結(jié)球甘藍(lán)一年兩代繁殖技術(shù)及其在雄性不育轉(zhuǎn)育中的應(yīng)用

王冬梅 高曉旭 徐景秀 賈 俊

（1 北京華耐農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司研究中心，北京 102200；2 北京市密云區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 101500）

結(jié)球甘藍(lán)（L.var.L.）簡稱甘藍(lán)，是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種中能形成葉球的一個變種，頂芽成球，生長周期短，產(chǎn)量高，質(zhì)地脆嫩，營養(yǎng)豐富，耐貯運(yùn)，在我國種植非常廣泛。甘藍(lán)為兩年生草本植物，需經(jīng)冬季2～3 個月的綠體低溫春化才能開花結(jié)實(shí)，繁殖1 代至少需要1 年的時間，育種周期長，一個品種的育成一般需要10 年以上，對甘藍(lán)種業(yè)發(fā)展極為不利。由于甘藍(lán)的胞質(zhì)不育轉(zhuǎn)育簡單，不育性容易保持，故此項(xiàng)技術(shù)在甘藍(lán)雄性不育系的轉(zhuǎn)育上得到廣泛應(yīng)用（季家磊 等，2016），育成了多個優(yōu)良甘藍(lán)品種（方智遠(yuǎn) 等，2003；莊木 等，2010；楊麗梅 等，2011）。純合的高代自交系材料轉(zhuǎn)育成雄性不育系又需6～8年的時間，致使甘藍(lán)品種的育成時間幾乎增加了一倍（Perez-Prat &van Lookeren Campagne，2002），時間過長，亟待尋找可以縮短育種時間的方法。前人對蕓薹屬植物通過春化階段所需要的植株?duì)I養(yǎng)體大小、光照、溫度以及感應(yīng)低溫的時間已有了較明確的研究結(jié)果（日本農(nóng)山漁村文化協(xié)會，1985；許蕊仙，1986；張雪梅和許蕊仙，1989；余陽俊 等，2007），但是缺少綜合考慮甘藍(lán)世代繁殖所需要的條件，獲得甘藍(lán)世代繁殖所需最短時間的研究。本試驗(yàn)將甘藍(lán)世代繁殖分為3 個主要階段：綠體階段（發(fā)芽到植株生長到合適大?。⒋夯介_花階段（進(jìn)入春化室到授粉）、成苗階段（授粉到種子發(fā)芽）。探尋每個階段所需要的最短時間，以期獲得一種可以實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)一年繁殖兩代的方法，縮短甘藍(lán)的育種周期。由于整個繁殖世代的甘藍(lán)植株均處于幼苗期，不能進(jìn)行成株期的性狀選擇，因此利用SSR 引物在甘藍(lán)幼苗期進(jìn)行背景選擇（劉基生 等，2014；于海龍，2015），獲取遺傳背景更接近保持系的不育系，作為下一個世代的回交母本。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在北京華耐農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司研究中心昌平基地進(jìn)行，參試甘藍(lán)材料亦由該公司提供，4份高代自交系G158、G694、G639、G680；G158胞質(zhì)不育的BC單株15 株，編號G158MS-1～G158MS-15；G639 胞質(zhì)不育的BC單株9 株，編號G639MS-1～G639MS-9。其中G158 和G694 耐抽薹性弱，G639 耐抽薹性中等，G680 耐抽薹性強(qiáng)。

1.2 試驗(yàn)方法

以種子成苗為節(jié)點(diǎn)，一年分為兩個周期：夏秋周期，6—11 月；冬春周期，12 月至翌年5 月。對可縮短生殖周期的2 個關(guān)鍵因素，即授粉到種子發(fā)芽時間、春化+開花時間進(jìn)行篩選試驗(yàn)。

1.2.1 篩選適宜的胚珠剝?nèi)r間 為了縮短種子成熟所用的時間，在種莢中的種子成熟之前，剝?nèi)∨咧橹糜阡佊袦缇鸀V紙（使用無菌水噴濕）的培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中催芽，溫度控制在25 ℃，光照16 h/黑暗8 h，噴灑無菌水保濕；待子葉展開，根系長度為1.5 cm 左右時，移栽到基質(zhì)中。2020年5 月（冬春周期）選擇4 份材料G158、G694、G639、G680，剝?nèi)∨咧闀r間分別為蕾期人工授粉后30、35、40、45、50 d；2020 年11 月中旬（夏秋周期）選擇2 份材料G158、G639，剝?nèi)∨咧闀r間分別為蕾期人工授粉后45、50 d。不設(shè)重復(fù)，冬春周期每份材料剝?nèi)∨咧?0～66 個，夏秋周期每份材料剝?nèi)∨咧?00 個。調(diào)查記錄發(fā)芽數(shù)、授粉至成苗天數(shù)、幼苗生長情況等，計(jì)算發(fā)芽率。

