E3泛素連接酶FBXW7在食管鱗狀細胞癌中的表達及對其生物學行為的影響

何尚峰，盧香云，馬琰迪，孫 琦，高海霞，張洪攀，阿米爾，俞雪燕，禹 潔，王文潔，陳云昭，李 鋒,，崔曉賓,

食管癌(esophageal carcinoma，EC)在全球所有癌癥中發(fā)病率居第七位，病死率居第六位[1]，有兩種主要的組織學亞型(鱗狀細胞癌和腺癌)，其中食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國EC中的主要亞型，臨床表現(xiàn)為侵襲性且預后不良[2]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是介導真核生物蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵組分[3]，主要由3種蛋白質(zhì)組成：泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)，3種酶的共同協(xié)作，完成對底物蛋白的識別及泛素化降解[4]。F框/WD-40域蛋白7(F-box and WD-40 domain protein 7,FBXW7)作為E3泛素連接酶中RING家族的一員，參與降解多種已知的原癌蛋白，包括c-MYC、Cyclin E、NOTCH、MCL1、mTOR、c-JUN、AURKA，在多種癌癥中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮著重要作用[5]，而FBXW7在ESCC中的作用有待進一步研究。該研究旨在探究FBXW7在ESCC中的表達與生存預后的關(guān)系，以及FBXW7對ESCC細胞增殖、遷移和侵襲的生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 本實驗選取2000—2016 年間ESCC石蠟包埋組織樣本共224例。其中癌組織171例，距離ESCC組織3 cm以上部位的癌旁組織53例，患者術(shù)前均未接受過放療或化療。由兩名資深病理醫(yī)師根據(jù)WHO(2019)消化系統(tǒng)腫瘤分類對 HE 切片進行復片，并參照2017年UICC/AJCC 第8版食管癌TNM分期標準進行分期。所收集的病例均得到患者的同意并簽署知情同意書。并收集患者的個人資料、腫瘤分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及 TNM 分期等臨床病理資料，通過電話等對患者進行隨訪，截至2020年8月或死亡日期。

1.1.2細胞株 本實驗所用食管鱗癌細胞系Eca109和Eca9706均購買自上海復祥生物科技有限公司。

1.1.3試劑 FBXW7抗體(貨號：ab109617)購自英國Abcam公司；胎牛血清(foetal bovine serum,FBS)、PBS緩沖液購自以色列BI公司；青鏈霉素混合液(貨號：P1400)、4%組織細胞固定液(貨號：P1110)、0.1%結(jié)晶紫染色液(貨號：G1063)、5×蛋白上樣緩沖液(貨號：P1040)、1×TBST緩沖液(貨號：T1085)購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；FBXW7質(zhì)粒由蘇州吉瑪基因股份有限公司構(gòu)建；CCK-8 試劑盒(貨號：MI00615)、ECL發(fā)光液(貨號MI00607C)購自米鼠(西安)生物科技有限公司；基質(zhì)膠購自美國Corning公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒(貨號：PG112)、無蛋白快速封閉液(貨號：PS108P)購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；ENO1抗體(貨號：sc-100812)購自美國Santa公司；GAPDH抗體(貨號：AF0006)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根酶標記鼠二抗(貨號：ZB-2305)、辣根酶標記兔二抗(貨號：ZB-2301)：購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.4主要實驗儀器 細胞培養(yǎng)箱、超凈臺工作臺、-80 ℃冰箱(美國賽默飛世爾科技有限公司)；酶標儀(美國ABI公司)；光學倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；4 ℃冰箱(中國海爾集團公司)；ECL Western成像儀(北京百晶生物技術(shù)公司)；電泳儀、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-RAD 公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學染色及評估 使用 EnVision 兩步法進行免疫組化實驗，使用FBXW7抗體，調(diào)整抗體稀釋比例為1 ∶8 000。染色結(jié)果評分均由兩位高年資的病理醫(yī)師獨立雙盲法評定。FBXW7主要定位于細胞核中，以呈棕黃色顆粒為陽性。計分方法如下：①按細胞著色強度計分，無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分；②按腫瘤陽性細胞的百分比計分，<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；③將著色強度及陽性百分比兩項評分結(jié)果的得分相乘，最終得分≤3分為低表達，>3分為高表達。若對結(jié)果存在分歧則請第三位高年資的病理醫(yī)師評定。

