徐倩倩,張沛譽,陳 妮
據(jù)最新的全球癌癥統(tǒng)計報告,肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,僅2020年就有新增肺癌病例220萬例(占總病例的11.6%),死亡180萬例,占人類所有癌癥死亡人數(shù)的近五分之一,肺癌的低治愈率是當前面臨的重大難題[1]。據(jù)研究腫瘤細胞對博萊霉素(bleomycin,BLM)耐藥性的產生是導致治療失敗的重要原因[2-4],腫瘤細胞對BLM的耐藥主要表現(xiàn)在DNA損傷修復能力的增加。BLM被發(fā)現(xiàn)能誘導腫瘤細胞株G2/M期阻滯[5],而這可能與細胞在G2/M檢查點對DNA損傷的應答有關。另有研究表明,在BLM作用下腫瘤細胞內的抗氧化水平升高[6],這也可能是細胞產生抗性的另一大因素。
核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid related factor 2,Nrf2)是抗氧化應激反應的關鍵調節(jié)因子,在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)Nrf2通路的過度活化與腫瘤治療過程中的放化療抵抗有關[7]。目前Nrf2在放化療抵抗中的相關研究主要聚焦在氧化應激方面,而在參與DNA損傷應答方面的研究仍較少。該研究中,以人肺癌細胞系A549和H1299為對象,探究抗氧化轉錄因子Nrf2對BLM誘導的DNA損傷水平及DNA損傷修復的影響。
1.1 實驗材料BLM、白藜蘆醇(resveratrol,Res)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)均購自美國Sigma-Aldrich公司;NRF2慢病毒顆粒、聚凝胺溶液(polybrene)、質粒轉染培養(yǎng)基均購自上海吉瑪基因公司;細胞松弛素B(cytochalasins B,CB)、吖啶橙粉末、嘌呤霉素(puromycin)購自廣州索萊寶生物科技有限公司;其他實驗室常規(guī)試劑均購自國藥集團。γ-H2AX兔單克隆抗體、Nrf2兔單克隆抗體購自美國CST公司;Rad51單克隆抗體購自英國Abcam公司;β-actin兔單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司;LaminB單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。四季青胎牛血清購自湖州市天杭生物科技股份有限公司;細胞胰酶消化液、青鏈霉素溶液均來自上海碧云天生物科技有限公司。免疫共沉淀試劑盒購自美國Thermo公司;DCFH-DA試劑盒、細胞核蛋白提取試劑盒、細胞胰酶消化液、青霉素-鏈霉素雙抗均來自上海碧云天生物科技有限公司;全自動凝膠成像系統(tǒng)GenoSens S2 system購自上海勤翔科學儀器有限公司;細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。
1.2 細胞培養(yǎng)人肺癌細胞株A549和H1299購自中國科學院細胞庫,由實驗室傳代保種;利用質粒瞬時轉染技術構建Nrf2敲低的細胞株(si-Nrf2)及其對照細胞株(si-NC);利用慢病毒穩(wěn)定轉染技術構建Nrf2敲低的細胞株(sh-Nrf2)及其對照細胞株(sh-NC)。用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。在細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞量較少時(小于30%),隔天換液。細胞轉染時采用不含血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。