1.2.2 篩選適宜的植株大小和春化時間 夏秋周期，以耐抽薹性不同的G158、G639、G680 為試材，植株大小設(shè)置2 個水平：7～9 片真葉的小苗和13～15 片真葉的大苗。春化時間設(shè)置3 個梯度：50、60、70 d。不設(shè)重復(fù)，每處理10 株。2020 年7月中旬放入春化室，最低春化溫度為7 ℃，紅藍(lán)光比例為3∶1 的LED 燈24 h 光照；春化完成后定植于溫室，前期為了降溫，防止脫春化，溫室溫度白天控制在25 ℃左右，夜間15 ℃左右，并利用日光燈補(bǔ)充光照；10 月中下旬授粉結(jié)籽后，為了保溫，在溫室中搭建拱棚并覆蓋保溫被。

冬春周期，以G158、G639 為試材，植株大小為7～9 片真葉的小苗，春化時間設(shè)置5 個梯度：50、55、60、65、70 d；不設(shè)重復(fù)，每處理10 株。2021 年1 月中旬放入春化室，最低春化溫度為4℃，紅藍(lán)光比例為3∶1 的LED 燈24 h 光照；春化完成后定植于大棚，正常水肥管理。

調(diào)查記錄抽薹開花株數(shù)、抽薹開花天數(shù)、植株生長情況等，計(jì)算抽薹開花率、春化+開花天數(shù)。

1.2.3 利用SSR 標(biāo)記選擇回交后代 參試材料 為G158 胞質(zhì)不育的BC單株G158MS-1～G158MS-15，以G158 的相應(yīng)保持系作為對照；G639 胞質(zhì)不育的BC單 株G639MS-1～G639MS-9，以G639 的相應(yīng)保持系作為對照。分別取植株的幼嫩葉片，采用改良CTAB 法（Yan et al.，2008）提取DNA，-20 ℃保存。

選用均勻分布在甘藍(lán)9 條染色體上的擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、擴(kuò)增差異明顯、多態(tài)性好的27 對EST-SSR 引物，包括NT/Y 2473—2013《結(jié)球甘藍(lán)品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR 分子標(biāo)記法》公布的20對甘藍(lán)核心引物，劉基生等（2014）公布的7 對EST-SSR 引物，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系10 μL，包含DNA模 板4 μL，10× PCR Buffer（含MgCl）1 μL，10 μmol·L上、下游引物各0.4 μL，dNTP（10 μmol·L）0.2 μL，DNA 聚合酶0.1 μL，ddHO 3.9 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，32 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，快速銀染法染色后拍照。

確定每對引物在24 個不育系單株和2 個保持系中擴(kuò)增的等位變異數(shù)，統(tǒng)計(jì)每份樣品等位變異的有無，有記為“1”，無記為“0”，建立數(shù)據(jù)庫。利用NTSYSPC 2.10e 軟件，計(jì)算保持系與不育系之間的親緣關(guān)系，采用非加權(quán)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同胚珠剝?nèi)r間對甘藍(lán)成苗的影響

2.1.1 冬春周期 從表1 可以看出，隨著授粉至剝?nèi)∨咧樘鞌?shù)的增加，4 份甘藍(lán)材料的發(fā)芽率均呈增加趨勢；但不同材料的胚珠適宜剝?nèi)r間有一定差異，G158 授粉后40 d 的胚珠發(fā)芽率達(dá)到72.73%，G694 授粉后45 d 的胚珠發(fā)芽率為70.00%，而G639 和G680 授粉后50 d 的胚珠發(fā)芽率才超過60%。授粉后30～35 d 的胚珠軟嫩，幼胚很小，未發(fā)育完全，基本不出芽，胚珠很快就褐化死亡，極個別成苗也發(fā)育畸形；授粉后45～50 d 的胚珠成苗大部分正常，授粉至成苗時間為50～57 d。表明，冬春周期剝?nèi)∨咧榈淖罴褧r間為授粉后45～50 d。

