宮頸癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)酪氨酸激酶受體1對(duì)其腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

孫倩玉，韋 艷，白 瑞，楊 萍

宮頸癌居全球女性常見(jiàn)惡性腫瘤第四位，居女性癌癥死亡原因的第四位[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)2020年宮頸癌新發(fā)病例達(dá)11萬(wàn)，已成為第二位宮頸癌負(fù)擔(dān)國(guó)[2]。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞(tumor related endothelial cells, TRECs)受腫瘤細(xì)胞直接或間接影響生成新生血管，為腫瘤惡性進(jìn)展提供條件[3-4]。血管生成素(angiopoietin，Ang)/酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor，Tie)通路參與血管新生機(jī)制[5-6]，Tie-1為此通路重要成員。課題組前期研究[7]表明，Tie-1在部分宮頸癌細(xì)胞(cervical cancer cells, CCCs)中高表達(dá)與患者不良預(yù)后有關(guān)；但Tie-1在TRECs中表達(dá)情況及其是否與患者預(yù)后有相關(guān)性尚不明確。該研究進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以探究CCCs與其TRECs中Tie-1表達(dá)的相關(guān)性，并通過(guò)細(xì)胞共培養(yǎng)法探究過(guò)表達(dá)Tie-1的宮頸癌細(xì)胞對(duì)其TRECs生物學(xué)行為的影響，為宮頸癌抗腫瘤血管生成治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 選擇2008年11月—2019年12月在石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科經(jīng)病理學(xué)檢查確診為宮頸癌的96例患者為研究對(duì)象，年齡為35～83(53.16±11.36)歲，術(shù)前均未接受過(guò)放化療。收集患者年齡、FIGO分期(2018年版)、腫瘤直徑、分化程度、宮頸肌層浸潤(rùn)深度、腫瘤類型、淋巴脈管間隙浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理資料，按照不同病理特征分組(見(jiàn)表1)。對(duì)患者行術(shù)后隨訪，記錄患者無(wú)瘤生存時(shí)間(progression-free survival，PFS)和總生存時(shí)間(overall survival，OS)。無(wú)瘤生存時(shí)間是指從手術(shù)日至有證據(jù)標(biāo)明腫瘤復(fù)發(fā)之日或末次隨訪日期的時(shí)間；總生存時(shí)間是指手術(shù)日至死亡日或末次隨訪日期的時(shí)間。

1.1.2試劑與材料 Tie-1過(guò)表達(dá)慢病毒購(gòu)自上海和元生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：H17481)；Tie-1及β-actin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：C11995500BT)、胎牛血清(貨號(hào)：10099141)、Hyclone胰酶(貨號(hào)：25200-056)等購(gòu)自德國(guó)Gibco公司；細(xì)胞共培養(yǎng)Transwell小室(貨號(hào)：3413)、細(xì)胞侵襲遷移Transwell小室(貨號(hào)：3422)、Matrigel基質(zhì)膠(貨號(hào)：354234)購(gòu)自美國(guó)康寧公司。

1.1.3細(xì)胞 人宮頸癌HeLa細(xì)胞(貨號(hào)：XF0314)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC(貨號(hào)：XF1122)購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。所有細(xì)胞均用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化染色檢測(cè)96例宮頸癌患者石蠟組織切片中CCCs及TRECs Tie-1的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[7]，Tie-1抗體工作過(guò)濃度為1 ∶500。Tie-1在CCCs及TRECs中的表達(dá)均為胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒，呈全或無(wú)染色，且染色均勻。隨機(jī)選取3個(gè)視野，根據(jù)CCCs或TRECs細(xì)胞染色的強(qiáng)度分別評(píng)分：無(wú)染色記為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色評(píng)分小于2分為低表達(dá)，≥2分為高表達(dá)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 本實(shí)驗(yàn)按照慢病毒轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)所示操作步驟進(jìn)行。將宮頸癌HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合度約60%時(shí)加入含過(guò)表達(dá)Tie-1基因序列(Tie1-Overexpression, Tie1OE)或空載體基因序列(natural control, NC)的慢病毒，12 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，24 h后更換含嘌呤霉素(2 μg/ml)的完全培養(yǎng)基連續(xù)篩選7 d。用Western blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)Tie-1的HeLa細(xì)胞(HeLa-Tie1-Overexpression，HeLa-Tie1OE)及空轉(zhuǎn)染對(duì)照組HeLa細(xì)胞(HeLa-Natural control，HeLa-NC)Tie-1蛋白表達(dá)水平。

