的Fv/Fm 和Fv/F值均顯著下降，耐低溫種質(zhì)的Fv/Fm 和Fv/F值均高于低溫敏感種質(zhì)，表明耐低溫種質(zhì)在低溫脅迫后受到的傷害較輕，其PSⅡ仍能保持較大的光化學(xué)效率和較高的潛在活性。

低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致活性氧（ROS）的過量產(chǎn)生，因ROS 對(duì)細(xì)胞具有毒害作用，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育（王芳 等，2019）。耐低溫性強(qiáng)的植物，可以通過大幅增加抗氧化酶或抗氧化劑的含量或活性，提高清除細(xì)胞內(nèi)自由基的效率，來避免或減輕低溫對(duì)細(xì)胞的傷害（姚遠(yuǎn) 等，2010；趙春梅 等，2014；李鳳梅 等，2019）。本試驗(yàn)中未進(jìn)行抗氧化酶等生理指標(biāo)的測(cè)定，N1 和N2 之所以耐低溫性較強(qiáng)，是否與氧化還原途徑相關(guān)，還有待于進(jìn)一步深入研究。

低溫脅迫下，耐低溫性不同的4 份中國(guó)南瓜種質(zhì)在生理響應(yīng)方面存在顯著的差異，耐低溫性強(qiáng)的材料可以通過大幅提高細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性糖），更好地維持葉片葉綠素含量，保持較高的光能轉(zhuǎn)化效率，減輕對(duì)PSⅡ的傷害，進(jìn)而維持較高的光合作用能力，來提高植株的耐寒性。