牙源性雙相磷酸鈣與兩種臨床骨替代材料在兔上頜竇中成骨效果的對(duì)比研究

楊 剛，劉 鑫，王元銀

在種植義齒修復(fù)中，如上頜后牙區(qū)骨量不足，行種植手術(shù)有可能穿通上頜竇壁，現(xiàn)臨床上常在上頜竇底壁與黏膜之間植入骨替代材料來(lái)增加骨量。磷酸鈣陶瓷的應(yīng)用受到了極大的關(guān)注[1]，主要是羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)和β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate, β-TCP)[2-3]。HA雖然具有骨傳導(dǎo)性，但其生物降解性較低。β-TCP在體內(nèi)降解速度偏快，不利于引導(dǎo)成骨。因此，由HA和β-TCP組合而成的雙相磷酸鈣(biphasic calcium phosphate, BCP)陶瓷被開發(fā)及應(yīng)用[4-5]。有研究[6]表明，將牙齒高溫煅燒后，可獲得雙相陶瓷生物骨。人的牙齒的化學(xué)組成和主要元素與骨組織相似，已有學(xué)者將離體牙燒結(jié)制成仿生材料，并檢測(cè)了其促進(jìn)細(xì)胞成骨分化的能力[7]。但是該材料植入體內(nèi)后形成新骨的量和質(zhì)量，以及在上頜竇環(huán)境下的骨再生能力，都有待研究。該研究制備了牙源性BCP，并檢測(cè)其與兩種臨床常用骨替代材料(Bio-Oss?和CERASORB?M β-TCP骨粉)相比，在兔上頜竇中的骨重建效果差異，為臨床治療提供新的思路和手段。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源收集口腔頜面外科臨床拔除的廢棄離體牙作為燒結(jié)原材料，制作牙源性BCP。以口腔臨床上常用的Bio-Oss和β-TCP骨粉作為對(duì)照材料。Geistlich Bio-Oss?骨填充材料來(lái)自瑞士蓋氏制藥有限公司，CERASORB?M β-TCP來(lái)自德國(guó)科盧森公司。

1.2 主要儀器及試劑MXX1600-20箱式高溫?zé)Y(jié)爐(上海微行爐業(yè)有限公司)；布魯克X射線衍射儀D8 advance(德國(guó)Bruker公司)；瓦里安710-ES電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(美國(guó)Varian公司)；GeminiSEM 300場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；SkyScan 1176 Micro-CT(德國(guó)Bruker公司)；硬組織切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；Eclipse Ci-L正置白光拍照顯微鏡(日本Nikon公司)；PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000全景切片掃描儀(匈牙利3DHISTECH公司)；Goldner染液(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為9只雄性新西蘭白兔，體質(zhì)量2.5 kg左右，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 材料制備將收集的離體牙去除牙結(jié)石、齲壞等，用牙骨錘砸成小塊，乙醇梯度脫水，烘干。將處理好的材料于燒結(jié)爐中進(jìn)行第一次煅燒：2 h升溫至400 ℃，再3 h升溫至800 ℃，至800 ℃保溫1 h，后緩慢降溫冷卻。然后置于0.1 mol/L磷酸氫二銨溶液中浸泡24 h，取出樣品后烘干。然后進(jìn)行第二次煅燒：2 h升溫至400 ℃，200 min緩慢升溫至600 ℃，再1 h升溫至800 ℃，800 ℃保溫1 h，再2 h升溫至1 150 ℃，至1 150 ℃保溫2 h，隨后進(jìn)入降溫程序。

1.5 材料檢測(cè)

1.5.1物相分析 通過布魯克D8 advance X射線衍射儀對(duì)燒結(jié)后的牙源性材料進(jìn)行物相分析，并用全峰圖擬合(WPF) 與 Rietveld 精細(xì)化方法做定量分析。檢測(cè)條件為：Cu靶，電壓30 kV，電流30 mA，掃描速度10°/min～20°/min，2θ測(cè)量范圍為10°～80°。

1.5.2元素分析 通過瓦里安710-ES全譜直讀電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀分析燒結(jié)牙源性材料的鈣磷元素比。

1.5.3掃描電鏡觀察材料表面 將牙源性BCP、Bio-Oss和β-TCP三種材料干燥、噴金處理后，用GeminiSEM 300場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察三種材料的表面特征及微觀結(jié)構(gòu)。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

