ABCA1通過激活EGFR/STAT3信號通路對胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

金 泳，杜 洪，夏 英，項(xiàng)婷婷，韋四喜，孫 銘，黃 海

胃癌(gastric cancer, GC)是世界范圍內(nèi)高發(fā)病率、高病死率的腫瘤之一[1]，在我國，國家癌癥中心發(fā)布2020年預(yù)計(jì)胃癌發(fā)病率達(dá)24.30/10萬[2]。胃癌早期起病較為隱匿，因此大部分患者就診時(shí)病程已經(jīng)進(jìn)入中晚期，腫瘤細(xì)胞已擴(kuò)散轉(zhuǎn)移[3]，而胃癌發(fā)生發(fā)展的病理分子機(jī)制尚未闡明也為腫瘤的診療帶來困難，因此，探究胃癌致病及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移機(jī)理將有助于改善胃癌的診斷和治療。ATP結(jié)合盒亞家族A成員1(ATP binding cassette subfamily A member 1，ABCA1)是三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族的重要成員之一，研究[4]表明ABCA1主要參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)及膽固醇代謝，但近年來有研究報(bào)道ABCA1在腫瘤的進(jìn)展中扮演重要角色，參與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成等生物學(xué)現(xiàn)象[5]，與腫瘤患者預(yù)后不良相關(guān)[6]。然而，ABCA1在胃癌中的作用及其相關(guān)分子機(jī)制卻鮮有報(bào)道。該研究探討ABCA1在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中可能的分子機(jī)制，以期尋找胃癌治療靶點(diǎn)或分子生物學(xué)標(biāo)記，為胃癌的診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1胃癌組織及細(xì)胞來源 GC細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN45、HGC-27及胃黏膜細(xì)胞系GES-1購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；293T細(xì)胞系由蘭州大學(xué)金衛(wèi)林教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。收取2020—2022年貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科25例手術(shù)前未經(jīng)過化療、放療和免疫治療的胃腺癌患者胃癌組織，同時(shí)取相鄰癌組織間隔5 cm以上癌旁組織作為對照; 組織標(biāo)本均有唯一識別標(biāo)記，留存于液氮中；本研究所用組織樣本均通過貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查(審批號：2020倫審第106號)。

1.1.2shRNA和引物 shABCA1-1序列: 5′-GCGACTCCACATAGAAGAC-3′； shABCA1-2序列：5′-GACGTATGTGCAGATCATA-3′，ABCA1的 shRNA質(zhì)粒購于廣州艾基生物技術(shù)有限公司。ABCA1 PCR引物序列：上游5′-ACATCCTGAAGCCAATCCTGA-3′，下游5′-CTCCTGTCGCATGTCACTCC-3′；β-actin PCR引物序列：上游5′-ATTGGCAATGAGCGGTTCCG-3′，下游5′-CTGTGTTGGCGTACAGGTCT-3′，以上引物序列均由本課題組設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.3主要試劑和儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基及TRIzol Reagent購于美國Invitrogen公司；總RNA抽提試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex TaqⅡ 購于日本Takara公司；Matrigel購于美國Corning公司；ABCA1鼠源性單克隆抗體購于美國Abcam公司；表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)及p-EGFR、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)及p-STAT3兔源性多克隆抗體購于杭州華安生物技術(shù)有限公司；β-actin鼠源性單克隆抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；RIPA裂解液及BCA蛋白濃度測定試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；Immobilon ECL Ultra Western HRP底物化學(xué)發(fā)光液購于美國Millipore公司；Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)(ChemiDoc XRS+)由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche LightCycler480)由瑞士Roche公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析

1.2.1.1TIMER數(shù)據(jù)庫 通過腫瘤免疫評價(jià)數(shù)據(jù)庫(tumor immune estimation resource，TIMER，https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析ABCA1在不同腫瘤中的表達(dá)。該數(shù)據(jù)庫Diff Exp模塊可分析腫瘤中某個(gè)基因在腫瘤和相鄰正常組織之間的差異表達(dá)，使用Wilcoxon檢驗(yàn)評估差異表達(dá)的統(tǒng)計(jì)顯著性。分析流程如下：①Version: TIMER2.0；②diff Exp模塊；③ Gene Symbol: ABCA1。

