RNF43靶向PTEN進行泛素化修飾抑制人胃癌細胞AGS增殖與遷移

邵 笑，魏從文，閔 敏，董瑞華,4

胃癌(gastric cancer，GC)是五大常見腫瘤之一，目前中國已經(jīng)成為胃癌發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)均居高位的國家[1]。探尋新的治療靶點，對于提高胃癌療效，改善預后有重要的科學意義和應用價值[2]。

環(huán)指蛋白43 (ring finger 43，RNF43)具有環(huán)狀的泛素連接酶結構域和跨膜區(qū)，屬于跨膜的E3泛素連接酶[3-4]。研究[5]表明RNF43可以與Wnt/β-catenin信號通路中的受體蛋白Frizzled結合，泛素化卷曲受體蛋白并誘導該蛋白降解，進而抑制Wnt信號通路的活性發(fā)揮抑癌作用。前期研究[6]表明RNF43在胃癌中的表達較高，其作為胃癌中的生物標志物具有較高的研究價值。目前針對RNF43泛素化底物蛋白的研究較少，該實驗通過對RNF43作用新靶點發(fā)現(xiàn)與驗證，進一步明確RNF43在胃癌細胞中的分子機制，為胃癌的靶向治療提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 細胞與質粒人胃腺癌細胞AGS由軍事醫(yī)學科學院八所四室保存；不同標簽的RNF43質粒(Flag-RNF43、HA-RNF43、GFP-RNF43)、第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN)質粒Flag-PTEN、HA-PTEN購自北京義翹神州生物技術責任有限公司；泛素(Ubiquitin, Ub)質粒Myc-Ub及泛素48位、63位特異性泛素化的質粒Myc-Ub(K48)、Myc-Ub(K63)由實驗室保存。

1.2 主要試劑RPIM-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gbico公司；α-tubulin抗體購于美國Cell signaling technology公司；抗RNF43、PTEN抗體購于美國Abcam公司；轉染試劑購于法國Ployplus公司；PTEN選擇性抑制劑bpV (Hopic)、蛋白酶體抑制劑MG132購于美國Selleck公司；細胞增殖檢測試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)購于日本東仁化學科技有限公司；ANNEXIN V- FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于美國Solarbio公司。

1.3 主要儀器恒溫細胞培養(yǎng)箱(型號：3111)、超凈工作臺(型號：1384)購于美國Thermo公司；熒光倒置顯微鏡購于尼康儀器上海有限公司；恒壓恒流電泳儀(型號：164-5052)購于美國Bio-Rad公司；快速轉膜儀(型號：NovexTM)、流式細胞儀(型號：Attune NxT)購于美國Invitrogen公司；酶標儀(型號：Spark 20M)購于瑞士TECAN公司。

1.4 方法

1.4.1細胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清的RIPM-1640細胞培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)AGS細胞。注意觀察培養(yǎng)基顏色以及顯微鏡下細胞密度，及時給細胞更換培養(yǎng)基、傳代。

1.4.2細胞的瞬時轉染 準備四皿人胃腺癌細胞AGS，其中一皿作為空白對照組，轉染前更換細胞培養(yǎng)基，待細胞密度為80%左右時準備轉染。分別準備3個1.5 ml EP管，管中分別加入2、4、8 μg RNF43綠色熒光質粒和200 μl buffer緩沖液，震蕩15 s后靜置5 min；再分別加入4、8、16 μl轉染試劑，震蕩15 s后靜置10 min。將混合液分別轉移至3皿AGS細胞中，4～6 h后更換細胞培養(yǎng)基，24 h后顯微鏡下觀察細胞熒光或收集細胞樣品，觀察細胞熒光前用DAPI對細胞核進行藍色熒光染色。

