菖蒲郁金湯對帕金森病小鼠的神經(jīng)保護作用及機制探討

吳憂 朱虹 張厚文 徐彬 侯伯南 徐林勝 梁順利

浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院 浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 杭州 310005

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是目前第二大神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，隨著人口老齡化進程的加劇，發(fā)病率仍在逐漸上升，嚴重威脅人類健康。目前PD臨床治療以藥物為主，常用西藥左旋多巴制劑等長期療效不佳，而中醫(yī)藥具有天然、少毒、協(xié)同作用好等特點，在本病的長期防治中具有獨特優(yōu)勢。PD的中醫(yī)病機復雜，多數(shù)學者認為其以肝腎虧虛、氣血陰陽不足為本，在本虛基礎上形成了風、痰、火、瘀等病理改變[1]，因此熄風化痰、祛瘀通絡法為PD常用的中醫(yī)辨證治療方法。菖蒲郁金湯為化痰祛瘀常用湯劑，適用于PD的中醫(yī)治療，但其作用機制尚不明確，限制了臨床推廣，因此目前在PD臨床治療中的應用相對較少。為此，本實驗通過小鼠腹腔內(nèi)注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）建立亞急性PD小鼠模型，采用菖蒲郁金湯進行干預治療，評價菖蒲郁金湯對PD小鼠行為學癥狀、中腦黑質(zhì)多巴胺能（dopamine，DA）能神經(jīng)元的存活、紋狀體神經(jīng)元超微結構變化、神經(jīng)元自噬活性以及α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-Syn）表達的影響，明確菖蒲郁金湯對PD小鼠的神經(jīng)保護作用并探討其相關機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性C57BL/6小鼠36只，8～10周齡，體質(zhì)量18～22 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005]，飼養(yǎng)于清潔級、正壓屏障系統(tǒng)，12 h光照和黑暗交替，自由攝食和飲水，設施和飼料均來自浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心[實驗動物使用許可證：SYXK（浙）2021-0012]。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學實驗動物管理與倫理委員會審批通過（倫理審批號：20180604-01）。

1.2 主要試劑及儀器 MPTP、小鼠抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）多克隆抗體均購于美國Sigma公司（批號：M0896、ab112）；兔抗微管相關蛋白1 輕鏈3B（microtubule -associated protein 1 light chain 3 Beta，LC3B）單克隆抗體購于美國Abcam公司（批號：EPR18709）；小鼠抗α-Syn單克隆抗體購于美國Santa公司（批號：sc-12767）；山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin，IgG）抗體、山羊抗小鼠IgG抗體均購于美國CST公司（批號：7074、7076）；鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體購于杭州華安生物技術有限公司（批號：EM1101）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術研究所（批號：P0012）。

RBMS-200C小鼠大腦冠狀切片模具購于美國Kentscientific公司；RM2235切片機為德國Leica公司產(chǎn)品；Odyssey CLX激光成像儀購于美國Licor公司。

1.3 菖蒲郁金湯藥物制備 由石菖蒲9 g，溫郁金6 g，炒梔子9 g，牡丹皮9 g，鮮竹葉9 g，連翹6 g，燈心草6 g，木通4.5 g，淡竹瀝15 g，玉樞丹1.5 g組成，藥材來源于本院中藥房。將石菖蒲、溫郁金、鮮竹葉、炒梔子、牡丹皮、連翹、燈心草、木通以10倍的純水浸泡，30 min后同煎，武火煎至沸騰，然后再用文火繼續(xù)煎30 min，兩煎后將余下的藥渣另加5倍的純水，再煎30 min，兩次煎的藥汁加入淡竹瀝、玉樞丹沖泡，然后濃縮成濃度為2 g·mL-1的生藥，裝瓶壓蓋，真空包裝儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PD動物模型制備及分組給藥 參照文獻[2]，按照以下方法制備小鼠亞急性PD模型：用0.9%氯化鈉溶液將MPTP稀釋至濃度為1 mg·mL-1，劑量為30 mg·kg-1，對小鼠進行腹腔注射，1次/d，共7 d。采用懸掛實驗評價小鼠行為學癥狀，并取中腦黑質(zhì)腦組織行TH免疫組化染色，觀察DA能神經(jīng)元存活情況。懸掛實驗分數(shù)≤2分，且中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元數(shù)目較正常對照明顯減少，即為造模成功。

小鼠按照隨機數(shù)字表法共分為正常對照組、MPTP模型組、菖蒲郁金湯組，每組12只。MPTP模型組和菖蒲郁金湯組按照上述方法建立PD模型，菖蒲郁金湯組在MPTP注射的同時開始給予20 g·kg-1菖蒲郁金湯生藥灌胃，1次/d，共21 d。正常對照組給予30 mg·kg-1無菌0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，1次/d，共7 d。