1.2.3細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)采用膜孔徑為0.4 μm的Transwell小室構(gòu)建細(xì)胞共培養(yǎng)模型，于上室接種HeLa-Tie1OE或HeLa-NC細(xì)胞，下室接種HUVEC細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)均為2×104個(gè)，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。48 h后移除上室，下室中的HUVECs即為宮頸癌TRECs[8]，根據(jù)共培養(yǎng)時(shí)上室的HeLa細(xì)胞不同，將共培養(yǎng)后獲得的TRECs分別記為HUVECs+HeLa-Tie1OE、HUVECs+HeLa-NC，以單獨(dú)培養(yǎng)的HUVECs原株作為空白對(duì)照組。Western blot檢測(cè)不同共培養(yǎng)體系下獲得的TRECs細(xì)胞Tie-1蛋白表達(dá)水平。

1.2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[9]。用細(xì)胞裂解液于冰上提取細(xì)胞總蛋白，取等質(zhì)量蛋白行凝膠電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1.5 h，將膜置于含β-actin(1 ∶1 000)或Tie-1(1 ∶1 000)的一抗反應(yīng)液中4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后用相應(yīng)二抗(1 ∶10 000)孵育1.5 h，再次洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，通過(guò)分析條帶灰度值計(jì)算相應(yīng)蛋白表達(dá)水平。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將共培養(yǎng)體系中獲得的2種TRECs(HUVECs+HeLa-Tie1OE、 HUVECs+HeLa-NC)及HUVECs，分別以5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，每孔加入2 ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度近100%時(shí)進(jìn)行劃痕處理并換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別于劃痕后0、12、24 h用顯微鏡定點(diǎn)觀察并拍照。Image J軟件分析圖片中劃痕剩余面積，計(jì)算細(xì)胞遷移面積并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前將Matrigel基質(zhì)膠于4 ℃冰箱中解凍，將基質(zhì)膠按1 ∶4用DMEM稀釋，在Transwell上室中加入50 μl稀釋后的基質(zhì)膠，放入37 ℃培養(yǎng)箱中30 min至膠凝。用DMEM分別將HUVECs+HeLa-Tie1OE、HUVECs+HeLa-NC及HUVECs細(xì)胞的濃度調(diào)整為15×104個(gè)/ml，于上室加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入800 μl含20%胎牛血清的DMEM，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后取出上室，用棉簽擦去上層基質(zhì)膠和未穿過(guò)膜的細(xì)胞，將小室置于4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min后PBS洗3次。于200倍鏡下隨機(jī)選取4個(gè)視野拍照，計(jì)算穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)。

1.2.7細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 與細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)步驟基本相同，其中Transwell小室上室不加基質(zhì)膠，且細(xì)胞接種后于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出行固定、染色、拍照、計(jì)數(shù)。

1.2.8小管生成試驗(yàn) 將基質(zhì)膠按1 ∶5用DMEM稀釋，在96孔板中每孔加入50 μl稀釋后的基質(zhì)膠，放入37 ℃培養(yǎng)箱中至基質(zhì)膠凝固，分別將HUVECs+HeLa-Tie1OE、HUVECs+HeLa-NC、HUVECs用DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，每孔接種100 μl。接種9 h后于200倍鏡下選取4個(gè)視野拍照并對(duì)每組細(xì)胞所形成的血管節(jié)點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 Tie-1在CCCs和TRECs的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，Tie-1在96例宮頸癌患者癌組織中CCCs及TRECs的高表達(dá)率分別為51.0%(49/96)和 53.1%(51/96)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Tie-1在宮頸癌患者癌組織中CCCs的表達(dá)與其在TRECs中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.709，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 Tie-1在宮頸癌組織中CCCs及TRECs的表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān) IHC ×400A、 B：宮頸鱗癌；C、D：宮頸腺癌；黑箭頭：CCCs；紅箭頭：TRECs

2.2 Tie-1在宮頸癌患者組織中TRECs的表達(dá)與患者臨床病理特征的相關(guān)性Tie-1在FIGO(2018)分期為ⅠB2-ⅡA2期、腫瘤直徑≥4 cm、腺癌、中低分化、宮頸肌層浸潤(rùn)深度≥1/2全層的宮頸癌TRECs中的高表達(dá)率分別高于ⅠA1-ⅠB1、腫瘤直徑<4 cm、鱗癌、高分化、宮頸肌層浸潤(rùn)深度<1/2全層宮頸癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 Tie-1在宮頸癌TRECs中的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 Tie-1在宮頸癌TRECs中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系對(duì)96例宮頸癌患者進(jìn)行隨訪，失訪7例，中位隨訪時(shí)間為48(22～123)個(gè)月，其中24例復(fù)發(fā)，19例死亡。Kaplan-Meier生存分析顯示， 89例患者中TRECs Tie-1高表達(dá)者5年累積PFS[63.0%(29/46)]及OS[67.4% (31/46)]均低于TRECs Tie-1低表達(dá)者的PFS[83.7%(36/43)]及OS[90.7%(39/43)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PPFS=0.019，POS=0.005)，見(jiàn)圖2A、B。