1.2.2細胞培養(yǎng) 將Eca109和Eca9706細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達到80%進行換液及傳代處理，進行后續(xù)實驗。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的細胞消化計數(shù)，每孔計數(shù)50萬個細胞，培養(yǎng)過夜6～8 h后，每個EP管中加入100 μl RPMI-1640培養(yǎng)基，再分別加入7.5 μl Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑和2.5 μg FBXW7質(zhì)粒，將兩管混勻后靜置5～10 min，棄去6孔板中原有培養(yǎng)基，用PBS清洗2～3次，將混合液體均勻滴入每個孔中，4～6 h后進行換液，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h以供后續(xù)實驗使用。

1.2.4平板克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染細胞，消化離心后計數(shù)。以每孔1 000個細胞接種于6孔板中，每孔加入2 ml的培養(yǎng)液，鋪勻細胞后放入培養(yǎng)箱中，每隔3～4 d換液，培養(yǎng)10 d左右，當出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，使用PBS清洗2～3次，加入4%組織細胞固定液于4 ℃固定20 min，PBS清洗去除多余的組織細胞固定液，0.1%結(jié)晶紫染色液4 ℃染色，20 min后PBS再清洗2次。將培養(yǎng)板置于室溫晾干，在倒置顯微鏡下進行觀察，計數(shù)每組細胞克隆形成數(shù)。

1.2.5CCK-8實驗 取對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染細胞，消化離心后計數(shù)，在96孔板中每孔接種Eca9706細胞2 000個，Eca109細胞每孔接種1 000個，每組設置5個復孔，并在調(diào)零孔加入培養(yǎng)基，分別在0、24、48、72、96 h于避光條件下每孔加入10 μl CCK-8試劑,37 ℃孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm處吸光度值，重復檢測3次，取均值。

1.2.6細胞劃痕實驗 將細胞鋪于細胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染后的各組細胞培養(yǎng)24 h后，待細胞密度達到90%左右，用1 ml滅菌槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗滌兩次，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、48 h拍照。

1.2.7Transwell細胞遷移實驗 消化轉(zhuǎn)染24 h后的細胞，加入1 ml 1×PBS和RPMI-1640洗滌，用RPMI-1640重懸并計數(shù)，細胞密度調(diào)整為3×104個/ml，向上室加入200 μl細胞懸液，下室加入600 μl含20% 胎牛血清的培養(yǎng)基。避免上下室之間氣泡產(chǎn)生，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出。吸棄上、下室培養(yǎng)液，l×PBS清洗2遍，用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動，吸干水分并擦去膜內(nèi)側(cè)細胞。下室加入1 ml的4%組織細胞固定液4 ℃固定20 min，用棉簽擦拭上室內(nèi)部。棄去下室液體，并加入0.1%結(jié)晶紫染色液，4 ℃染色20 min，用PBS洗去結(jié)晶紫染色液，用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動，吸干上室水分。倒置顯微鏡上放置載玻片，將小室放在上面進行拍照。

1.2.8Transwell細胞侵襲實驗 侵襲實驗前需提前準備基質(zhì)膠，將-80 ℃分裝保存的基質(zhì)膠，于實驗前12 h、4 ℃融化，用無血清培養(yǎng)液RPMI-1640按照1 ∶8的比例稀釋，每孔加入45 μl(在冰上進行)，37 ℃孵育箱2 h使其凝固，吸棄多余液體，后續(xù)步驟同于遷移實驗。

1.2.9Western blot實驗 實驗前根據(jù)PAGE凝膠快速制備試劑盒說明書制備PAGE凝膠，將轉(zhuǎn)染48 h后的細胞用PBS清洗2～3次，蛋白提取全程在冰上進行，加入5×蛋白上樣緩沖液100 ℃煮沸10 min，電泳后采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，無蛋白快速封閉液封閉1 h，加入一抗孵育盒4 ℃過夜(FBXW7稀釋比例1 ∶1 000；ENO1稀釋比例1 ∶1 000；GAPDH稀釋比例1 ∶1 000)，1× TBST緩沖液清洗5 min×6次，加入二抗孵育盒室溫孵育2 h(辣根酶標記鼠二抗稀釋比例1 ∶8 000；辣根酶標記兔二抗稀釋比例為1 ∶10 000)，1×TBST清洗5 min×6次，使用ECL發(fā)光液顯色。

2 結(jié)果

2.1 FBXW7在ESCC組織及癌旁組織中蛋白表達水平FBXW7在ESCC組織及癌旁組織中均出現(xiàn)核膜的染色，但在核仁中的染色有顯著差異，在ESCC組織中的蛋白表達水平低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)。見圖1和表1。