1.5 行為學檢測 最后1次給藥結束后1、7、14 d，對各組小鼠進行下述行為學檢測，檢測均在上午9～12點進行，保證實驗環(huán)境清潔。

1.5.1 爬桿實驗 制作一長50 cm、直徑1 cm的木桿，頂端放一木塞，小鼠放置在木塞上，計時1 min，然后將木塞倒立放置，小鼠自動向上爬行，測定記錄小鼠的爬桿時間，每只小鼠共測3次，每次間隔時間30 min，取平均值為最終爬桿時間。

1.5.2 懸掛實驗 將小鼠兩前肢懸掛于水平電線上，若小鼠用兩只后肢抓電線記3分，一只后肢抓電線記2分，兩只后肢都不能抓電線記1分，小鼠直接落下記0分。

1.5.3 曠場實驗 參照文獻[3]方法制作實驗曠場，先讓小鼠在曠場內(nèi)自由活動10 min，適應環(huán)境，隨后將其放入曠場中央?yún)^(qū)域，記錄小鼠在曠場內(nèi)活動的總距離和活動平均速度，每只小鼠測定15 min。

1.6 標本采集 各組小鼠完成最后一次行為學檢測后，采用0.3%戊巴比妥鈉0.025 mL·g-1腹腔注射麻醉，穿刺左心室，以4 ℃的0.9%氯化鈉溶液快速全身灌注，直至右心耳處流出的液體澄清。每組隨機取8只小鼠，斷頭，取腦，置于冰上，應用腦冠狀切片模具快速切取中腦處黑質(zhì)部位腦組織（Bregma-2.8～-3.8），其中一半置于4%多聚甲醛中固定24 h，隨后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，5 μm連續(xù)切片，4 ℃保存，后期進行免疫組化染色；另一半置于-80 ℃液氮中保存，后期進行免疫印跡法檢測。每組剩下的4只小鼠，取約1 mm×1 mm×1 mm紋狀體腦組織，2.5%戊二醛固定，常溫保存，進行透射電鏡檢測。

1.7 TH免疫組化染色檢測DA能神經(jīng)元 取制備好的小鼠中腦黑質(zhì)腦組織切片，采用水浴法進行抗原修復，室溫條件下孵育，血清封閉，小鼠抗TH抗體按照1:500的比例進行稀釋，然后滴加至切片上，4 ℃過夜，滴加二抗，室溫條件下孵育，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，磷酸鹽緩沖液返藍后梯度乙醇中脫水，封片后光鏡觀察。觀察黑質(zhì)部位染色呈陽性的神經(jīng)元，高倍鏡下各組隨機選取10個視野，計數(shù)TH染色陽性細胞數(shù)，并觀察其形態(tài)變化。

1.8 透射電鏡觀察細胞超微結構 取制備好的小鼠紋狀體腦組織塊，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，1%的鋨酸溶液中固定1～2 h，漂洗3次后梯度乙醇脫水，包埋劑梯度滲透，分裝后包埋，70 ℃加熱過夜，50～70 nm超薄切片，檸檬酸鉛溶液染色15 min，醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液中染色15 min，透射電鏡觀察。

1.9 免疫印跡法檢測自噬蛋白LC3B和α-Syn的蛋白表達 將冰凍組織分剪成碎片，以蛋白裂解液進行裂解，提取總蛋白，100 ℃條件下變性5 min，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，室溫封閉2 h，分別加入α-Syn 抗體（稀釋比例：1:200）、LC3B抗體以及內(nèi)參蛋白抗體（稀釋比例均為：1∶2 000），4 ℃過夜，滴加辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記二抗（稀釋比例：1∶2 000），室溫條件下孵育2 h 后，置于增強型化學發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）工作液中，反應2 min后封閉，暗室內(nèi)進行感光、顯影和定影，分析蛋白條帶，以GAPDH為內(nèi)參，計算蛋白的相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以表示，各組間數(shù)據(jù)比較應用單因素方差分析，兩組線性數(shù)據(jù)相關程度分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為有差異統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠行為學癥狀比較 與正常對照組比較，MPTP模型組小鼠1、7、14 d的爬桿時間均顯著延長（均P＜0.01）。與MPTP模型組比較，菖蒲郁金湯組小鼠1 d時爬桿時間縮短（P＜0.05），7、14 d時爬桿時間進一步縮短（均P＜0.01）。與正常對照組比較，MPTP模型組小鼠1、7、14 d的懸掛實驗分值均明顯降低（均P＜0.01）。與MPTP模型組比較，菖蒲郁金湯組小鼠1 d時懸掛實驗分值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），7、14 d時懸掛實驗分值均增加（均P＜0.05）。與正常對照組比較，MPTP模型組小鼠1、7、14 d曠場實驗活動總距離和平均速度均降低（均P＜0.01）。與MPTP模型組比較，各時間點菖蒲郁金湯組小鼠活動總距離和平均速度均顯著增加（P＜0.01）。見圖1。提示菖蒲郁金湯可明顯改善PD小鼠的各種行為學癥狀。