1.6.1兔上頜竇開窗術(shù)及骨粉填充 將9只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)均分成以下三組：牙源性BCP和Bio-Oss骨粉，牙源性BCP和β-TCP骨粉，Bio-Oss骨粉和β-TCP骨粉。每組兔的雙側(cè)上頜竇開窗后隨機(jī)植入對(duì)應(yīng)的兩種材料。兔稱重后用3%戊巴比妥鈉1 ml/kg耳緣靜脈注射麻醉，全麻后鼻背部備皮，取俯臥位，消毒后鋪巾，并在鼻背部注射甲哌卡因作局部浸潤(rùn)。沿鼻背中線做2.5～3 cm左右的垂直切口，切開皮膚及皮下組織，剝離骨膜以暴露鼻骨、中線結(jié)合處及鼻額縫。見圖1。無(wú)菌生理鹽水冷卻下，使用種植機(jī)的環(huán)形鉆(直徑5 mm)在鼻額縫下2 cm、中線外0.5 cm處做雙側(cè)圓形骨窗，暴露完整無(wú)破損的上頜竇黏膜，可觀察到黏膜隨呼吸運(yùn)動(dòng)起伏，并留取開窗的碎骨片暫存于生理鹽水中。然后將等量的骨粉按照設(shè)計(jì)的分組填充到上頜竇的圓形骨窗中，使充滿骨窗，再將留取的骨片復(fù)位于骨窗口。最后分層對(duì)位縫合。術(shù)后密切觀察，在兔臀部肌肉注射青霉素和鏈霉素，并在術(shù)區(qū)涂抹金霉素軟膏，以預(yù)防感染，連續(xù)用藥3 d。

圖1 兔上頜竇開窗術(shù)及骨粉填充過程a:環(huán)鉆制備圓形骨窗；B：雙側(cè)骨窗制備完成；C：圓形缺損直徑5 mm；D：填充骨粉；E：骨片復(fù)位于骨窗處；F：對(duì)位縫合

1.6.2Micro-CT分析 應(yīng)用Micro-CT評(píng)估兔上頜竇開窗植骨后3個(gè)月，各材料組的新骨形成情況。取3種材料的上頜竇樣本各3份行Micro-CT掃描，通過分析系統(tǒng)獲得描述新骨質(zhì)量和數(shù)量的參數(shù)，如骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨密度(BMD)。

1.6.3組織學(xué)分析 取其余9份上頜竇樣本制作不脫鈣硬組織切片進(jìn)行組織學(xué)觀察及分析。對(duì)修剪后的組織塊行脫水、浸塑、包埋處理，在感興趣區(qū)域用硬組織切片機(jī)切出數(shù)個(gè)10 μm的薄片，并用Goldner三色法染色。結(jié)果判讀：細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，礦化骨呈綠色，非礦化骨呈橙紅色。使用正置白光拍照顯微鏡、全景切片掃描儀和掃描瀏覽軟件(CaseViewer2.4)進(jìn)行組織學(xué)觀察及圖像采集。

2 結(jié)果

2.1 牙源性BCP的物相分析及元素分析結(jié)果X線衍射結(jié)果顯示，離體牙經(jīng)上述方法燒結(jié)后，成為由HA和β-TCP組成的雙相磷酸鈣陶瓷。見圖2。定量分析顯示HA ∶β-TCP比值約為7 ∶3。元素分析結(jié)果顯示鈣磷元素比為1.627 ∶1。

圖2 牙源性燒結(jié)材料的X線衍射圖

2.2 材料的表面形貌圖3為材料表面具有代表性特征的SEM圖像。該牙源性BCP主要呈現(xiàn)兩種表面特征，一種是較光滑的一面，上有牙本質(zhì)小管開口樣的交通孔隙，形狀大小不一，以圓形和橢圓形為主，其間還存在著一些裂隙樣的孔隙，可能是燒結(jié)過程中數(shù)個(gè)小孔連接形成，形成更豐富的交通孔隙；另一種表面略粗糙，密集分布著的1 μm左右的顆粒樣結(jié)構(gòu)，外形不規(guī)則，部分呈現(xiàn)為數(shù)個(gè)小顆粒結(jié)合的形態(tài)。作為對(duì)照，Bio-Oss和β-TCP材料的表面形貌也被觀察分析，Bio-Oss表面較為平整，放大圖像顯示表面呈不規(guī)則條索狀、纖維狀。β-TCP材料完全由不規(guī)則球狀和短棒狀的小顆粒連接而成，交通孔隙較復(fù)雜。