1.3 活性氧(reactive oxygen species,ROS) 檢測將處于對數(shù)期的細胞用胰酶消化計數(shù),種25萬細胞到每個皿中,分為對照組、 BLM 組、NAC組及NAC+BLM 組。待細胞貼壁后,首先用1 mmol/L NAC處理NAC組及NAC+BLM 組30 min,然后再用5 μg/ml BLM處理BLM 組和NAC+BLM 組1 h。細胞完成培養(yǎng)后棄培養(yǎng)基,待反應完成后,用滅菌PBS輕柔洗滌3次后用錫箔紙包裹完全避光,放置倒置熒光顯微鏡下調整合適視野并觀察熒光強度。使用ZEN.2011數(shù)字成像軟件拍攝,各組隨機選取5個視野進行熒光統(tǒng)計。使用軟件Image J 進行分析處理,IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計分析熒光強度,使用GraphPad Prism 8繪制熒光強度分析統(tǒng)計圖。
1.4 免疫印跡進行蛋白表達的檢測將生長至對數(shù)期的對照組、BLM組、NAC+BLM組、Res+BLM組的A549和H1299正常細胞,質粒瞬時轉染A549和H1299細胞組:對照組、si-NC+BLM組、si-Nrf2+BLM組,慢病毒穩(wěn)定轉染A549細胞組:sh-NC組、sh-NC+BLM組、sh-Nrf2組、sh-Nrf2+BLM組進行提取蛋白操作;細胞長滿后用蛋白裂解液進行裂解,并收集全細胞蛋白用BCA蛋白測定試劑盒進行蛋白定量,上樣后于SDS-PAGE上進行蛋白條帶的分離,轉膜,封閉,分別加入β-actin、Nrf2、γ-H2AX、Rad51(1 ∶1 000)抗體,4 ℃孵育過夜。經(jīng)過3次洗膜,再加入相應的二抗(1 ∶2 000),洗膜3次后最后用凝膠成像儀獲取蛋白條帶。蛋白條帶灰度值采用Image J軟件分析,以β-actin為內參,目的蛋白條帶的灰度值進行歸一化處理。
1.5 微核形成實驗將正常A549和H1299細胞分為對照組、BLM組及Res+BLM 組,質粒瞬時轉染的A549和H1299細胞分為對照組和BLM組,細胞最佳狀態(tài)進行實驗,吸去含有BLM、Res的細胞培養(yǎng)基,加入新鮮完全培養(yǎng)基,放入細胞培養(yǎng)箱中1 h待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后,計數(shù)后取含10 000~20 000個細胞的細胞懸液加入6孔板中(每組設3個復孔),待細胞貼壁后加入終濃度2.5 μg/ml的CB,繼續(xù)培養(yǎng)2個細胞周期(32~36 h)后固定、染色,使用Partical Count3-2軟件計數(shù)每1 000個雙核細胞數(shù)中的微核細胞數(shù)。使用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計分析,使用GraphPad Prism 8繪制微核數(shù)統(tǒng)計圖。
1.6細胞轉染① siRNA瞬時轉染siRNA步驟按照轉染要求進行,按照質粒與轉染試劑1 ∶5的比例,對生長對數(shù)期細胞處于50%左右匯合度時進行細胞轉染操作,通過熒光可初步鑒定轉染效率。②shRNA構建Nrf2低表達穩(wěn)定細胞株,根據(jù)預實驗獲知轉染的病毒原液與培養(yǎng)基比例為1 ∶50,對生長對數(shù)期細胞處于50%左右匯合度時進行慢病毒轉染操作,按照試劑說明書進行,轉染 24~48 h后鏡下觀察狀態(tài),吸去病毒感染液,加入培養(yǎng)基(未加雙抗)繼續(xù)培養(yǎng);待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后,開始向培養(yǎng)基(加雙抗和血清)中加入終濃度為1.5 μg/ml的嘌呤霉素篩選獲得Nrf2低表達的穩(wěn)轉細胞系。
1.7 免疫共沉淀取生長狀態(tài)好的A549慢病毒穩(wěn)轉的細胞, 進行BLM處理后,按照免疫共沉淀試劑盒操作,先行弱裂解液裂解,離心取上清液,新制備的裂解液在4 ℃下與蛋白A/G瓊脂糖珠孵育30~60 min進行預清洗。含有蛋白質復合物的上清液被分離與抗Nrf2單抗或抗Rad51單抗一起孵育4 ℃過夜,然后加入Protein A/G瓊脂糖凝珠,4 ℃置于搖床溫和搖動4 h后,離心并用PBS洗滌分離的瓊脂糖凝珠,通過Western blot進行蛋白條帶的分離,并使用抗Nrf2或Rad51抗體進行蛋白分析。