1.2.1.2UALCAN數(shù)據(jù)庫 亞拉巴馬大學(xué)癌癥數(shù)據(jù)庫(University of Alabama Cancer Database，UALCAN，http://ualcan.path.uab.edu)可以用來分析基于TCGA數(shù)據(jù)庫中靶基因在腫瘤與正常組織中的表達(dá)及其與相關(guān)臨床參數(shù)的關(guān)系。篩選條件如下：①Gene symbol: ABCA1；②TCGA dataset: Stomach adenocarcinoma。

1.2.1.3Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(https://kmplot.com)可根據(jù)目的基因的各種分位數(shù)表達(dá)將患者樣本分為兩組，比較兩組患者隊(duì)列并計(jì)算95%CI的風(fēng)險(xiǎn)比和P值，分析患者生存期。篩選條件如下：①Cancer: gastric cancer；②Gene symbol: ABCA1；③ Survival: OS；④Split patients by: auto select best cutoff；根據(jù)表達(dá)水平中位數(shù)分為高、低表達(dá)組，繪制 Kaplan-Meier 生存曲線。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)和100 U/ml青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合85%左右時(shí)，按1 ∶3 消化傳代。

1.2.3shRNA與慢病毒感染 ABCA1的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)質(zhì)粒購于廣州艾基生物技術(shù)有限公司。將HEK293T細(xì)胞與pLKO.1 shRNA、psPAX2和pMD2.G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48 h，將含有病毒的上清液與聚凝胺(8 μg/ml) 混合，加入靶細(xì)胞中孵育培養(yǎng)24 h。然后使用嘌呤霉素(2 μg/ml)篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。

1.2.4RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用上海生工生物總RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 以5×105個(gè)/ml細(xì)胞接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至90%匯合后，使用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，用10 μl無菌移液器吸頭在細(xì)胞培養(yǎng)板底部劃痕，用PBS清洗去懸浮細(xì)胞，將培養(yǎng)基更換為含有0.1% FBS的RPMI-1640繼續(xù)培養(yǎng)，采集第0、24、48 h劃痕圖片，使用Image J軟件分析劃痕面積并計(jì)算劃痕愈合率。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml，取200 μl細(xì)胞接種到8 μm孔徑的Transwell小室中，下室中加入600 μl的10%FBS培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出小室。用棉簽去除上室細(xì)胞，將遷移到下孔的細(xì)胞用甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS漂洗，在200倍顯微鏡下觀察。采集并計(jì)算3個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域中的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6.2Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)液按1 ∶8稀釋，加入Transwell小室上室并放入培養(yǎng)箱中凝固過夜。收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml，每個(gè)小室內(nèi)加入細(xì)胞懸液200 μl，下室中加含20% FBS培養(yǎng)基600 μl。培養(yǎng)48 h后取出小室，用棉簽去除上室細(xì)胞，將侵襲到下室的細(xì)胞用甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS漂洗，在200倍顯微鏡下觀察，計(jì)算3個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域中的細(xì)胞數(shù)。

1.2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度。加入5×SDS蛋白上樣緩沖液充分煮沸變性。取變性蛋白30 μg經(jīng)10% SDS-PAGE電泳，利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5% BSA室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min。最后，通過Immobilon ECL Ultra Western HRP底物化學(xué)發(fā)光液發(fā)光、顯影，Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析ABCA1在胃癌中的表達(dá)及其對胃癌患者生存預(yù)后的影響通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析ABCA1在不同腫瘤類型中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示ABCA1在胃癌中過表達(dá)(P<0.001，圖1A)；基于UALCAN數(shù)據(jù)庫分析ABCA1在胃癌組織和正常組織中的表達(dá)及其在胃癌不同分期分級中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，ABCA1在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)(P<0.001，圖1B)，且其表達(dá)與胃癌分期、分級相關(guān)(圖1C、D，P<0.001)；為進(jìn)一步探究ABCA1表達(dá)與胃癌患者預(yù)后關(guān)系，利用Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析顯示，ABCA1高表達(dá)胃癌患者總生存率(overall survival，OS)低與非高表達(dá)者(圖1E，風(fēng)險(xiǎn)比HR=1.96，95%CI:1.62～2.37，P<0.000 1)。這些結(jié)果提示，ABCA1在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。

