2-BFI對(duì)氟化鈉致SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

徐 婉，張才溢，閆 微，耿德勤

地方性氟中毒(以下簡(jiǎn)稱“地氟病”)是以氟骨癥、氟斑牙為主要特征的一種慢性全身性疾病[1]。有研究[2]表明，過(guò)量氟暴露會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)受損和功能障礙。唑啉化合物2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉[2-(2-benzofuranyl) 2-imidazoline, 2-BFI]是咪唑啉2受體的選擇性配體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)線粒體膜上強(qiáng)烈表達(dá)，有研究[3]表明2-BFI對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用。但是2-BFI對(duì)地氟病的神經(jīng)毒性是否具有保護(hù)作用，還有待進(jìn)一步研究。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用SH-SY5Y細(xì)胞建立地氟病模型，觀察細(xì)胞凋亡及對(duì)線粒體功能的變化，探究2-BFI對(duì)氟中毒的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑NaF購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；2-BFI購(gòu)自英國(guó)TOCRIS生物科技公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青鏈霉素溶液、CCK-8試劑盒、TRIzol購(gòu)自徐州Vicmed公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；cleaved caspase-3、Tubulin抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；Bcl-2、Bax抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒、線粒體紅色熒光探針(Mito-tracker red CMXRos，TMRM)試劑盒(C1049B)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；奧德賽激光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司；Tunnel試劑盒(貨號(hào)：MA0224)購(gòu)自大連美侖生物公司；透射電子顯微鏡購(gòu)自上海NULL公司。

精密稱取NaF粉末41.99 mg，加入50 ml PBS緩沖液混勻至完全溶解，配制成20 mmol/L的儲(chǔ)存液；在1 mg 2-BFI粉末中加入4.49 ml PBS緩沖液混勻至完全溶解，配制成1 mmol/L的母液，0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后于-20 ℃保存，按需要濃度培養(yǎng)基稀釋后使用。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；SH-SY5Y細(xì)胞在DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素)中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分組方法：① NaF篩選實(shí)驗(yàn)分組，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(不做處理)和實(shí)驗(yàn)組(加入濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mmol/L的NaF培養(yǎng)24 h)[4]；② 2-BFI篩選實(shí)驗(yàn)分組，將細(xì)胞分為對(duì)照組(不做處理)、損傷組(僅NaF)、2-BFI組(NaF和濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L的2-BFI培養(yǎng)24 h)[5]；③ 藥物濃度篩選之后將SH-SY5Y細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(不做處理)、NaF組、NaF + 2-BFI組，處理24 h。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性將細(xì)胞按分組加入不同藥物作用24 h后，加入CCK-8試劑10 μl，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值。設(shè)置不含任何藥物和細(xì)胞的等體積的培養(yǎng)液為空白孔。細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔)/(A對(duì)照孔-A空白孔)×100%。

1.4 ATP濃度測(cè)定吸除培養(yǎng)基，每孔加入200 μl裂解液，4 ℃、 12 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)定濃度：加100 μl ATP檢測(cè)工作液到檢測(cè)孔內(nèi)，室溫放置3 min，以消耗本底ATP。在檢測(cè)孔內(nèi)加入20 μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速混勻，用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATP的濃度[6]。

1.5 線粒體膜電位檢測(cè)應(yīng)用TMRM染色檢測(cè)線粒體膜電位。取出孔板，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌1次，加入2 μl TMRM染色液和198 μl PBS，輕輕混勻。37 ℃孵育15 min后，移液器吸棄TMRM工作液，加入37 ℃預(yù)熱的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。用倒置熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.6 透射電子顯微鏡將藥物處理好的細(xì)胞胰酶消化離心，收集細(xì)胞，用2.5%戊二醛固定、脫水、包埋、固化，將制備好的樣本進(jìn)行超薄切片，用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色，然后用透射電鏡進(jìn)行觀察、拍照。