1.8 統(tǒng)計學處理使用SPSS 24.0軟件進行分析,多組間比較采用方差分析,兩組間比較采用t檢驗。各組實驗重復3次以上,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 細胞內Nrf2在BLM作用下的活化DCFH-DA檢測顯示,BLM組與對照組相比細胞內產生的ROS的熒光強度明顯上升(P<0.01);NAC組與對照組相比細胞內產生的ROS熒光強度略有下降(P<0.05);NAC+BLM組與BLM組相比細胞內產生的ROS熒光強度下降顯著(P<0.01),見圖1A。本研究首先觀察了在NAC和BLM作用下Nrf2在A549和H1299細胞核內的蛋白表達變化,Western blot結果表明,BLM刺激后核內Nrf2蛋白表達上調(P<0.01),NAC的加入能有效抑制(P<0.01)Nrf2的核內累積,見圖1B。以上結果表明,BLM引起的氧化應激能夠使細胞內的Nrf2產生功能活化。
圖1 細胞內Nrf2在BLM作用下的活化A:5 μg/ml BLM作用后A549和H1299肺癌細胞內ROS的熒光活性 ×200;B:抗氧化轉錄因子Nrf2在A549和H1299肺癌細胞核內的蛋白表達;與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01;與BLM組比較:##P<0.01;與NAC組比較:&&P<0.01
2.2 刺激Nrf2的表達降低BLM誘導的細胞DNA損傷程度Western blot結果顯示,與對照組相比,BLM組細胞Nrf2蛋白的表達上調(P<0.01);與BLM組相比,Res+BLM組細胞Nrf2的蛋白表達上調(P<0.01)。γ-H2AX蛋白表達結果顯示,與對照組相比,BLM組細胞γ-H2AX蛋白表達水平上調(P<0.01),然而Res+BLM組的γ-H2AX蛋白表達水平比BLM組下調(P<0.01),見圖2A。微核結果顯示, 與對照組相比,BLM組細胞微核率升高(P<0.01);與BLM組相比,Res+BLM組微核率下降(P<0.01),其中A549細胞微核發(fā)生率下降10%,而H1299細胞微核發(fā)生率下降了40%左右。見圖2 B。兩種實驗結果均顯示,Nrf2的表達上調可以降低BLM誘導的細胞DNA損傷。
圖2 刺激Nrf2的表達降低BLM引起的細胞DNA損傷A:10 μmol/L Res作用24 h 后經(jīng)5 μg/ml BLM處理,抗氧化轉錄因子Nrf2和DNA損傷標志蛋白γ-H2AX在 A549和H1299肺癌細胞內的蛋白表達;B:10 μmol/L Res作用24 h后經(jīng)5 μg/ml BLM處理,A549和H1299肺癌細胞的微核形成率 ×200;與對照組比較:**P<0.01;與BLM組比較:#P<0.05,##P<0.01
2.3 抑制Nrf2的表達增強BLM對腫瘤細胞DNA的損傷siRNA對Nrf2的表達進行干擾實驗顯示,與對照組相比,BLM能夠引起si-NC組細胞的Nrf2表達上調(P<0.01),但BLM不能引起si-Nrf2細胞內Nrf2蛋白表達上調。與si-NC+BLM組相比,si-Nrf2+BLM組細胞的γ-H2AX蛋白水平的表達有了進一步的增強(P<0.01),見圖3A。微核試驗結果顯示,在si-NC細胞中,BLM處理組細胞微核率高于對照組(P<0.01);si-Nrf2細胞的BLM組相較于si-NC細胞BLM組的細胞微核率有了更為顯著的上升(P<0.05),見圖3B。
圖3 干擾Nrf2的表達增強BLM引起的細胞DNA損傷A:5 μg/ml BLM作用后A549和H1299肺癌細胞內Nrf2和γ-H2AX的蛋白表達;B:10 μmol/L Res作用24 h 后經(jīng)5 μg/ml BLM處理,A549和H1299肺癌的細胞微核形成情況 ×200;a:si-NC細胞;b:si-Nrf2細胞;與對照組比較:**P<0.01;與si-NC+BLM組比較:##P<0.01;與si-NC細胞的BLM 組比較:&P<0.05