圖2 TRECs中Tie-1的不同表達(dá)的宮頸癌患者PFS(A)和OS(B)對(duì)應(yīng)的生存曲線圖與Tie-1低表達(dá)組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4 HUVECs與過(guò)表達(dá)Tie-1的宮頸癌細(xì)胞共培養(yǎng)后其 Tie-1表達(dá)情況用慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建Tie-1過(guò)表達(dá)的HeLa細(xì)胞，結(jié)果顯示，與HeLa-NC組及HeLa組相比,HeLa-Tie1OE組細(xì)胞Tie-1的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.78,P<0.001)，如圖3A、B；HeLa細(xì)胞Tie-1過(guò)表達(dá)成功后，將HeLa-Tie1OE、HeLa-NC細(xì)胞細(xì)胞分別與HUVECs共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，相較于HUVECs+HeLa-NC共培養(yǎng)獲得的TRECs或HUVEC原株細(xì)胞，HUVECs+HeLa-Tie1OE共培養(yǎng)獲得的TRECs其Tie-1的表達(dá)水平升高(F=3.867，P=0.018)，圖3C、D。

圖3 HUVECs與過(guò)表達(dá)Tie-1的HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)后TRECs Tie-1表達(dá)情況A、B：Western blot檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組HeLa細(xì)胞Tie-1表達(dá)情況灰?guī)D及圖灰度值統(tǒng)計(jì)分析圖；C、D：Western blot檢測(cè)共培養(yǎng)體系下各組TRECs的Tie-1的表達(dá)情況灰?guī)D及圖灰度值統(tǒng)計(jì)分析圖；a: HeLa組；b: HeLa-NC組；c: HeLa-Tie1OE組；d: HUVECs組；e: HUVECs+HeLa-NC組；f: HUVECs+HeLa-Tie1OE組；與HeLa組比較：####P<0.000 1；與HeLa-NC組比較：****P<0.000 1；與HUVECs組比較：&&&P<0.001；與HUVECs+HeLa-NC組比較：▽P<0.05

2.5 過(guò)表達(dá)Tie-1的宮頸癌HeLa細(xì)胞對(duì)其TRECs侵襲和遷移能力的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，與HUVECs及HUVECs+HeLa-NC共培養(yǎng)獲得的TRECs相比，HUVECs+HeLa-Tie1OE共培養(yǎng)獲得的TRECs在第12、24小時(shí)遷移距離均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F12 h=8.916,P<0.001，F(xiàn)24 h=13.068,P<0.001)，見(jiàn)圖4A、B。Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)顯示，與HUVECs及HUVECs+HeLa-NC共培養(yǎng)獲得的TRECs相比，HUVECs+HeLa-Tie1OE共培養(yǎng)獲得的TRECs穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)更多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F遷移=124.1,P<0.000 1；F侵襲=17.90,P<0.001)，見(jiàn)圖4C、D。

圖4 過(guò)表達(dá)Tie-1的宮頸癌HeLa對(duì)其TRECs侵襲和遷移能力的影響A：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)白光圖 ×100；B：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析折線圖；C：Transwell細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)白光圖 結(jié)晶紫染色 ×200；D、E：Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖；a: HUVECs組； b: HUVECs+HeLa-NC組； c: HUVECs+HeLa-Tie1OE組；與HUVECs組比較：#P<0.05，###P<0.001，####P<0.000 1；與HUVECs+HeLa-NC組比較：**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1

2.6 宮頸癌HeLa細(xì)胞Tie-1過(guò)表達(dá)對(duì)其TRECs小管生成能力的影響體外小管生成試驗(yàn)顯示，與HUVECs原株細(xì)胞及HUVECs+HeLa-NC共培養(yǎng)獲得的TRECs相比，HUVECs+HeLa-Tie1OE共培養(yǎng)獲得的TRECs生成血管節(jié)點(diǎn)數(shù)更多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.86,P=0.001 2)，見(jiàn)圖5A、B。

圖5 過(guò)表達(dá)Tie-1的宮頸癌HeLa細(xì)胞對(duì)其TRECs小管生成能力的影響 A：小管生成試驗(yàn)白光圖 ×200； B：小管結(jié)點(diǎn)生成數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析圖；a: HUVECs組； b: HUVECs+HeLa-NC組；c: HUVECs+HeLa-Tie1OE組；與HUVECs組比較：##P<0.01；與HUVECs+HeLa-NC組比較：**P<0.01