圖1 生物信息學(xué)分析胃癌中ABCA1的表達(dá)A：ABCA1在不同腫瘤中的表達(dá)；B：ABCA1在胃癌中的表達(dá)；C：ABCA1在正常胃組織及不同胃癌分級中的表達(dá)；D：ABCA1在正常胃組織及不同胃癌分期中的表達(dá)；E：ABCA1的表達(dá)水平與胃癌患者生存率的相關(guān)性；與正常組織比較：*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001

2.2 ABCA1在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況采用RT-qPCR檢測25對臨床胃癌組織樣本中ABCA1的表達(dá)情況。如圖2A所示，相比于癌旁組織，ABCA1在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.936，P=0.000 6)。此外，RT-qPCR法檢測不同胃癌細(xì)胞系中ABCA1的表達(dá)，如圖2B所示，與胃黏膜細(xì)胞GES-1相比，ABCA1在胃癌細(xì)胞系HGC-27中高表達(dá)(F=101.6，P<0.001)。Western blot結(jié)果與RT-qPCR趨勢一致(圖2C)。

圖2 ABCA1在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)A：RT-qPCR檢測25例胃癌及其對應(yīng)的癌旁組織中ABCA1的表達(dá)；B、C：RT-qPCR及Western blot檢測不同胃癌細(xì)胞系中ABCA1的表達(dá)水平；與癌旁組織比較：***P<0.001；與胃黏膜細(xì)胞系GES-1比較：###P<0.001

2.3 ABCA1對胃癌細(xì)胞侵襲、遷移及EMT的影響

2.3.1ABCA1穩(wěn)定敲低胃癌細(xì)胞系的構(gòu)建 選擇ABCA1高表達(dá)的胃癌HGC-27細(xì)胞系，利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)敲低ABCA1，通過RT-qPCR及Western blot驗(yàn)證ABCA1敲低效率(圖3)，與sh-NC組相比，shABCA1組ABCA1的表達(dá)量顯著減少，表明敲減成功(P<0.001)。

圖3 RT-qPCR及Western blot驗(yàn)證ABCA1敲減效率A、B：RT-qPCR及Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ABCA1敲低效率；a：sh-NC組；b：shABCA1-1組；c：shABCA1-2組；與sh-NC組比較：***P<0.001

2.3.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)觀察敲低ABCA1對胃癌細(xì)胞HGC-27遷移、侵襲能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h及48 h后shABCA1組劃痕愈合率均低于sh-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4A)。此外，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4B)，相較于sh-NC組，shABCA1組經(jīng)遷移穿過Transwell小室的細(xì)胞減少(F=130，P<0.001)，侵襲細(xì)胞數(shù)也減少(F=185，P<0.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即敲低ABCA1使得胃癌細(xì)胞HGC-27遷移、侵襲能力受到抑制。

圖4 ABCA1對胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲的影響A：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 ×40；B：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測遷移及侵襲穿孔細(xì)胞數(shù) ×200；a：sh-NC組；b：shABCA1-1組；c：shABCA1-2組；與sh-NC組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.3.3Western blot檢測ABCA1敲減后EMT相關(guān)蛋白的表達(dá) 為了探究ABCA1是否與胃癌EMT相關(guān)，通過Western blot檢測ABCA1敲減后EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，如圖5所示，與sh-NC組比較，shABCA1組的上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)上調(diào)(F=10.2，P<0.01)，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-鈣黏蛋白(N-cadherin)(F=22.76，P<0.01)和波形蛋白(Vimentin)表達(dá)下調(diào)(F=14.04，P<0.01)；相較于sh-NC組，shABCA1組EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Zeb1、Twist表達(dá)量受到抑制(FSnail=12.08，F(xiàn)Zeb1=11.38，F(xiàn)Twist=12.21，P<0.01)。綜上，敲低ABCA1抑制胃癌細(xì)胞EMT進(jìn)展。