2.4 Nrf2與Rad51相互作用對BLM引起的細胞DNA損傷的影響實驗中構建了Nrf2低表達穩(wěn)轉細胞系。Western blot 結果顯示,與sh-NC 組比較,sh-NC+Res組的細胞Nrf2蛋白表達水平上調(P<0.01);與sh-Nrf2 組比較,sh-Nrf2+Res組的細胞Nrf2蛋白表達水平上調(P<0.01),見圖4A。 Western blot實驗顯示,在sh-Nrf2細胞中,Rad51表達隨著Nrf2表達的抑制而同步下調(P<0.01),見圖4B。免疫共沉淀實驗的Western blot結果顯示,Nrf2與Rad51存在相互作用:A549細胞經(jīng)過BLM處理后,用IP抗體為Nrf2蛋白時,Western blot結果可以檢測到Rad51蛋白的表達;同樣在IP抗體為Rad51蛋白時,在最終Western blot實驗中可以檢測到Nrf2蛋白的表達。在BLM作用下,細胞內蛋白Nrf2通過與蛋白Rad51相互作用調控Rad51的表達,見圖4C。
圖4 Nrf2與Rad51相互作用降低BLM引起的細胞DNA損傷A:10 μmol/L Res 作用后A549肺癌細胞內Nrf2蛋白的表達;B:A549肺癌細胞內Nrf2和Rad51蛋白的表達;C:免疫共沉淀;a:sh-NC 組;b:sh-NC+Res 組;c:sh-Nrf2 組;d:sh-Nrf2+Res 組;與sh-NC組比較:**P<0.01;與sh-Nrf2組比較:##P<0.01
BLM是一種具有糖肽結構的抗癌藥物,因不產生骨髓抑制,在臨床上廣泛應用于生殖細胞癌、淋巴癌、肺癌的治療。BLM主要通過誘導DSBs促使腫瘤細胞凋亡而達到治療療效。γ-H2AX對DSBs快速敏感的反應使其被認為是DSBs早期檢測的金標準。在DSB發(fā)生后,組蛋白H2AX第139位絲氨酸被磷酸化而富集到DNA斷裂處,傳導損傷修復信號,招募DNA損傷修復蛋白如BRCA1、Rad51、Rad50等對損傷處進行修復。故對腫瘤細胞在BLM作用后細胞內DNA的損傷及其修復機制進行探究有助于揭示腫瘤細胞耐藥性的產生機制。
BLM對細胞損傷方式與輻射類似,BLM可作用于腫瘤細胞后可通過直接與DNA鏈的結合引起不依賴ROS的鏈的斷裂,但同時,BLM主要通過提高細胞內ROS的產生導致細胞DNA的氧化損傷。早期研究[8]認為,BLM的抗性產生是細胞內BLM水解酶上調造成的,該酶能夠水解BLM上的一個肽結構而降低BLM的活性。然而,研究[9]表明,這一機制并不是普遍存在于所有BLM抗性的細胞中。近年來,更多的關于BLM耐藥的機制被提出,其中抗氧化應激機制就是其中的一種。Nrf2是對抗細胞氧化應激的一種重要轉錄因子,廣泛存在于各種細胞及機體中。Nrf2的缺陷或調節(jié)異常可直接降低細胞應對氧化應激的敏感性[10]。該研究顯示,細胞在BLM作用后,細胞內的ROS 在短期內迅速累積,通過蛋白表達檢測顯示,兩種細胞在5 μg/ml BLM作用下,細胞核內Nrf2蛋白表達水平顯著增加,暗示細胞內Nrf2轉錄功能的活化。用Nrf2表達刺激劑人為刺激細胞Nrf2蛋白的表達水平,顯著緩解了細胞在BLM作用后的DNA損傷程度。用Nrf2的siRNA干擾Nrf2的基因表達后,細胞DNA的損傷顯著增加,結果提示,Nrf2功能的活化直接降低了腫瘤細胞DNA的損傷程度,這可能就是BLM抗藥性產生的一大原因。
根據(jù)先前的報告,細胞在BLM作用后,細胞處于G2/M期[11],這提示腫瘤細胞在BLM作用后DNA損傷修復機制的活化。且在輻射作用下,腫瘤細胞內DNA損傷修復相關蛋白53BP1以Nrf2依賴的方式活化,通過敲低方法抑制Nrf2時,在A549細胞中觀察到輻射誘導的53BP1 foci形成顯著減少[12]。這些結果表明,同源重組修復核心蛋白Rad51確實可能與Nrf2的表達相關。該研究結果顯示,當Nrf2表達被抑制時,Rad51蛋白的表達水平也出現(xiàn)了相應的下降,表明,在BLM誘導的細胞DNA損傷修復中,Rad51的表達受Nrf2的影響。且蛋白相互作用結果顯示,兩者存在直接相互作用。因此猜測Nrf2不僅僅通過抗氧化途徑保護細胞DNA損傷,同時還可以直接通過調控Rad51 來啟動DNA損傷修復,從而降低了腫瘤細胞在BLM作用下的DNA損傷程度。當然,Nrf2與Rad51具體作用方式還有待進一步的實驗研究。
綜上所述,該實驗提示Nrf2在腫瘤細胞對BLM抗性中存在著重要的作用,不僅僅是因為其強大的抗氧化功能,細胞內的Nrf2還可通過與Rad51相互作用調控Rad51蛋白表達水平,最終影響DNA的損傷修復。該研究為揭示Nrf2在BLM耐藥中的潛在機制提供了新的思路。