圖1 各組小鼠行為學測試結果Fig.1 Behavioral test results of mice in each group

2.2 各組小鼠中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元存活情況比較TH免疫組化染色可見，MPTP模型組小鼠中腦黑質(zhì)TH染色陽性神經(jīng)元排列非常稀疏紊亂，胞質(zhì)染色淡，突起明顯細短。菖蒲郁金湯組小鼠中腦黑質(zhì)TH染色陽性神經(jīng)元排列相對密集有序，染色濃度較MPTP模型組深，突起變長。高倍鏡下可見，MPTP模型組小鼠TH染色陽性神經(jīng)元的數(shù)目較正常對照組顯著減少（P＜0.01），菖蒲郁金湯組小鼠TH染色陽性神經(jīng)元的數(shù)目較MPTP模型組顯著增加（P＜0.01）。見圖2。提示菖蒲郁金湯可增加PD小鼠中腦DA能神經(jīng)元的存活。

圖2 各組PD小鼠中腦黑質(zhì)TH免疫組化染色情況（40×，標尺=50 μm）Fig.2 TH immunohistochemical staining of substantia nigra of PD mice in each group（40×，ruler=50 μm）

2.3 各組小鼠紋狀體組織細胞超微結構比較 正常對照組小鼠紋狀體神經(jīng)元呈橢圓形，排列緊密，包膜構造較完整，胞內(nèi)無蛋白聚集，線粒體膜結構完整，內(nèi)嵴清晰可見。MPTP模型組神經(jīng)元結構明顯破壞，胞質(zhì)水腫、空泡變性，核固縮變小，線粒體膜結構破壞，嵴模糊不清；菖蒲郁金湯組神經(jīng)元部分結構破壞，胞質(zhì)水腫、空泡變性現(xiàn)象較MPTP模型組減輕，線粒體膜結構相對完整，部分可見自噬溶酶體。見圖3。

圖3 各組小鼠紋狀體電鏡下細胞超微結構變化（醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色，30 000×）Fig.3 Ultrastructural changes of striatum cells in each group under electron microscope（uranyl acetate-lead citrate double staining，30 000×）

2.4 各組小鼠中腦α-Syn以及自噬蛋白LC3B蛋白表達比較 與正常對照組比較，MPTP模型組和菖蒲郁金湯組中腦α-Syn蛋白表達均明顯增加（P＜0.01）；與MPTP模型組比較，菖蒲郁金湯組α-Syn蛋白表達減少（P＜0.01）。見圖4A、4C。

與正常對照組比較，MPTP模型組和菖蒲郁金湯組小鼠腦內(nèi)微管相關蛋白1輕鏈3B-Ⅱ（microtubuleassociated protein 1 light chain 3 Beta-Ⅱ，LC3B-Ⅱ）/微管相關蛋白1 輕鏈3B-Ⅰ（microtubule-associated protein 1 light chain 3 Beta-Ⅰ，LC3B-Ⅰ）比值均增高（P＜0.01）；與MPTP模型組比較，菖蒲郁金湯組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值則明顯增高（P＜0.01）。見圖4B、4D。

圖4 各組小鼠黑質(zhì)α-Syn和LC3B蛋白表達情況Fig.4 Protein expression of α-Syn and LC3B in substantia nigra of each group

2.5 PD小鼠中腦LC3B蛋白與α-Syn及DA能神經(jīng)元存活的相關性 MPTP模型組和菖蒲郁金湯組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ相對表達量與α-Syn蛋白相對表達量呈負相關（r=-0.825，P＜0.01），LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ相對表達量與中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元存活數(shù)目呈正相關（r=0.756，P＜0.01）。見圖5。

圖5 LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表達與α-Syn的蛋白表達、DA能神經(jīng)元存活數(shù)的相關性Fig.5 Correlation of LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰexpression with α-Syn protein expression and surviving number of DA neurons

3 討論

黑質(zhì)致密區(qū)DA能神經(jīng)元進行性死亡以及胞質(zhì)內(nèi)路易小體是PD的主要病理特征，異常聚集的α-Syn為路易小體的主要成分。PD患者的腦內(nèi)存在自噬溶酶體途徑障礙，研究認為這正是致使α-Syn出現(xiàn)異常聚集的重要原因，在PD的發(fā)病過程中起著關鍵作用[4-6]。近年來，激活自噬、恢復細胞的自噬溶酶體功能，從而促進腦內(nèi)異常聚集α-Syn的清除，已成為治療PD的一個新策略[7-8]，但目前尚缺少能基于此理論有效應用于臨床的藥物。中醫(yī)藥具有天然、少毒、協(xié)同作用強等特點，在PD的長期防治中有著很好的臨床應用前景，研究表明多種中草藥及其活性成分可通過抗炎、抗凋亡、抗氧化應激、激活自噬等途徑治療PD[9-11]。因此，基于PD的發(fā)病機制探尋有效的中藥可能是解決PD治療難題的一個方向。