表1 冬春周期不同胚珠剝?nèi)r間對甘藍(lán)發(fā)芽率及成苗情況的影響

2.1.2 夏秋周期 此周期種子成熟時溫度較低，胚珠發(fā)育需要較長時間，G639 授粉后45 d 的胚珠發(fā)芽率較低，幼苗長勢慢，部分畸形；G158 授粉后45 d 的胚珠發(fā)芽率雖然達(dá)到60.00%，但也明顯低于冬春周期，幼苗長勢慢（表2）。表明，夏秋周期剝?nèi)∨咧榈淖罴褧r間為授粉后50 d，幼苗發(fā)育正常，授粉至成苗時間為56～58 d。

表2 夏秋周期不同胚珠剝?nèi)r間對甘藍(lán)發(fā)芽率及成苗情況的影響

2.2 不同植株大小和春化時間對甘藍(lán)開花的影響

2.2.1 春化植株大小 從表3 可以看出，春化時間為50 d 時，由于春化時間較短，G158 兩種大小的幼苗都表現(xiàn)為春化不完全，前期死蕾，抽薹開花時間長；而G639、G680 未通過春化。春化時間為60 d 時，G158 兩種大小的幼苗都通過了春化，且抽薹開花天數(shù)相近；G639 大苗開花情況較小苗好，但是都可以正常授粉得到種子，抽薹開花天數(shù)接近；G680 基本未通過春化。春化時間為70 d 時，G158和G639 兩種大小的幼苗都通過了春化，抽薹開花時間較春化60 d 處理縮短了4～6 d；而G680 兩種大小的幼苗都表現(xiàn)為春化不完全。總體上講，營養(yǎng)體較大的植株并未明顯縮短春化時間，并且所需抽薹開花天數(shù)也與小苗接近，而7～9 片真葉小苗營養(yǎng)體生長需要40 d 左右，13～15 片真葉大苗營養(yǎng)體生長需要50 d 左右，所以在以縮短生殖周期為目標(biāo)的宗旨下，宜選擇7～9 片真葉的小苗進(jìn)行春化。

2.2.2 夏秋周期的春化時間 從表3 還可以看出，3 種不同耐抽薹類型的甘藍(lán)材料存在一個共同的特點(diǎn)：春化的天數(shù)越短，抽薹開花所需要的天數(shù)越長，而春化+開花的總天數(shù)相差不大，但是春化時間短，正常抽薹開花率低，所以在保證正常抽薹開花總時間最短的情況下，應(yīng)選擇春化時間較長的組合。G158 小苗的最佳春化時間為60 d，春化+開花天數(shù)為90 d；G639 小苗的最佳春化時間亦為60 d，雖然抽薹枝條少，但可以正常授粉結(jié)籽，春化 +開花天數(shù)為92 d；而G680 由于冬性強(qiáng)，春化時間50、60 d 處理的小苗均未通過春化，春化60 d 處理的大苗僅1 株頂端開了幾朵花，春化時間延長到70 d 時，小苗30%抽薹，但開花少，死蕾嚴(yán)重，大苗80%抽薹，但是枝條少，死蕾嚴(yán)重，所以后期試驗(yàn)中剔除了G680。

表3 夏秋周期不同植株大小與春化時間對甘藍(lán)開花的影響

2.2.3 冬春周期的春化時間 本周期甘藍(lán)材料的開花時間集中在春季的4 月，相同的春化時間條件下抽薹開花時間較秋季短，所以春化+開花的總時長較秋季短，G158 最佳春化時間為55 d，抽薹開花率達(dá)到80%，春化+開花天數(shù)為80 d；G639 最佳春化時間為60 d，抽薹開花率70%，可以正常開花授粉，春化+開花天數(shù)為85 d（表4）。

表4 冬春周期不同春化時間對甘藍(lán)開花的影響

2.3 甘藍(lán)一年繁殖兩代所需時長

由于秋季在綠體階段進(jìn)行了加溫和補(bǔ)光處理，所以兩個周期中綠體生長所需時間無明顯差別。統(tǒng)計(jì)不同甘藍(lán)材料一年繁殖兩代需要的時長可知（表5），G158 夏秋周期完成世代需要186 d，冬春周期需要170 d，總計(jì)356 d，可以實(shí)現(xiàn)一年繁殖兩代；G639 夏秋周期完成世代需要190 d，冬春周期需要181 d，總計(jì)371 d，略長于1 年的時間，原因是G639 所需的春化時間和種子成熟時間都比較長。