圖3 三種骨替代材料的掃描電鏡圖A：牙源性BCP；B：Bio-Oss；C：β-TCP；1：×64；2：×200；3：×1 000；4：×2 000

2.3 動(dòng)物大體觀察術(shù)中所有樣本均未觀察到上頜竇膜穿孔。術(shù)后3 d切口附近有輕微腫脹，抗生素治療后，腫脹逐漸消退，動(dòng)物飲食等正常，無(wú)動(dòng)物死亡，傷口愈合良好。

2.4 Micro-CT檢測(cè)結(jié)果Micro-CT掃描圖像顯示竇腔內(nèi)可見由新骨與殘留顆粒組成的穹隆狀突起(圖4)。部分標(biāo)本骨窗基本愈合，部分標(biāo)本中復(fù)位在骨窗的骨片與周圍骨壁還未完全愈合生長(zhǎng)到一起，并伴有一定程度的凹陷。在牙源性BCP組和Bio-Oss材料組，新骨與殘留材料顆?；旌狭己?，新骨均勻分布在部分降解的材料顆粒之間。而在β-TCP材料組，因β-TCP降解過快，材料大部分已降解，而新骨形成速率未能跟上，在竇骨粉填充區(qū)域內(nèi)部，形成了空腔。BV/TV、BMD、骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù)等指標(biāo)的數(shù)據(jù)如表1所示。三種材料的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示(圖5)，β-TCP組的BV/TV小于BCP組(F=6.691,P<0.05)，而上述兩組與Bio-Oss組之間的BV/TV，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Tb.Th和BMD在這三組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BCP組的Tb.N大于β-TCP組(F=6.184，P<0.05)，而與Bio-Oss組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BCP組的Tb.Sp小于Bio-Oss(F=19.44，P<0.05)和β-TCP組(F=19.44，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 Micro-CT檢測(cè)的掃描圖像A：牙源性BCP；B：Bio-Oss；C：β-TCP

圖5 Micro-CT檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析A：BV/TV；B：Tb.Th；C：Tb.N；D：Tb.Sp；E：BMD；a：Bio-Oss；b：β-TCP；c：BCP；與β-TCP組比較：*P<0.05,**P<0.01；與Bio-Oss組比較：#P<0.05

表1 Micro-CT分析各指標(biāo)的值

2.5 不脫鈣硬組織切片觀察組織學(xué)圖像顯示了術(shù)后3個(gè)月上頜竇內(nèi)骨粉填充區(qū)Goldner三色染的結(jié)果(圖6)。三種材料的骨抬高區(qū)均呈穹隆狀突起，但是BCP組和Bio-Oss組的突起更明顯，該區(qū)域內(nèi)新骨形成均勻，新骨與材料表面密切接觸，一些不規(guī)則的材料表面可能是由于材料顆粒的降解造成的。而β-TCP組，由于材料降解過快，新骨形成速率稍慢，在提升區(qū)域內(nèi)可見較大的空腔，可能是由此引起的空間塌陷，導(dǎo)致β-TCP組的骨提升高度較低。圖中可見，在骨粉顆粒間形成了深綠色的礦化程度較高的新骨和淺綠色的低礦化度新骨，具有骨小梁結(jié)構(gòu)。低礦化度骨存在編織狀骨小梁；而高礦化度骨是板層狀骨，代表骨已成熟。在部分低礦化度的新骨表面觀察到了黃色的成骨細(xì)胞。在Bio-Oss組，材料顆粒和新骨之間還夾雜著部分橙紅色區(qū)域，是未礦化的類骨質(zhì)。