1.4.3Western blot分析 準備四皿AGS細胞，分別轉染0、1、2、4 μg的Flag-RNF43。收集不同處理組細胞，裂解后離心收集上清液。用BCA法測定蛋白樣品濃度并加入SDS高溫煮沸制備蛋白樣品。用SDS-PAGE分離膠分離蛋白，轉膜，用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉；一抗4 ℃孵育過夜(α-tubulin抗體稀釋比例為1 ∶5 000；HA、Flag、Myc標簽抗體稀釋比例為1 ∶2 000；RNF43、PTEN抗體稀釋比例為1 ∶1 000)，TBST洗滌后二抗孵育1～2 h(山羊抗兔、山羊抗小鼠抗體稀釋比例為1 ∶5 000)，ECL化學發(fā)光顯影。以α-tubulin條帶為內參對照，Image J軟件分析RNF43及PTEN的蛋白相對表達量。

1.4.4免疫共沉淀分析 準備六皿AGS細胞，其中三皿中同時過表達HA-RNF43、Flag-PTEN和Myc-UB(WT、K48、K63)；另外三皿中分別過表達HA標簽的空載體質粒：HA-Vector、Flag-PTEN和Myc-UB(WT、K48、K63)。細胞轉染處理24 h后，加入NP40裂解液冰上裂解30 min，離心取上清液。上清液分成兩部分：一部分直接加入SDS，水浴煮沸制備Input細胞蛋白樣品；另一部分加入Flag標簽的磁珠，4 ℃搖床孵育過夜，離心棄去上清液，NP40洗液反復清洗磁珠3次后制備IP細胞蛋白樣品。注意細胞收樣前8 h加入40 nmol/ml的蛋白酶體抑制劑MG132。

1.4.5CCK-8檢測細胞增殖 Bisperoxovanadium (HOpic)[bpV (HOpic)]是一種有效的和具有選擇性的PTEN抑制劑，其IC50為14 nmol/L[7]。將AGS細胞分組，分別用bpV (HOpic)、RNF43處理。將不同處理組的AGS細胞接種至96孔板中，每組3個復孔。待細胞貼壁后6、12、24、36、48、72 h，用酶標儀測定細胞在450 nm波長的吸光度值，繪制增殖曲線來評估細胞的增殖能力。

1.4.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 將AGS腫瘤細胞分為Control組、RNF43組、bpV (HOpic)組及RNF43+bpV (HOpic)組，每組設置3個重復樣品。48 h后將不同處理組的AGS細胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化，PBS清洗2次，收集細胞。加入150 μl結合液將細胞重懸轉移至流式管中，分別加入5 μl AnnexinV-FITC、PI避光孵育15 min，流式細胞儀檢測AGS細胞凋亡情況(Q3為早期凋亡細胞，Q2為晚期凋亡細胞，通過計算Q2與Q3細胞分布總和，計算細胞凋亡總比例)。

1.4.7劃痕實驗檢測細胞遷移 將AGS腫瘤細胞分成Control組、RNF43組、bpV (HOpic)組及RNF43+bpV (HOpic)組，在6孔板中培養(yǎng)、處理AGS，每組設置3個復孔。待細胞密度達到100%后用200 μl無菌移液槍頭垂直與板面劃痕，每孔劃痕PBS洗滌3次后加入不含血清的培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察劃痕兩側細胞在0、12、24 h的遷移情況，拍照記錄，Image J軟件分析劃痕寬度變化。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，每組數(shù)據(jù)重復3次。多組樣本間比較采用單、雙因素方差分析，兩兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RNF43在AGS細胞中的瞬時轉染隨著RNF43轉染量的增加，細胞綠色熒光增加。藍色熒光為DAPI對AGS細胞核的染色。見圖1。

圖1 GFP-RNF43在AGS中的表達 ×40a: DPAI藍色染細胞核；B: 綠色熒光標記2 μg RNF43蛋白表達；C: 綠色熒光標記4 μg RNF43蛋白表達；D: 綠色熒光標記8 μg RNF43蛋白表達；藍色熒光標記細胞核