表5 不同甘藍(lán)材料不同周期繁殖所需時間

2.4 利用SSR 標(biāo)記選擇回交后代

27 對SSR 多態(tài)性引物在24 個不育系單株和2個保持系中共擴(kuò)增得到63 個等位變異，每對引物產(chǎn)生2～5 個。27 對引物的多態(tài)性信息含量變化范圍為0.23～0.57，具有較好的鑒別能力，圖1 為部分引物的PCR 擴(kuò)增結(jié)果。

圖1 部分引物對甘藍(lán)不育系的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

由圖2 可知，26 份材料被明顯分為兩個類群，類群Ⅰ中，G158MS-3 和G158MS-8 與G158 相應(yīng)保持系的親緣關(guān)系最近；類群Ⅱ中，G639MS-6 和G639MS-7 與G639 相應(yīng)保持系的親緣關(guān)系較近。所以，下一世代中可采用G158MS-3、G158MS-8 和G639MS-6、G639MS-7作為各自保持系的回交母本。

圖2 甘藍(lán)不育系與回交父本的聚類結(jié)果

3 討論與結(jié)論

甘藍(lán)通過春化的最適溫度為0～4 ℃，通過春化的時間因品種耐抽薹性不同而差異較大，一般為40～90 d，幼苗越大通過春化的時間越短（李文平，2010；王鳳嬌 等，2012）。本試驗(yàn)中進(jìn)行春化的溫度是4～7 ℃，并采用紅藍(lán)光比例為3∶1 的LED燈24 h 補(bǔ)光，除冬性強(qiáng)的甘藍(lán)材料外，基本都能在60 d 之內(nèi)通過春化；春化時間對甘藍(lán)抽薹開花的影響要大于幼苗大小的影響，可能是因?yàn)樵诖夯^程中進(jìn)行了補(bǔ)光處理，幼苗處于持續(xù)生長的狀態(tài)，部分抵消了幼苗大小的影響程度。

為了縮短種子成熟所需要的時間，本試驗(yàn)借鑒了胚挽救的方法。前人研究多將胚挽救應(yīng)用于遠(yuǎn)緣雜交獲得種間雜交種中（Zhang et al.，2004；Wen et al.，2008，于海龍，2015）；并且在遠(yuǎn)緣雜交中，為了趕在胚珠敗育之前進(jìn)行胚挽救，通常剝?nèi)∨咧榈臅r間都比較早，一般在授粉后10～15 d，10 d 后有胚萌發(fā)，但成活率非常低（于海龍，2015；姜嬌，2018）。此類試驗(yàn)中的胚挽救從萌發(fā)到成苗需要經(jīng)過愈傷階段，而從剝?nèi)∨咧榈匠擅缢枰臅r間未見報道。本試驗(yàn)所用材料非遠(yuǎn)緣雜交，胚珠在子房中不會敗育，為了提高胚珠的成活率，延長了取胚的時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)授粉后35 d 之前剝?nèi)〉呐咧槌苫盥屎艿?，絕大部分?jǐn)∮劳?，結(jié)合胚珠發(fā)芽率和縮短成苗時間兩項(xiàng)因素，最終確定合適的胚珠剝?nèi)r間為授粉后45～50 d。

應(yīng)用本試驗(yàn)方法，冬性不是很強(qiáng)的甘藍(lán)材料基本上可以實(shí)現(xiàn)1 年繁殖2 代，但是對于冬性強(qiáng)的甘藍(lán)材料還需要進(jìn)一步探索可以縮短時間的步驟，比如采用更低的春化溫度、使用生長激素等來縮短春化時間，采用增加光照強(qiáng)度、延長光照時間等來縮短抽薹開花時間，采用更好的辦法縮短種子成熟所需的時間等。由于整個試驗(yàn)過程中甘藍(lán)植株均處于幼苗期，不能進(jìn)行成株期的性狀選擇，所以本試驗(yàn)方法僅適用于甘藍(lán)雄性不育轉(zhuǎn)育，利用SSR 標(biāo)記選擇時有明確的選擇方向，并不適用于一般材料的分離純化。如果有條件，可以通過增加標(biāo)記甚至采取測序的方法對幼苗進(jìn)行篩選，對某些需要加快純化的材料進(jìn)行幼苗期的選擇，獲得所需要的特定材料。