表1 FBXW7在癌旁組織和ESCC組織中的蛋白表達水平(n)

圖1 癌旁組織與ESCC組織中FBXW7蛋白表達情況 A、B：癌旁組織免疫組織化學染色情況 ×40、×200；C、D：ESCC組織免疫組織化學染色情況 ×40、×200

2.2 FBXW7表達與臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)前期隨訪數(shù)據(jù)，將有臨床病理相關(guān)資料的73例ESCC患者根據(jù)免疫組化評分(immunohistochemical score，IS)進行分組，IS≤3分為低表達，IS>3分為高表達，表2統(tǒng)計結(jié)果顯示，F(xiàn)BXW7低表達的腫瘤分化程度更低(P=0.011)，F(xiàn)BXW7高表達的ESCC患者TNM分期更早(P=0.032)，且差異有統(tǒng)計學意義。而與患者的性別、年齡、部位、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移等臨床病理資料的關(guān)系差異無統(tǒng)計學意義。

表2 FBXW7的表達水平與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3 FBXW7與ESCC患者預后的關(guān)系在224例ESCC患者中，有63例患者通過電話隨訪、醫(yī)院記錄等方式獲得完整的隨訪信息，截止日期為2020年8月或死亡日期。通過Kaplan-Meier生存分析ESCC患者FBXW7蛋白表達水平與生存期及存活情況的關(guān)系，生存曲線結(jié)果顯示，F(xiàn)BXW7低表達組的生存時間短于FBXW7高表達患者，F(xiàn)BXW7低表達組的預后顯著差于FBXW7高表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.030)。見圖2。

圖2 FBXW7的表達與ESCC患者預后的生存分析曲線

2.4 FBXW7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染最佳比例Eca9706細胞系中，分別使用不同F(xiàn)BXW7質(zhì)粒 ∶Lipofectamine2000比例在6孔板中進行轉(zhuǎn)染，F(xiàn)BXW7質(zhì)粒加入2.5 μg，Lipofectamine2000分別加入0、5、7.5、10 μl，分為1 ∶0、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4的濃度梯度，轉(zhuǎn)染48 h后通過Western blot檢測FBXW7蛋白表達水平，結(jié)果顯示FBXW7質(zhì)粒 ∶Lipofectamine2000的比例為1 ∶2 或者1 ∶3時，過表達效果較好，Eca109細胞系中使用相同比例進行后續(xù)實驗。見圖3。

圖3 Western blot檢測Eca9706細胞系中不同比例轉(zhuǎn)染FBXW7質(zhì)粒后蛋白表達水平a：1 ∶0組；b：1 ∶2組；c：1 ∶3組；d：1 ∶4組

2.5 過表達FBXW7對ESCC細胞增殖能力的影響CCK-8實驗檢測顯示，接種細胞后第3天開始,在Eca9706和Eca109細胞中，過表達FBXW7組的吸光度值開始低于對照組，到達第5天時，Eca9706細胞系中，過表達FBXW7組吸光度值低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=172.100,P<0.001)，Eca109細胞系中，過表達FBXW7組吸光度值也低于對照組,且差異有統(tǒng)計學意義(t=241.101,P<0.001)(圖4)。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，Eca9706細胞中，過表達FBXW7組細胞集落數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.078，P<0.001)；Eca109細胞中，過表達FBXW7組細胞集落數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.160，P<0.001)，上述結(jié)果提示FBXW7 可以抑制ESCC細胞的增殖能力。見圖5。

圖4 CCK-8實驗檢測Eca9706和Eca109細胞的增殖能力a:Eca9706細胞；B:Eca109細胞；與對照組比較：***P<0.001

圖5 平板克隆形成實驗檢測Eca9706和Eca109細胞的增殖能力與對照組比較：***P<0.001

2.6 過表達FBXW7對ESCC細胞遷移、侵襲能力的影響細胞劃痕實驗顯示劃痕結(jié)束48 h后，Eca9706細胞系中，過表達FBXW7組的細胞遷移率低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=13.822，P<0.001)。Eca109細胞系中，過表達FBXW7組的細胞遷移率低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=14.015，P<0.001)(圖6)。Transwell細胞遷移、侵襲實驗分別于鋪完小室24、48 h后進行固定染色和拍照，結(jié)果顯示，在Eca9706細胞中，過表達FBXW7組的細胞遷移數(shù)目低于對照組的細胞遷移數(shù)目，差異有統(tǒng)計學意義(t=21.326，P<0.001)，過表達FBXW7組的細胞侵襲數(shù)目低于對照組的細胞侵襲數(shù)目，差異有統(tǒng)計學意義(t=25.959，P<0.001)。在Eca109細胞中，過表達FBXW7組的細胞遷移數(shù)目低于對照組的細胞遷移數(shù)目，差異有統(tǒng)計學意義(t=17.034，P<0.001)，過表達FBXW7組的細胞侵襲數(shù)目低于對照組的細胞侵襲數(shù)目，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.579，P<0.001)(圖7)。以上結(jié)果均表明FBXW7可以抑制ESCC細胞Eca9706和Eca109的遷移、侵襲。