2.2 RNF43對PTEN蛋白表達水平的影響Western blot結果顯示，隨著RNF43的表達量增加，內源PTEN的蛋白表達量也隨之增加，其中過表達2、4 μg RNF43時差異有統(tǒng)計學意義(F=25.38，P<0.01，P<0.001)，見圖2A、B。免疫共沉淀結果顯示RNF43與PTEN存在相互作用，見圖2C。

圖2 AGS中RNF43與PTEN的相互作用A：RNF43對AGS細胞內源PTEN蛋白表達水平的影響；B：PTEN的內源蛋白水平變化；C：RNF43與PTEN的蛋白相互作用；a～d:Flag-RNF43的轉染量0、1、2、4 μg；與Control組(0 μg)比較：**P<0.01，***P<0.001

2.3 RNF43對PTEN的蛋白表達泛素化修飾的影響Western blot結果顯示，在AGS過表達RNF43之前，AGS細胞內即存在蛋白水平的泛素化調控，而當AGS中RNF43蛋白水平高表達后，細胞的泛素化水平增強，PTEN蛋白表達增強。其中以泛素分子K63位點進行特異性泛素化修飾的蛋白水平顯著增加：Ub(K63)+ RNF43組與Ub(K63)對照組的Ub蛋白水平存在差異(t=5.081，P=0.037)；Ub(K63)+ RNF43組與Ub(WT)+ RNF43組的Ub蛋白水平存在差異(t=6.945，P=0.020)。見圖3。說明RNF43主要通過K63的泛素化方式靶向修飾PTEN并增加PTEN的蛋白表達水平。

圖3 RNF43對PTEN的泛素化修飾A：AGS不同處理組的RNF43、PTEN及Ub的蛋白表達情況；B：AGS不同處理組中Ub的蛋白相對表達量；a:AGS高表達Ub組；b:AGS高表達Ub(K48)組；c:AGS高表達Ub(K63)組；d:AGS高表達Ub和RNF43組；e:AGS高表達Ub(K48)和RNF43組；f:AGS高表達Ub(K63)和RNF43組；與AGS高表達Ub(K63)組比較：*P<0.05；與AGS高表達Ub和RNF43組比較：#P<0.05

2.4 RNF43通過增加PTEN的表達對AGS細胞增殖的影響CCK-8實驗結果顯示，相較于Control組，RNF43組AGS腫瘤細胞增殖能力降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=26.46，P<0.01)；而相較于RNF43組，bpV (HOpic)+RNF43組AGS腫瘤細胞增殖能力提高，差異有統(tǒng)計學意義(F=33.26，P<0.05)。見圖4。表明RNF43可通過增加PTEN的表達來抑制AGS腫瘤細胞的增殖。

圖4 CCK-8檢測AGS細胞增殖變化與RNF43組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.5 RNF43通過增加PTEN的表達對AGS細胞凋亡的影響流式細胞實驗結果中Q2、Q3比例之和為腫瘤細胞凋亡的比例。Control組凋亡細胞占總腫瘤細胞數(shù)量的16.95%；bpV (HOpic)組48 h之后凋亡細胞比例為8.79%；RNF43組凋亡細胞比例為43.66%，細胞凋亡比例增加；bpV (HOpic)+RNF43組細胞凋亡比例為35.29%。與Control組相比，RNF43組AGS腫瘤細胞凋亡比例增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.87，P=0.000 4)；與RNF43組相比，bpV (HOpic)+RNF43組AGS腫瘤細胞凋亡減少，活細胞數(shù)量增加(t=3.341，P=0.028 8)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖5。說明加入RNF43之后加強了AGS腫瘤細胞內源PTEN的表達，對腫瘤細胞活性抑制加強，使腫瘤細胞凋亡增加。