中醫(yī)認為，痰瘀機制在PD的病程發(fā)展過程中起著重要作用，化痰祛瘀法為PD常用的中醫(yī)辨證治療方法。菖蒲郁金湯為化痰祛瘀常用復方，出自《溫病全書》，方中石菖蒲辛溫，化濕痰、開竅；郁金辛寒，行氣開郁；連翹配竹葉，輕清宣透，泄?jié)駸嵝皻猓荒就ㄅ涑礂d子、燈心草導濕熱；竹瀝苦寒，清化痰熱而開其竅；牡丹皮行血脈，瀉血中伏熱；玉樞丹為成藥，避穢化濁。諸藥配伍具有辟穢化痰、解毒清熱、醒腦開竅之效，適用于以痰瘀為主要病機的病癥的治療。有學者將石菖蒲、郁金與益智仁聯(lián)用，治療合并智能減退的PD患者，認為此法可扶臟腑之本，治痰瘀之標，上下同治，具有良效[12]。本研究結果表明，菖蒲郁金湯可以改善PD小鼠的運動功能障礙，增加中腦DA能神經(jīng)元的存活，由此明確了菖蒲郁金湯對PD具有神經(jīng)保護作用。

中醫(yī)理論認為，精微物質(zhì)滯留體內(nèi)，五臟不能運化，日久則為痰瘀，現(xiàn)代醫(yī)學中破損的細胞器、異常聚集的蛋白質(zhì)等病理性代謝產(chǎn)物，皆屬于中醫(yī)中的痰瘀之邪。細胞自噬程序可清除降解病理產(chǎn)物，自噬障礙則會導致痰瘀聚集，PD中α-Syn的異常聚集則是痰瘀聚集的具體表現(xiàn)?；奠铕鲋兴幹委烶D很可能是通過增強自噬的機制來實現(xiàn)。研究表明，石菖蒲揮發(fā)油的主要成分β-細辛醚可減少α-Syn聚集，保護PD大鼠中腦神經(jīng)元免受損傷[13]，可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激自噬的機制發(fā)揮作用[14]。前期研究證實，石菖蒲和郁金的主要單體成分姜黃素可有效改善PD小鼠的行為學癥狀，減輕PD細胞損傷，激活自噬，促進α-Syn的清除是其發(fā)揮對DA能神經(jīng)元保護作用的主要機制[15-16]?；诖?，本研究進一步探討了菖蒲郁金湯用于治療PD的可能機制。自噬特異蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值是目前公認的自噬活性評價指標[17]，本研究發(fā)現(xiàn)，菖蒲郁金湯干預后，PD小鼠中腦黑質(zhì)自噬蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值增加，且PD小鼠的LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值與α-Syn表達呈負相關，與DA能神經(jīng)元的存活數(shù)呈正相關，提示菖蒲郁金湯增強了中腦黑質(zhì)神經(jīng)元自噬活性，且增強的自噬活性有效促進了α-Syn的清除，減少了DA能神經(jīng)元的損傷。

黑質(zhì)-紋狀體通路是PD運動調(diào)節(jié)的重要通路，近期研究發(fā)現(xiàn)，一種富集于紋狀體的Ras同源蛋白（the Ras homolog enriched in striatum，Rhes）可通過調(diào)節(jié)紋狀體自噬，而影響PD小鼠的運動障礙，可能成為PD治療的一個藥理靶點[18]，因此本研究進一步通過電鏡觀察了紋狀體超微結構變化和自噬溶酶體情況，結果顯示菖蒲郁金湯治療后紋狀體神經(jīng)元損傷減輕，同時胞質(zhì)內(nèi)自噬溶酶體也增多，提示菖蒲郁金湯還可保護紋狀體神經(jīng)元，增強其自噬活性。

綜上所述，菖蒲郁金湯可改善PD小鼠的行為障礙，對PD的DA能神經(jīng)元具有保護作用，增強神經(jīng)元自噬活性，從而促進α-Syn的自噬性清除是其主要作用機制之一。作為化痰祛瘀常用復方，菖蒲郁金湯在PD的長期防治中有較大的潛力，但目前相關的機制研究非常有限，限制了其臨床推廣，該復方通過何種通路或途徑調(diào)節(jié)自噬等具體機制期待今后更深入研究予以探討。