3 討論

近年來(lái)我國(guó)宮頸癌發(fā)病率和病死率逐年增高[10]，早期宮頸癌患者尚能得到有效治療，但晚期宮頸癌患者常因缺乏有效治療手段預(yù)后較差。目前抗腫瘤血管生成已成為難治性宮頸癌的治療手段之一，其中抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類藥物被廣泛應(yīng)用，但此類藥物存在多種副作用，治療效果也因人而異[11]。研究[5]表明，除常見(jiàn)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子外，Tie-1所在的Ang/Tie通路也參與腫瘤血管生成過(guò)程。目前，Tie-1在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)呈高表達(dá)，其在腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展中的作用已成為研究熱點(diǎn)，但在宮頸癌中的研究報(bào)道尚少。

Tie-1在一些腫瘤的癌細(xì)胞或TRECs中高表達(dá)并提示患者不良預(yù)后[5,7,12]。有研究[5]表明，Tie-1在胃腺癌細(xì)胞高表達(dá)與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)，并且在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、腫瘤浸潤(rùn)深度、Duke分類和淋巴浸潤(rùn)存在顯著相關(guān)性。在卵巢癌中，Tie-1在癌細(xì)胞中高表達(dá)不僅提示患者預(yù)后差，還與順鉑耐藥性有關(guān)[12]。前期，該課題組[7]研究表明Tie-1在宮頸癌上皮細(xì)胞中高表達(dá)與患者不良預(yù)后有關(guān)。另外，Tie-1在浸潤(rùn)性導(dǎo)管性乳腺癌的TRECs中高表達(dá)并且其高表達(dá)與患者癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[5]。在具有轉(zhuǎn)移潛能的黑色素瘤細(xì)胞中Tie-1高表達(dá)，并且在黑色素瘤轉(zhuǎn)移瘤中的微血管中檢測(cè)到Tie-1 mRNA表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性[13]。該研究表明，在宮頸癌組織TRECs中Tie-1的高表達(dá)與患者臨床分期、腫瘤直徑、分化程度、腫瘤類型等病理特征相關(guān)，并且與患者不良預(yù)后有關(guān)。有研究[14]表明，若沒(méi)有新生血管生成,腫瘤生長(zhǎng)會(huì)受到抑制；該研究顯示，當(dāng)腫瘤直徑分界分別為4 cm(P<0.001)時(shí)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，提示宮頸癌組織TRECs中Tie-1的高表達(dá)與腫瘤大小密切相關(guān)。另外，局部晚期宮頸癌腫瘤直徑通常大于4 cm，提示Tie-1在局部晚期宮頸癌TRECs中高表達(dá)可能與宮頸癌進(jìn)展有關(guān)。

Tie-1對(duì)腫瘤血管生成及成熟具有重要作用[6,15]。在小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，Tie-1缺陷的小鼠雖然沒(méi)有明顯的血管生成障礙，但是它們的血管系統(tǒng)不能成熟，胚胎在妊娠后期即死亡[15]。另外，在小鼠原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)期間，內(nèi)皮細(xì)胞中Tie-1缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤微血管密度降低、血管生成減少和血管正?；鰪?qiáng)使腫瘤內(nèi)壞死逐漸增加[6]。在Ang/Tie通路中，Tie-1能與Tie-2結(jié)合形成多聚體，穩(wěn)定Tie-2磷酸化信號(hào)，正向調(diào)控Ang/Tie-2信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活和遷移，在腫瘤微環(huán)境中，內(nèi)皮細(xì)胞侵襲遷移能力提高可促進(jìn)血管的新生[15]。本研究顯示，Tie-1在宮頸癌組織中CCCs和TRECs中的表達(dá)呈正相關(guān)，并通過(guò)體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)果；其次，TRECs中Tie-1表達(dá)升高促進(jìn)了其侵襲、遷移及小管生成能力。以上說(shuō)明宮頸癌細(xì)胞可能通過(guò)某種方式影響了其TRECs中Tie-1表達(dá)并促進(jìn)了TRECs形成新生血管，其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步探究。

綜上所述，該研究表明，Tie-1在子宮頸CCCs與TRECs的表達(dá)呈正相關(guān)，且TRECs中Tie-1的高表達(dá)與患者腫瘤臨床分期、腫瘤直徑、癌組織浸潤(rùn)深度、分化程度、腫瘤類型相關(guān)，與患者5年累積PFS及OS呈負(fù)相關(guān)，提示宮頸癌TRECs中Tie-1高表達(dá)患者生存時(shí)間相對(duì)較短，預(yù)后較差。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，HUVECs與過(guò)表達(dá)Tie-1的HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)后獲得的TRECs其Tie-1表達(dá)水平升高，且此細(xì)胞的侵襲、遷移和小管生成能力增強(qiáng)。因此，Tie-1在宮頸癌TRECs中的高表達(dá)有望作為潛在的宮頸癌血管標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)患者預(yù)后，并可能成為優(yōu)于VEGF的宮頸癌抗腫瘤血管生成治療靶點(diǎn)。