1.7 TUNEL染色法用PBS洗滌細(xì)胞孔板后，加入組織固定液于室溫下固定30 min，通透5 min，加入50 μl TUNEL檢測(cè)液，使檢測(cè)液均勻覆蓋在樣本上，37 ℃避光孵育60 min，DAPI染色液室溫孵育5 min。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色結(jié)果，顯示紅色熒光的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法每個(gè)大皿加入150 μl細(xì)胞裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)，裂解完全后置于提前預(yù)冷至4 ℃的離心機(jī)中，12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min。通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白濃度，配平后煮沸使蛋白充分變性。15% SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h后使用奧德賽系統(tǒng)掃描條帶，用Image J軟件分析圖像，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的吸光度比值作為結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 NaF對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的抑制作用CCK-8結(jié)果顯示，SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)受到不同濃度的NaF的抑制，且細(xì)胞存活率隨NaF濃度的升高呈下降趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，NaF 1.5 mmol/L組(F=12.89，P<0.05)、NaF 4.0 mmol/L組(F=12.89，P<0.001)細(xì)胞存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上提示NaF 1.5 mmol/L時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)明顯抑制作用，當(dāng)NaF濃度為4.0 mmol/L時(shí)，細(xì)胞抑制作用過(guò)度。當(dāng)NaF質(zhì)量濃度太低時(shí)，不能有效抑制細(xì)胞增殖，而NaF濃度過(guò)高則會(huì)引起細(xì)胞死亡過(guò)量，因此本實(shí)驗(yàn)選用2.0 mmol/L處理24 h作為后續(xù)研究的最佳濃度。見(jiàn)圖1。

圖1 NaF對(duì)細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 2-BFI對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響用2.0 mmol/L NaF處理24 h后再加入不同濃度的2-BFI處理24 h。CCK-8結(jié)果顯示，當(dāng)2-BFI濃度在2.5 μmol/L到10 μmol/L之間，細(xì)胞活性隨藥物濃度的升高而升高。與NaF組相比，2-BFI濃度為10 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率最高為99.16%(F=21.18，P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)2-BFI濃度大于10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率隨2-BFI濃度升高反而下降，2-BFI濃度為40 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率與10 μmol/L組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.18，P<0.01)。見(jiàn)圖2。以上說(shuō)明2-BFI發(fā)揮保護(hù)作用存在一個(gè)最佳濃度范圍，濃度過(guò)高對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生損傷作用。因此，2-BFI最佳作用濃度為10 μmol/L。

圖2 2-BFI對(duì)細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組比較：**P<0.01；與NaF組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與NaF+2-BFI 10 μmol/L組比較：&&P<0.01

2.3 2-BFI對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響通過(guò)電鏡觀察可知，對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞線粒體呈橢圓形，線粒體嵴清晰，結(jié)構(gòu)完整；NaF組線粒體出現(xiàn)不同程度結(jié)構(gòu)缺失，線粒體腫脹，結(jié)構(gòu)松散，甚至部分呈空泡狀，形態(tài)延長(zhǎng)，出現(xiàn)絲狀和管狀線粒體；2-BFI組大部分線粒體結(jié)構(gòu)正常，有部分嵴模糊，但基本具有完整結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖3。

圖3 2-BFI對(duì)線粒體形態(tài)的影響 ×25 000A：對(duì)照組；B：NaF組；C：2-BFI組

2.4 2-BFI對(duì)線粒體功能的影響與對(duì)照組比較，NaF組ATP水平下降(F=1 155，P<0.001)；與NaF組比較，NaF+2-BFI組SH-SY5Y細(xì)胞的ATP水平升高(F=1 155，P<0.001。見(jiàn)圖4。與對(duì)照組相比，NaF組TMRM熒光強(qiáng)度降低(F=15.61，P<0.01)；與NaF組比較，NaF+2-BFI組TMRM的熒光信號(hào)升高(F=15.61，P<0.01)。見(jiàn)圖5。以上結(jié)果提示2-BFI可以改善NaF引發(fā)的線粒體膜電位(Δψm)的降低情況。

圖4 2-BFI 對(duì)ATP水平的影響與對(duì)照組比較：***P<0.001；與NaF組比較：###P<0.001

圖5 2-BFI 對(duì)線粒體膜電位的影響 TMRM染色 ×20A：對(duì)照組；B：NaF組；C：NaF+2-BFI組；D：各組熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與NaF組比較：##P<0.01

2.5 2-BFI對(duì)細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，NaF組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，凋亡率升高(F=15.61，P<0.01)；與NaF組比較，NaF+2-BFI組凋亡率下降(F=15.61，P<0.05)。見(jiàn)圖6。提示2-BFI可以緩解NaF引發(fā)的細(xì)胞凋亡。

