EFHD2蛋白的缺失對小鼠Sertoli細胞緊密連接蛋白的影響

葉曉林，胥國麟，錢體軍，秦 鳳，王云濤，程煜航，趙文珍

EFHD2屬于EF-手域家族成員，是一個26.8 ku大小的高度保守的蛋白質(zhì),由一個低復(fù)雜性的帶有丙氨酸延伸的N-末端區(qū)域、一個功能性SH3結(jié)合基序、兩個功能性EF-手結(jié)構(gòu)域和一個C-末端螺旋結(jié)構(gòu)域組成。研究顯示其功能為一種調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)節(jié)肌動蛋白構(gòu)成細胞骨架，參與成核作用，同時調(diào)節(jié)細胞的擴散和遷移[1-2]，還參與內(nèi)吞和囊泡運輸[3-4]。目前EFHD2在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤細胞遷移方面的研究較多，主要是涉及信號傳導(dǎo)及細胞骨架蛋白相關(guān)。推測EFHD2能夠調(diào)節(jié)肌動蛋白的捆綁影響細胞骨架，參與的細胞內(nèi)吞和囊泡運輸為Sertoli細胞的細胞連接的清除和形成提供協(xié)助。該研究主要探討EFHD2蛋白的缺失對Sertoli細胞連接蛋白成分的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器熒光顯微鏡(BX53,日本奧林巴斯公司)，Bio-Rad成像系統(tǒng)(Bio-Rad XR，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司)，實時熒光定量PCR儀(Stepone Plus, 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，伯樂垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀電源1645050、小型垂直電泳轉(zhuǎn)印槽,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司)。

1.2 主要試劑艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司：Anti-EFHD2抗體(ab106667)，Anti-Vimentin抗體(ab8978)，Anti-Occludin抗體(ab167161)，辣根過氧化物酶標記(HRP)的山羊抗兔IgG二抗(ab6728)，Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG (ab150113)，Alexa Fluor594標記的山羊抗鼠IgG(ab150116)。Biosharp蘭杰柯科技有限公司：PBS緩沖液(BL601A)、TBS緩沖液(BL602A)。翌圣生物科技(上海)股份有限公司：Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(11202ES08)、Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(11139ES10)、碘化丙啶(40711ES10)。TRIzol試劑(15596026)、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國賽默飛世爾科技公司)。RIPA組織裂解液(P0013B，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。Anti-β-actin抗體(#4970, 賽信通上海生物試劑有限公司)。

1.3 實驗動物及細胞15只 SPF 級c57雄鼠，10周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自大理大學(xué)實驗動物中心。于溫度 22～26 ℃、濕度 40%～60%環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。TM4細胞即正常小鼠Sertoli細胞，獲贈于上海交通大學(xué)劉悅老師。

1.4 方法

1.4.1引物設(shè)計 運用Oligo 7軟件設(shè)計qRT-PCR所需引物，引物序列見表1。EFHD2的siRNA由生工生物工程(上海)股份有限公司代設(shè)計，序列見表2，并且引物也一并由該公司合成。

表1 qRT-PCR涉及引物序列

表2 siRNA干擾序列

1.4.2qRT-PCR檢測EFHD2在各器官組織中mRNA水平的表達 分別取5只小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸等組織，用手持均質(zhì)器研磨組織，采用TRIzol法提取各組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并對產(chǎn)物cDNA在實時熒光定量PCR儀上進行定量擴增，每種組織為EFHD2及內(nèi)參β-actin各重復(fù)3次。并對qPCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。用2-ΔΔCT法分析實驗數(shù)據(jù)，計算mRNA表達水平。

1.4.3Western blot 法檢測EFHD2在各組織中的蛋白表達水平 分別取5只小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸、卵巢等組織，各取50 mg加入1 ml RIPA裂解液，用玻璃研磨器研磨組織，抽提蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、5%BSA封閉2 h，孵育一抗(1 ∶1 000，4 ℃過夜)，TBST洗膜10 min/次，重復(fù)3次，孵育二抗(1 ∶20 000，室溫1 h)，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光，Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照。使用Image J進行灰度分析，對灰度值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4.4免疫酶檢測EFHD2在睪丸組織的表達 取5只小鼠睪丸組織經(jīng)Bouin’s液固定、石蠟包埋、切片、抗原修復(fù)、0.1% Triton X-100打孔、5%BSA封閉、一抗(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶1 000)孵育1 h，DAB試劑顯色，蘇木精復(fù)染，光鏡觀察EFHD2在睪丸中的定位和分布情況，并且拍照。