圖6 不脫鈣硬組織切片Goldner染色A：牙源性BCP；B：Bio-Oss；C：β-TCP；1：×1.5；2：上圖方框區(qū)域放大圖像 ×15

3 討論

在臨床種植修復(fù)中廣泛應(yīng)用的骨替代材料是Bio-Oss骨粉，其理化性質(zhì)與人體骨組織相似，且保留了天然小牛骨的多孔結(jié)構(gòu)，但是其價(jià)格昂貴且難以完全降解吸收。在對(duì)骨替代材料的廣泛研究中，自體牙應(yīng)用技術(shù)逐漸被重視。但是自體牙骨替代材料在臨床上的應(yīng)用也是受限制的，因?yàn)檫@需要患者恰有智齒或難以通過治療、修復(fù)保存下來(lái)的患牙需要拔除。而且，同種異體或異種的牙源性骨替代材料的安全性仍待研究驗(yàn)證。有研究[8-9]表明，脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)(DDM)具有骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性；對(duì)自體牙行脫水、脫脂、脫礦、凍干、環(huán)氧乙烷消毒等處理后可以得到自體牙骨移植材料(AutoBT)[10]；牙齒高溫煅燒處理后制成牙粉可用于骨再生[7],且煅燒去除了有機(jī)成分，消除了免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。有研究[11]表明AutoBT在臨床應(yīng)用中成骨能力強(qiáng)，可以維持種植體的穩(wěn)定性。本研究將另一種牙骨移植材料燒結(jié)牙粉應(yīng)用在上頜竇模型中，再與臨床常用的Bio-Oss和β-TCP材料的骨重建效果作對(duì)比，為牙源性骨替代材料的臨床應(yīng)用提供新的依據(jù)。

本研究采用燒結(jié)技術(shù)制備了由70%的HA和30%的β-TCP組成的牙源性BCP支架。高溫煅燒處理完全去除了牙齒中的有機(jī)物，其無(wú)機(jī)成分與骨類似，而且制作成本低。牙源性BCP的特點(diǎn)是具有HA和β-TCP在同一顆粒內(nèi)的存在和均勻分布，具有相互連接的孔隙，細(xì)胞先在材料表面黏附和增殖，隨著材料顆粒的生物降解，細(xì)胞會(huì)增殖長(zhǎng)入材料的內(nèi)部。

制備方法及原材料的差異會(huì)影響磷酸鈣陶瓷的形狀、孔隙和表面形貌等，這些因素都可能影響其成骨能力[12-13]。本研究中的牙源性BCP在掃描電鏡下的圖像顯示出牙本質(zhì)小管開口樣孔隙和顆粒樣結(jié)構(gòu)這兩種特征。有研究[14]表明，具有良好表面特性和豐富交通孔隙的磷酸鈣陶瓷有利于細(xì)胞的黏附增殖，可以促進(jìn)礦物質(zhì)的沉積和蛋白質(zhì)的吸附，從而影響骨再生效果。

術(shù)后3個(gè)月的影像學(xué)和組織學(xué)圖像都顯示，BCP和Bio-Oss材料更適合作為上頜竇區(qū)域的骨替代材料，而β-TCP材料降解過快，不易維持空間穩(wěn)定。Micro-CT的數(shù)據(jù)分析表明，該牙源性BCP具有更高的骨體積分?jǐn)?shù)，更多的新骨形成，骨小梁的微結(jié)構(gòu)分析也顯示BCP組的新骨質(zhì)量更佳。

在上頜竇區(qū)域的植骨術(shù)中，受解剖結(jié)構(gòu)的限制，其植骨材料的應(yīng)用也有別于其他骨缺損。與具有多面骨壁的缺損相比，上頜竇區(qū)植骨后，骨替代材料往往只能貼合于周壁和底壁，而其成骨最初可能是從周壁或底壁開始，然后呈向心性進(jìn)展，逐步取代骨替代材料。本研究中，β-TCP組的組織學(xué)結(jié)果(圖6C)也證實(shí)了這一點(diǎn)，靠近骨窗周圍骨壁的新骨形成量更多，其新骨密度也更大，而骨窗中心區(qū)域可見大塊的材料顆粒聚集。不過在BCP和Bio-Oss組卻未觀察到這種分布趨勢(shì)，其新骨形成更均勻。當(dāng)然，該BCP材料來(lái)源于人離體牙，Bio-Oss材料來(lái)源于小牛骨，它們應(yīng)用在兔上頜竇中獲得了良好成骨效果，但是由于種族差異和解剖結(jié)構(gòu)差異等，該材料應(yīng)用在人體上的效果仍有待進(jìn)一步研究。

BCP材料植入體內(nèi)后，β-TCP部分迅速被吸收，提供成骨空間，而HA部分可以存在較長(zhǎng)時(shí)間，增加體積的穩(wěn)定性。BCP的降解率介于純HA和純?chǔ)?TCP之間，而不同HA/β-TCP比例的雙相磷酸鈣已在骨缺損修復(fù)中被廣泛研究及臨床應(yīng)用[15]。在后續(xù)的研究中，可制備不同HA/β-TCP比例的牙源性BCP，更深入地研究牙源性燒結(jié)BCP的性能及它在上頜竇中的成骨效果和穩(wěn)定骨重建體積的效果等。