真核細(xì)胞翻譯起始復(fù)合物4F對(duì)HCC患者的預(yù)后價(jià)值

錢(qián)仁哲，周大臣，陸子恒，賀 良，潘樹(shù)波，張 彬

原發(fā)性肝癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，居全球惡性腫瘤病死率的第二位，而其中以肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)最為常見(jiàn)[1]。目前，手術(shù)切除是HCC最有效的治療手段，射頻消融、動(dòng)脈栓塞化療、放療及索拉非尼等靶向藥物治療也均可改善患者預(yù)后[2]，但是HCC患者的預(yù)后仍難以令人滿(mǎn)意。因此，尋找有效的起到預(yù)后監(jiān)測(cè)作用的分子標(biāo)志物有著重要意義。

真核細(xì)胞翻譯起始復(fù)合物4F(eukaryotic cell translation initiation complex 4F，EIF4F)調(diào)控基因包含了4EBP1、EIF4E、EIF4G等[3-4]。細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程依賴(lài)于一個(gè)復(fù)雜的大分子合成協(xié)調(diào)程序，該程序可以適應(yīng)環(huán)境的約束。在真核生物中，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路是這一過(guò)程的主要調(diào)控因子，部分通過(guò)控制EIF4F起始復(fù)合物來(lái)調(diào)節(jié)真核細(xì)胞mRNA的翻譯。本課題組前期研究顯示，在HCC細(xì)胞系中突變4EBP1的T37/46磷酸化位點(diǎn)，HCC細(xì)胞的增殖被顯著抑制，并推測(cè)其可能與HCC患者的臨床預(yù)后相關(guān)。該研究評(píng)估EIF4F復(fù)合物與HCC患者預(yù)后臨床之間的相關(guān)性，以期預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后生存期。

1 材料與方法

1.1 主要材料胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；一抗4EBP1、Phop(T37/46)-4EBP1、EIF4E,Phop(Ser209)-EIF4E、EIF4G購(gòu)自美國(guó)CST公司；山羊抗兔或抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1臨床數(shù)據(jù)的收集與分析 從標(biāo)本庫(kù)中篩選出符合納入條件的HCC患者組織，篩選時(shí)間為2000—2014年，制作組織芯片(tissue microarray,TMA)。其納入標(biāo)準(zhǔn)為：①病理明確診斷的HCC患者；②首次行手術(shù)治療的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①腫瘤復(fù)發(fā)患者；②術(shù)前有使用化療及靶向藥物的患者；③同時(shí)發(fā)生了其他部位癌變的腫瘤患者；④臨床病理資料不完整的腫瘤患者。TMA組織芯片記錄了患者入院以來(lái)的肝功能指標(biāo)、術(shù)后病理報(bào)道的腫瘤的大小及衛(wèi)星灶、出院之后的3年生存率和5年生存率及生存狀態(tài)等。該研究已通過(guò)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查(編號(hào)：20200863)。

1.2.2蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色 依次將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、二甲苯Ⅲ 10 min、無(wú)水乙醇Ⅰ 5 min、無(wú)水乙醇Ⅱ 5 min、90%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min、50%乙醇5 min梯度脫蠟。將石蠟切片放入蘇木精染液0.5～1 min，自來(lái)水漂洗，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水漂洗，然后1%氨水水溶液返藍(lán)1 min，流動(dòng)水沖洗數(shù)秒,放入伊紅染液中染色數(shù)秒，流動(dòng)水漂洗。石蠟切片依次放入75%乙醇2 min，85%乙醇2 min，無(wú)水乙醇Ⅰ 5 min，無(wú)水乙醇Ⅱ 5 min，二甲苯5 min透明，將切片從二甲苯中取出，中性樹(shù)脂封片。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry，IHC) 將組織芯片在60 ℃烘箱中烤片、脫蠟，然后依次將烤好的切片放入二甲苯Ⅰ 6 min，二甲苯Ⅱ 6 min，二甲苯與無(wú)水乙醇3 min，無(wú)水乙醇6 min，90%乙醇3 min，70%乙醇3 min，50%乙醇3 min，純水10 min梯度脫蠟；將芯片放入裝有枸櫞酸鈉緩沖液的染色槽內(nèi)，放入高壓鍋內(nèi)，裝水，蓋上蓋子，待上汽上到最大時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)20 min,關(guān)火放氣，取出染色槽，流動(dòng)水沖洗10 min；將組織芯片浸入30%過(guò)氧化氫與甲醇1 ∶9體積混合的混合液中10 min，以過(guò)氧化氫酶封閉，用PBS沖洗15 min；破膜液破膜10 min，PBS沖洗15 min；用1%牛血清白蛋白封閉2 h；組織芯片與第一抗體在4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜；室溫下依次加入反應(yīng)增強(qiáng)液20 min、辣根酶標(biāo)記抗兔IgG聚合物30 min，以DAB為顯色劑，蘇木精復(fù)染5 s，最后將切片放入50%乙醇3 min、70%乙醇3 min、90%乙醇3 min、無(wú)水乙醇6 min、二甲苯與無(wú)水乙醇3 min、二甲苯Ⅰ 6 min、二甲苯Ⅱ 6 min脫水，中性樹(shù)脂封片。使用Image J軟件分析吸光度值。