圖6 細胞劃痕實驗檢測Eca9706和Eca109細胞的遷移能力A：Eca9706細胞中過表達FBXW7組與對照組劃痕實驗情況；B：Eca109細胞中過表達FBXW組與對照組劃痕實驗情況；與對照組比較：***P<0.001

圖7 Transwell細胞遷移、侵襲實驗檢測Eca9706和Eca109細胞的遷移、侵襲能力A：Eca9706細胞中過表達FBXW7組與對照組遷移侵襲情況；B：Eca109細胞中過表達FBXW7組與對照組遷移侵襲情況；與對照組比較：***P<0.001

3 討論

FBXW7作為E3泛素連接酶中的一員，通過促進多種癌蛋白的降解來發(fā)揮其腫瘤抑制作用[6]。其功能的發(fā)揮需要依賴SCF(SKP1/CUL1/F-box)復合體的形成，它包含一個CULLIN家族支架蛋白，該蛋白與具有催化活性的RING finger(RBX1)結(jié)合，RBX1可以招募E2泛素結(jié)合酶(UBC)和SKP1，后者與F-box相互作用，F(xiàn)-box蛋白作為底物識別亞單位發(fā)揮作用[7]。目前，F(xiàn)BXW7在ESCC中的表達及其對ESCC細胞生物學行為影響的相關(guān)研究尚不多見，有報導提出miR-25可以通過抑制FBXW7靶向NOTCH1，進而促進ESCC細胞的侵襲和遷移[8-9]，另外，miR-223也可以負向調(diào)控FBXW7，其高表達及FBXW7低表達與患者不良預后顯著相關(guān)[10]，部分文獻也報導FBXW7的低表達與患者不良預后呈正相關(guān)[11]，且與化療敏感性相關(guān)[12]。

本研究首先檢測了ESCC石蠟組織樣本與癌旁石蠟組織樣本中FBXW7的表達情況，結(jié)果顯示FBXW7在ESCC組織及癌旁組織中均有核膜的表達，ESCC組織中核仁的表達低于癌旁組織，文獻[5-6]提出FBXW7在多種腫瘤中作為抑癌基因降解癌蛋白，該作用大多是在核內(nèi)發(fā)生，這與本研究FBXW7在核仁中差異定位的結(jié)果相一致，而核膜中普遍的著色提示FBXW7在核膜的定位可能與其抑癌功能無關(guān)。結(jié)合ESCC患者的臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)相較于低分化患者，在中到高分化患者中FBXW7的表達明顯更高，此外，F(xiàn)BXW7表達水平還與ESCC患者TNM分期相關(guān)，并且在Ⅰ+Ⅱ期中表達更高。腫瘤的分化程度和病理學分期是目前用來評估腫瘤生物學行為和診斷的重要的指標，主要用于惡性腫瘤生物學行為和預后的評估，對ESCC患者的生存分析也表明，F(xiàn)BXW7高表達組患者的生存預后明顯優(yōu)于FBXW7低表達組，以上研究結(jié)果提示FBXW7在ESCC中可能發(fā)揮抑癌作用。為了進一步探究FBXW7對ESCC細胞生物學行為的影響，使用過表達的FBXW7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩株ESCC細胞系(Eca109和Eca9706)，CCK-8實驗以及平板克隆形成實驗結(jié)果提示，過表達FBXW7組的Eca109和Eca9706細胞增殖能力發(fā)生了顯著的下降，同時細胞劃痕實驗，Transwell細胞遷移、侵襲實驗結(jié)果也提示，過表達FBXW7組中，兩株ESCC細胞的遷移能力及侵襲能力也均出現(xiàn)明顯減弱。

綜上所述，F(xiàn)BXW7可能通過抑制ESCC細胞的增殖、侵襲、遷移的能力，進而影響ESCC的發(fā)展。結(jié)合既往文獻報導，推測FBXW7在ESCC中同樣是通過靶向降解某種癌蛋白，發(fā)揮其抑癌作用。