1.4.5間接免疫熒光檢測EFHD2在睪丸組織中與Vimentin共定位情況 取新鮮睪丸組織進行冰凍切片。丙酮固定15 min，0.5% Triton X-100打孔，5% BSA封閉，一部分切片一抗(1 ∶500)4 ℃過夜。二抗(1 ∶1 000)孵育2 h，PI染色熒光顯微鏡下觀察該蛋白在睪丸組織中的分布并且拍照。另一部分切片進行Anti-EFHD2抗體和Anti-Vimentin抗體雙染色，鏡下觀察EFHD2和Vimentin共定位情況。

1.4.6脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法遞送siRNA進入TM4細胞 TM4細胞接種于6孔板。設(shè)置5個組，空白對照組、陰性對照組、3個干擾序列組。待細胞融合度到40%時，使用LipofectamineTM2000試劑轉(zhuǎn)染siRNA，siRNA終濃度為30 nmol/L。轉(zhuǎn)染24 h時，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。48 h時使用RIPA裂解液提取蛋白。

1.4.7qRT-PCR檢測干擾后各組EFHD2相對表達量 提取各組細胞的總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，接著進行qPCR。隨后，運用2-ΔΔCT法分析實驗數(shù)據(jù)，計算mRNA表達水平。

1.4.8Western blot 檢測siRNA干擾TM4細胞48 h的EFHD2和Occludin的相對表達量 提取后的細胞蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、5%BSA封閉2 h，孵育一抗(1 ∶1 000，4 ℃過夜)，TBST洗膜10 min/次，重復(fù)3次，孵育二抗(1 ∶20 000，室溫1 h)， ECL化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光，Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照。用Image J進行灰度分析，對灰度值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1EFHD2在各器官組織中相對表達量結(jié)果顯示：EFHD2在小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦和睪丸等器官組織中均有不同程度的表達，肝和腦中表達量較其他組織高，在睪丸中最高(圖1A)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對qPCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果說明qPCR擴增具有特異性(圖1B)。

圖1 小鼠各組織中EFHD2的相對表達量(A)與qPCR后電泳結(jié)果(B)a:心；b:肝；c:脾；d:肺；e:腎；f:腦；g:睪丸； EFHD2:100 bp；GAPDH:133 bp；與肝臟組織比較：***P<0.001

2.2 EFHD2蛋白在各器官組織中相對表達量實驗結(jié)果顯示：EFHD2蛋白在小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦和睪丸組織中均有表達，在肝臟、腦和睪丸組織中表達量較高(圖2)。

圖2 Western blot法檢測各器官組織中EFHD2蛋白的表達a:心；B:肝；C:脾；D:肺；E:腎；F:腦；G:睪丸；與肝組織比較：**P<0.01

2.3 免疫組化結(jié)果顯示EFHD2在Sertoli細胞中定位情況用免疫組化技術(shù)檢測EFHD2蛋白在睪丸組織中的分布情況，結(jié)果顯示：Sertoli細胞的胞質(zhì)周邊著色較深，而生精細胞和睪丸間質(zhì)細胞著色較淺。這表明EFHD2蛋白主要分布于Sertoli細胞(圖3)。

圖3 免疫酶技術(shù)檢測EFHD2在小鼠睪丸中的定位情況A、B：EFHD2在小鼠睪丸中的定位；C：不加一抗的對照組；A、C：×200；B：×400

2.4 EFHD2在睪丸組織中與Vimentin共定位情況對小鼠睪丸組織進一步進行間接免疫熒光檢測，結(jié)果和免疫酶標記的檢測結(jié)果一致，熒光在Sertoli細胞中著色較深，EFHD2蛋白主要分布于Sertoli細胞。此外，還采取了與Vimentin免疫熒光共定位檢測，結(jié)果顯示：EFHD2和Vimentin(Sertoli細胞特異性蛋白)在Sertoli細胞中熒光染色重疊，驗證EFHD2確實是在Sertoli細胞表達的(圖4)。

圖4 間接免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果a:EFHD2在小鼠睪丸中的表達情況 ×400；B:EFHD2和Vimentin在小鼠睪丸中共定位情況 ×400

2.5 siRNA干擾TM4細胞24 h后EFHD2的相對表達量在進行干擾后6 h，對攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的陰性對照序列進行轉(zhuǎn)染效率觀察(圖5)，可以觀察到已成功將siRNA轉(zhuǎn)染進TM4細胞。對qRT-PCR檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示(圖5B)，空白對照組和陰性對照組EFHD2相對表達量相近，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。mEFHD2-308與陰性對照組比較表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 siRNA轉(zhuǎn)染效率及各組EFHD2相對表達量 ×100a:空白對照組；B:陰性對照組；C:mEFHD2-731組；D: mEFHD2-474組；E:mEFHD2-308組；與陰性對照組比較：*P<0.05