1.2.4隨訪 通過(guò)與患者或者患者親屬的聯(lián)系來(lái)保持對(duì)術(shù)后出院患者病情的追蹤，可以有效記錄術(shù)后患者的恢復(fù)情況及生存狀況。對(duì)本標(biāo)本庫(kù)中共743位iHCC患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行隨訪，具有隨訪信息的為94位。對(duì)于術(shù)后出院患者最長(zhǎng)的隨訪時(shí)間為14年，中位隨訪時(shí)間為48個(gè)月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 25軟件對(duì)患者的臨床特征與目標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis，K-W)分析。使用R4.0.5軟件對(duì)臨床數(shù)據(jù)和吸光度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組織芯片中各目標(biāo)基因的表達(dá)水平的相關(guān)性通過(guò)程序包PerformanceAnalytics進(jìn)行分析。繪制KM(Kaplan-Meier)生存曲線(xiàn)，并通過(guò)Cox回歸分析計(jì)算各影響因素的HR值。通過(guò)Nomogram評(píng)估各影響因素與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入患者的臨床特征在94例HCC患者的肝癌臨床信息中，將Phop(T37/46)-4EBP1與患者的臨床特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差齊性檢驗(yàn)提示數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，因此行非參數(shù)檢驗(yàn)。因2012年之前未行病理學(xué)微血管侵犯檢測(cè)，因此相關(guān)數(shù)據(jù)未納入本研究統(tǒng)計(jì)分析。見(jiàn)表1。

表1 4EBP1(T37/46)的激活狀態(tài)與HCC患者臨床特征關(guān)系分析

2.2 EIF4F復(fù)合物的調(diào)控基因免疫組化染色及其吸光度值在94例HCC患者的免疫組化染色結(jié)果中，EIF4F復(fù)合物的調(diào)控基因在腫瘤組織中的表達(dá)高于其在癌旁組織中的表達(dá)(P<0.05)；4EBP1、Phop(T37/46)-4EBP1、EIF4E、Phop(Ser209)-EIF4 E、EIF4G的柱狀圖提示腫瘤組織中的吸光度值高于其癌旁組織中的(P<0.001或P<0.000 1)。見(jiàn)圖1。

圖1 肝癌組織及癌旁組織中EIF4F復(fù)合物調(diào)控基因的表達(dá)及吸光度值分析 IHC ×400T：肝癌組織；N：癌旁組織；與癌旁組織比較：***P<0.001，****P<0.000 1

2.3 EIF4F復(fù)合物調(diào)控基因的蛋白表達(dá)量之間的相關(guān)性分析在94例HCC患者的肝癌組織中，對(duì)EIF4E、EIF4G、Phop(T37/46)-4EBP1的蛋白表達(dá)量進(jìn)行表達(dá)的相關(guān)性分析，EIF4E與EIF4G的表達(dá)量顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.51；Phop(T37/46)-4EBP1與EIF4E、EIF4G的相關(guān)系數(shù)分別為0.22、0.13。見(jiàn)圖2。

圖2 EIF4F復(fù)合物調(diào)控基因的蛋白表達(dá)量之間的相關(guān)性分析

2.4 Phop(T37/46)-4EBP1與患者生存率的相關(guān)性在94例HCC患者的肝癌組織中，Phop(T37/46)-4EBP1表達(dá)的生存曲線(xiàn)，Phop(T37/46)-4EBP1高表達(dá)組較非高表達(dá)組的患者預(yù)后生存時(shí)間短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038)。見(jiàn)圖3。

圖3 HCC患者的生存曲線(xiàn)分析

2.5 Phop(T37/46)-4EBP1的表達(dá)與HCC患者臨床特征的關(guān)系將94例HCC患者的指標(biāo)納入多因素回歸分析，分析Phop(T37/46)-4EBP1、EIF4E、EIF4G是否過(guò)表達(dá)，腫瘤數(shù)目、腫瘤大小、腫瘤的分化程度、患者的甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平高低對(duì)患者預(yù)后生存期的影響，在此基礎(chǔ)上做出Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型，在以上各種因素與HCC患者預(yù)后生存期之間的關(guān)系中，腫瘤數(shù)目與患者預(yù)后之間的相關(guān)性最顯著(P=0.035)。見(jiàn)圖4。