圖6 2-BFI對(duì)氟中毒細(xì)胞凋亡率的影響 TUNEL熒光染色 ×20A：對(duì)照組；B：NaF組；C：NaF+2-BFI組；D：凋亡率統(tǒng)計(jì)；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與NaF組比較：#P<0.05

與對(duì)照組比較，NaF組的促凋亡蛋白cleaved caspase-3、Bax含量升高(F=73.76，P<0.001；F=17.73，P<0.01)，抑制凋亡的Bcl-2含量降低(F=39.33，P<0.01)。見(jiàn)圖7。與NaF組相比，2-BFI組的cleaved caspase-3、Bax蛋白含量降低(F=73.76，P<0.01；F=17.73，P<0.05)，Bcl-2蛋白含量有所升高(F=39.33，P<0.01)。

圖7 2-BFI對(duì)氟中毒細(xì)胞cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的影響a: cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白條帶圖；B-D：條帶定量分析統(tǒng)計(jì)圖；a：對(duì)照組；b：NaF組；c：NaF+2-BFI組；與對(duì)照組比較：**P<0.01，***P<0.001；與NaF組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

氟是自然界分布廣泛的元素之一，由于氟化物高度可溶，可通過(guò)飲用、食物等介質(zhì)進(jìn)入人體，當(dāng)人體過(guò)量攝入氟后，氟化物可以從胃腸吸收進(jìn)入血液，然后再通過(guò)擴(kuò)散透過(guò)生物膜如血腦屏障，從而對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響[7]。據(jù)報(bào)道，產(chǎn)前暴露于氟的小鼠大腦中的氟含量比未暴露的動(dòng)物高1.5倍[8]；長(zhǎng)期接觸氟化物后，工人出現(xiàn)了嗜睡、記憶力減退和注意力障礙等神經(jīng)精神癥狀[9]。本研究顯示，隨著氟化鈉濃度的升高，SH-SY5Y細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞存活率不斷下降，表明過(guò)量的氟會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用。

2-BFI分子量小，極易透過(guò)血腦屏障。2-BFI在小膠質(zhì)細(xì)胞中通過(guò)抗脂質(zhì)氧化作用，穩(wěn)定線粒體膜電位，減少凋亡蛋白釋放，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)神經(jīng)損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用2-BFI處理NaF損傷的SH-SY5Y細(xì)胞，可顯著提高細(xì)胞存活率，表明2-BFI在地方性氟中毒中有神經(jīng)保護(hù)作用。

線粒體是真核生物進(jìn)行氧化代謝的重要的細(xì)胞器，且一直處在分裂和融合的過(guò)程中，線粒體的形態(tài)在線粒體正常功能維持過(guò)程中起著非常重要的作用[11]。由于大腦需要消耗大量的能量執(zhí)行功能活動(dòng)，然而大腦糖酵解能力不足，所以幾乎全部依靠線粒體經(jīng)氧化磷酸化過(guò)程產(chǎn)生的ATP來(lái)供能，且氟化物易在神經(jīng)系統(tǒng)積聚，所以神經(jīng)細(xì)胞的線粒體更容易受到氟化物的作用而受到損傷[12]。本研究結(jié)果表明，氟化鈉作用于SH-SY5Y細(xì)胞后，線粒體功能障礙。2-BFI處理24 h之后，有效提高ATP生產(chǎn)量，穩(wěn)定線粒體膜電位，表明在細(xì)胞氟中毒實(shí)驗(yàn)中，2-BFI可以通過(guò)穩(wěn)定持線粒體形態(tài)和功能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種形式，它會(huì)對(duì)各種不同的毒性刺激做出反應(yīng)[13]。為了進(jìn)一步檢測(cè)2-BFI在細(xì)胞凋亡中是否發(fā)揮作用，該研究通過(guò)TUNEL染色法檢測(cè)了細(xì)胞凋亡率，同時(shí)檢測(cè)了凋亡通路相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2。研究結(jié)果顯示，2-BFI可降低SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率，降低Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，升高Bcl-2蛋白水平，提示2-BFI的氟中毒神經(jīng)保護(hù)可能與抑制線粒體凋亡途徑激活有關(guān)。