2.6 siRNA干擾TM4細胞48 h后EFHD2和Occludin的相對表達量Western blot結(jié)果顯示(圖6)，mEFHD2-308的EFHD2蛋白表達量較其他組下將較明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)。進一步檢測緊密連接蛋白成分Occludin的相對表達量，空白對照組和陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；同樣是mEFHD2-308的下降較其他組明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)。

圖6 Western blot法檢測siRNA干擾48 h后各組EFHD2和Occludin的表達a:陰性對照組；B: mEFHD2-731組；C: mEFHD2-474組；D: mEFHD2-308組；E:空白對照組；與陰性對照組比較：****P<0.000 1

3 討論

Sertoli細胞與生精細胞有著各種細胞連接，通過各種細胞連接來調(diào)節(jié)生精細胞的各種狀態(tài)Sertoli細胞底部和基膜相連，構(gòu)成血睪屏障(blood-testis barrier，BTB)的一部分。BTB的完整為精子發(fā)生提供一個穩(wěn)定的微環(huán)境，血睪屏障的不完整將會影響精子的發(fā)生[5]。細胞連接中的緊密連接、錨定連接和橋粒連接是 BTB 的主要組成成分[6]。并且，細胞連接周期性的清除和形成是生精細胞向生精小管管腔運動的基礎(chǔ)[7]。細胞連接的清除可以讓生精細胞分裂和向管腔運動，細胞連接形成后，生精細胞接收Sertoli細胞提供的營養(yǎng)物質(zhì)進行物質(zhì)合成，為下個細胞周期做準備。Sertoli細胞的穩(wěn)態(tài)是正常生精的基礎(chǔ)。Sertoli細胞的細胞連接調(diào)控涉及多個方面。其中細胞骨架成分，如微絲、微管、中間絲及其相關(guān)的波形蛋白(Vimentin)等多種蛋白，可通過支持、黏附、信號傳導(dǎo)等方式促進和維持SC的連接結(jié)構(gòu)[8-9]。細胞連接結(jié)構(gòu)的清除和形成依賴支持細胞的內(nèi)吞和囊泡運輸，Sertoli細胞連接的清除和形成還依賴于細胞內(nèi)吞作用和囊泡運輸過程，如通過細胞內(nèi)吞作用清除細胞連接處的連接蛋白可破壞細胞連接結(jié)構(gòu)；而連接蛋白隨著囊泡運輸重新與細胞膜融合可在該處形成新的細胞連接。而內(nèi)吞和囊泡運輸需要細胞骨架蛋白的參與[10-11]。

緊密連接是構(gòu)成血睪屏障的主要結(jié)構(gòu)之一，而緊密連接有好幾種蛋白構(gòu)成，有Occludin、ZO-1、Claudin等成分[12]。研究[13]顯示，敲除Occludin的小鼠出現(xiàn)了不同程度的生精障礙。

結(jié)合Sertoli細胞連接需要周期性的清除和形成，來維持正常的生精過程。推測EFHD2參與Sertoli細胞連接的周期性清除和生成。EFHD2對Sertoli細胞內(nèi)肌動蛋白和骨架蛋白的調(diào)節(jié)，影響了Sertoli細胞的細胞連接的周期性開放，從而影響生精細胞的發(fā)育。EFHD2的正常存在對正常生精環(huán)境的維持起到了不可或缺的作用。因此本研究觀察EFHD2在睪丸中的表達和定位，實驗結(jié)果驗證了推測，EFHD2蛋白在睪丸中表達水平較一般組織要高，且定位在支持細胞(與Sertoli細胞特異性蛋白Vimentin定位一致)。接著成功地進行了TM4細胞的siRNA干擾，檢測Occludin蛋白和EFHD2蛋白一樣呈下降趨勢，驗證了在細胞層面，EFHD2和Occludin的合成是有關(guān)聯(lián)的。Occludin作為BTB和緊密連接的蛋白成分，BTB和緊密連接對精子的發(fā)生又十分的重要，那么Occludin在Sertoli細胞的表達減少將會影響精子的發(fā)生。本研究明確了EFHD2在小鼠睪丸中的定位及對細胞緊密連接蛋白Occludin形成的影響，闡明了EFHD2蛋白維持Sertoli細胞的穩(wěn)態(tài)起到了重要作用，為繼續(xù)研究EFHD2在睪丸中的作用奠定了基礎(chǔ)。