圖5 AGS細胞凋亡變化A：流式細胞儀檢測AGS不同處理組細胞凋亡情況；B：AGS腫瘤細胞活性情況直方圖；a:Control組；b:bpV (HOpic)組；c:RNF43組；d: bpV (HOpic)+RNF43組；與RNF43組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.6 RNF43通過增加PTEN的表達對AGS遷移的影響細胞遷移結果顯示，隨著時間延長，細胞劃痕之間間隙逐漸縮??；與Control組相比，RNF43組AGS腫瘤細胞增長速度緩慢(t12 h=45.65，t24 h=88.03，P<0.000 1)；與RNF43組相比，bpV (HOpic)+RNF43組AGS腫瘤細胞的增長速度較快(t12 h=14.71，t24 h=39.70，P<0.000 1)，差異有統(tǒng)計學意義。各組間遷移能力的變化差異表明RNF43對PTEN的表達起到了增強作用,并抑制了AGS的遷移。見圖6。

圖6 AGS細胞遷移能力的變化A：AGS不同處理組細胞遷移能力變化；B：AGS不同處理組細胞遷移率直方圖；與RNF43組比較：***P<0.001

3 討論

胃癌患者臨床前期癥狀無特異性，確診時大多已進入進展期或晚期，預后較差。尋找胃癌新的分子靶點，對改善胃癌患者的臨床療效具有重要意義[8]。近年來RNF43被認為是胃癌的發(fā)生發(fā)展中重要的生物標志物，研究[9]表明RNF43是Wnt信號通路經(jīng)典的拮抗劑，其主要通過與卷曲蛋白frizzled結合并對其進行泛素化降解來抑制信號通路的活性，RNF43也可以通過影響T細胞因子4在細胞內的聚集來發(fā)揮Wnt信號通路拮抗劑的作用[10]。PTEN作為抑癌基因在胃癌細胞中高表達[11]，而泛素化是影響PTEN蛋白表達的重要調控機制——PTEN的單泛素化可以促進PTEN的核轉移，使其在細胞中表達增加，抑制腫瘤細胞的增殖[12]。

該研究探討了在人胃腺癌細胞AGS中RNF43的蛋白表達、對細胞內源PTEN蛋白表達以及對AGS細胞功能的影響。RNF43在腫瘤中的作用是多樣的：它在結直腸癌、胃癌、大腸癌等消化道腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，而在肝癌中則可以加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這種不同腫瘤中抑癌與促癌作用的差異，推測與RNF43特異性的化學結構有關。泛素化是蛋白質修飾的重要方式之一，而E3連接酶在這一過程中發(fā)揮重要作用。從結構上來說，RNF43屬于E3連接酶，可以通過對不同的底物蛋白進行泛素化修飾，使蛋白降解或表達增強，進而加速細胞的凋亡或增殖。本研究中的泛素化實驗證實了PTEN是RNF43泛素化修飾的底物蛋白，RNF43的蛋白高表達會使AGS細胞內源PTEN蛋白表達增加。實驗中AGS細胞增殖、遷移及細胞凋亡實驗均證明了RNF43對PTEN蛋白表達水平的調控作用會進一步影響細胞功能。然而，研究[13]已知PTEN主要在PI3K/AKT通路中發(fā)揮重要調控作用，所以RNF43對PTEN蛋白表達水平的影響是否會間接影響PI3K/AKT信號通路的活性仍需要繼續(xù)探究。

綜上所述，實驗表明，在人胃腺癌細胞AGS中，RNF43蛋白表達增加會使PTEN蛋白表達水平升高，并且PTEN是RNF43泛素化修飾的底物蛋白。細胞功能實驗證實RNF43會通過影響PTEN的蛋白表達抑制AGS腫瘤細胞的增殖、遷移并加速其凋亡。因此，RNF43不僅可以作為胃癌患者預后指標，同時它可通過調控不同蛋白的表達發(fā)揮抑癌作用，是重要的抑癌靶點，具有一定的深入研究價值。