圖5 ABCA1對胃癌細(xì)胞EMT的影響A：sh-NC組；b：shABCA1-1組；c：shABCA1-2組；與sh-NC組比較：**P<0.01

2.4 ABCA1對EGFR/STAT3信號通路的影響Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與sh-NC組相比，shABCA1組EGFR磷酸化水平下調(diào)(F=33.84，P<0.01)；相較于sh-NC組，shABCA1組STAT3的總表達(dá)量及磷酸化水平均降低(F=804.1，P<0.01)。見圖6。

圖6 ABCA1對EGFR/STAT3信號通路相關(guān)標(biāo)志分子的影響A：sh-NC組；b：shABCA1-1組；c：shABCA1-2組；與sh-NC組比較：**P<0.01

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，我國是胃癌高發(fā)國家，盡管早期篩查和手術(shù)及放化療提高了總體生存率，但胃癌的預(yù)后仍不樂觀[7-8]。腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是胃癌患者高復(fù)發(fā)率和高病死率的重要原因之一[9]，EMT促進(jìn)癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)表型，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著極其重要的作用[10]。因此，闡明胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找治療新靶點(diǎn)或分子生物學(xué)標(biāo)記，為胃癌的發(fā)現(xiàn)及靶向治療提供理論依據(jù)，是提高胃癌患者生存率亟待解決的關(guān)鍵問題。

ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族是一個(gè)高度保守的蛋白質(zhì)家族，研究顯示其主要參與細(xì)胞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇水平[11]。ABCA1是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的重要成員之一，被報(bào)道參與細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[4]。膽固醇是細(xì)胞質(zhì)膜的重要成分，影響胞膜的流動(dòng)性，對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持必不可少，此外，膽固醇還富含脂筏，在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用[12]。近年來，研究[13]顯示膽固醇代謝可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及EMT等生物學(xué)行為，ABCA1作為參與膽固醇代謝的重要成員，也被發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌組織中異常高表達(dá)[5]，在結(jié)直腸癌中過表達(dá)并通過促進(jìn)腫瘤生長、EMT和caveolin-1 依賴性侵襲惡化結(jié)直腸癌預(yù)后[6]，發(fā)揮著促癌功能。然而，有研究顯示ABCA1具有抗腫瘤活性，上調(diào) ABCA1 表達(dá)將抑制癌細(xì)胞增殖[14]，促進(jìn)癌細(xì)胞中線粒體介導(dǎo)細(xì)胞色素 C釋放以導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。由于目前ABCA1在腫瘤中的功能尚不十分明確， ABCA1在胃癌中的作用亦鮮有報(bào)道，因此，其在胃癌發(fā)展中的作用及機(jī)制值得探索。

在本研究中，首先通過生物信息學(xué)對胃癌中ABCA1的表達(dá)及其與胃癌患者生存預(yù)后等的相關(guān)性進(jìn)行分析，提示ABCA1 在胃癌中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步敲低ABCA1進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)，表明ABCA1有促進(jìn)胃癌侵襲、遷移及EMT等生物學(xué)行為。ABCA1通過介導(dǎo)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)來調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇含量及膽固醇脂筏水平，影響細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而影響細(xì)胞行為；此外，ABCA1部分錨定于細(xì)胞質(zhì)膜，質(zhì)膜是胞外信號傳導(dǎo)的必經(jīng)之路，故推測ABCA1在胞外信號傳導(dǎo)至胞內(nèi)過程中產(chǎn)生影響。本研究表明ABCA1可能通過調(diào)節(jié)EGFR/STAT3信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲、遷移及EMT，但ABCA1在胃癌中發(fā)揮促癌作用的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。以上研究表明，ABCA1在胃癌中發(fā)揮著促癌功能，靶向 ABCA1可能作為胃癌診斷和治療的潛在靶標(biāo)。