圖4 HCC患者的多因素回歸分析

2.6 列陣圖模型預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后生存時(shí)間情況以Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型為基礎(chǔ)，對(duì)各個(gè)危險(xiǎn)因素的風(fēng)險(xiǎn)比例分別給予評(píng)分，以各患者最終得分總和來(lái)預(yù)測(cè)3年生存率和5年生存率，可以看到Phop(T37/46)-4EBP1與EIF4E的評(píng)分是相對(duì)較高的，提示其對(duì)于HCC患者預(yù)后生存時(shí)間有著更大的意義。見(jiàn)圖5。

圖5 HCC納入患者臨床數(shù)據(jù)回歸分析的列陣圖模型

3 討論

4EBP1的磷酸化狀態(tài)與HCC患者的術(shù)后總體生存時(shí)間負(fù)相關(guān)，HCC組織中的4EBP1磷酸化水平增高，與患者預(yù)后生存時(shí)間顯著負(fù)相關(guān)(圖3)。EIF4E與EIF4G的表達(dá)是線(xiàn)性相關(guān)的；Phop(T37/46)-4EBP1與患者預(yù)后3年存活率、5年存活率、腫瘤直徑大小、AFP值呈線(xiàn)性相關(guān)，可以作為臨床重要的評(píng)估或參考指標(biāo)。

Phop(T37/46)-4EBP1是4EBP1的分子功能失活形式。4EBP1是mTOR信號(hào)通路的下游中介，mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[5]，通過(guò)磷酸化4EBP1和S6K促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，從而控制蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程。在相關(guān)性分析中可以看到，EIF4F復(fù)合物中的EIF4E和EIF4G之間是線(xiàn)性增加的，而Phop(T37/46)-4EBP1與其之間并沒(méi)有直接的相關(guān)性；單獨(dú)將Phop(T37/46)-4EBP1與患者預(yù)后3年存活率、5年存活率、腫瘤直徑大小、AFP等值做Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型回歸分析時(shí)，得出他們之間具有正相關(guān)的關(guān)系；列陣圖模型分析，由患者年齡、3年生存率、5年生存率、腫瘤直徑大小、AFP、EIF4F復(fù)合物等值共同評(píng)分，預(yù)測(cè)預(yù)后，Phop(T37/46)-4EBP1和EIF4E對(duì)于患者預(yù)后的評(píng)分所占權(quán)重較高，提示其對(duì)于HCC患者預(yù)后生存時(shí)間的影響可能較大。

有證據(jù)表明，mTOR下游4EBP1、EIF4E水平上的蛋白合成被破壞可以促進(jìn)腫瘤的形成[6-7]，Phop(T37/46)-4EBP1引導(dǎo)增殖致癌信號(hào)，是一個(gè)高度相關(guān)的惡性潛能分子標(biāo)記[8]。生長(zhǎng)因子受體和細(xì)胞信號(hào)通路在人類(lèi)癌癥的發(fā)生中起著重要的作用，膜生長(zhǎng)因子受體的激活通過(guò)至少兩種主要的生物化學(xué)途徑，PI3K-AKT-mTOR和RAS-MAPK途徑驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖信號(hào)[9]。PI3K-AKT通路通過(guò)激活mTOR激酶并隨后磷酸化其底物4EBP1和S6K來(lái)調(diào)控翻譯。MAPK通路，參與細(xì)胞增殖、存活、凋亡和代謝，也有助于4EBP1的磷酸化[10-11]。PI3K-AKT-mTOR和RAS-MAPK通路都介導(dǎo)了4EBP1的磷酸化，導(dǎo)致了Cap依賴(lài)的mRNA翻譯起始復(fù)合物的形成Phop(T37/46)-4EBP1抑制4EBP1的活性并伴隨Cap依賴(lài)翻譯的激活，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[12-13]。Phop(T37/46)-4EBP1是4EBP1的滅活形式，作為腫瘤啟動(dòng)子，將上游的致癌信號(hào)匯聚并驅(qū)動(dòng)下游的增殖信號(hào)，啟動(dòng)細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin-D1)、C-MYC或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等致癌蛋白的合成。Phop(T37/46)-4EBP1在乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌中已被證實(shí)與預(yù)后密切相關(guān)[14]，也有報(bào)道[15]指出Phop(T37/46)-4EBP1與許多惡性腫瘤(包括腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、星形細(xì)胞瘤、食道鱗狀細(xì)胞癌)的侵襲性病理分級(jí)與患者的不良預(yù)后相關(guān)，這對(duì)于惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要，Phop(T37/46)-4EBP1在這些腫瘤中的表達(dá)都提示了Phop(T37/46)-4EBP1在腫瘤的預(yù)后中起到了至關(guān)重要的作用。

該研究也有一定的局限性。標(biāo)本庫(kù)中的患者失訪率較高，最終納入分析的HCC患者臨床數(shù)據(jù)存在部分缺失。部分指標(biāo)的數(shù)據(jù)非正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。對(duì)于EIF4F在HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子生物學(xué)機(jī)制，本課題組仍在進(jìn)一步研究。