槲皮素對多囊卵巢綜合征大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖與凋亡的影響研究

江雪娟 陳曉菲 俞佳 王晨曄 胡慧敏 丁彩飛

浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 杭州 310005

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育齡女性常見的生殖內(nèi)分泌及代謝疾病，臨床多表現(xiàn)為排卵障礙、肥胖、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、脂代謝異常等[1]。IR是上述疾病的中心環(huán)節(jié)，IR導(dǎo)致的高胰島素血癥增加了患者罹患2型糖尿病、肥胖以及心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。目前，PCOS的發(fā)病原因及機(jī)制尚未完全闡明，給臨床診斷和治療帶來較大阻礙。

槲皮素（quercetin，Q）生物學(xué)活性較高且藥理作用廣泛，具有降糖、降脂、抗氧化損傷等作用[3]。晚期糖基化終末產(chǎn)物/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycation end products/receptor of advanced glycation end products，AGEs/RAGE）信號通路是體內(nèi)糖代謝信號通路之一，不僅與IR密切相關(guān)，同時也對細(xì)胞的生長、凋亡具有顯著的調(diào)控作用。既往研究提出，槲皮素可以改善PCOS大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)[4]，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。因此本研究以此作為切入點(diǎn)，探究槲皮素是否通過調(diào)控AGEs/RAGE 信號通路改善PCOS大鼠IR和排卵障礙，明確其治療PCOS的分子機(jī)制，對今后研究PCOS伴IR提供一種新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 四甲基偶氮唑鹽[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]試劑盒購于上海BBI Life Sciences公司（批號：E606334-0500）；大鼠孕激素/孕酮（proges terone/progesterone，PROG）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、大鼠雌二醇（estradiol，E2）ELISA試劑盒均購于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司（批號：MM-0551R2、MM-0575R2）；大鼠黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、雄激素（testosterone，T）ELISA試劑盒均購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司（批號：ml002860、ml059506）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司（批號：556547）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：S0033S）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（批號：CW2569）；AGEs多克隆抗體購于北京Bioss公司（批號：BS-1158R）；RAGE、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular singnal regulated protein kinases，ERK1/2）、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（phospho-extracellular singnal regulated protein kinases 1/2，phospho-ERK1/2）、p38有絲分裂原蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）、磷酸化p38有絲分裂原蛋白激酶（p38 phospho-mitogen-activated protein kinase，phospho-p38 MAPK）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購于江蘇Affinity公司（批號：AF5309、AF0155、AF1015、BF8015、AF4001、AF7021）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 TS-2倒置熒光顯微鏡購于日本尼康公司；C6流式細(xì)胞儀購于美國BD公司；CFX Connect實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）儀為BIO RAD公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雌性SD大鼠30只，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005]，21～23 d齡，體質(zhì)量（60±10）g，飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（浙）2020-0024]，本研究動物倫理已獲得杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心許可（倫理批準(zhǔn)號：EYOUNG-20201230-03）。

1.4 伴IR的PCOS大鼠模型的建立 隨機(jī)選擇10只大鼠作為正常對照組，20只作為模型組。大鼠飼喂普通飼料1周后，PCOS模型組每日飼喂高脂飼料并以1%羧甲基纖維素（carboxyl methyl cellulose，CMC）溶解的來曲唑液0.4 mL灌胃，劑量1 mg/（kg·d），對照組灌胃同體積1%CMC，連續(xù)灌胃23 d，模型建立參照Sun等[5]的研究。自23 d起進(jìn)行陰道涂片觀察，以陰道涂片提示失去完整動情周期作為PCOS大鼠建模成功的標(biāo)志。

1.5 方法

1.5.1 卵巢顆粒細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及鑒定 PCOS模型大鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG），50 U/只，2 d 后脫頸處死。紫外照射后分離雙側(cè)卵巢，于滅菌0.9%氯化鈉溶液中保存。剔除卵巢表面包膜及脂肪組織，再次以0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行清洗，最后放入達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基/F12（Dulbecco's Modified Eagle Media/F12，DMEM/F12）中。利用空針針頭刺破卵泡，將釋放的細(xì)胞置于培養(yǎng)基中，并用巴氏管吹打，過篩。收集細(xì)胞懸液，取20 mL單細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL，加入適量含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。光鏡觀察，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色鑒定，觀察卵巢顆粒細(xì)胞的形態(tài)及核質(zhì)分布。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù) 細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，將來自PCOS大鼠的顆粒細(xì)胞隨機(jī)分成6組，PCOS組、PCOS+4-氯-N-環(huán)己基-N-（苯基甲基）苯甲酰胺[（N-benzyl-4-chloro-N-cyclohexylbenzamide，F(xiàn)Z）500 nmol·L-1]組、PCOS+L-Q（槲皮素低劑量0.5 μg·mL-1）組、PCOS+H-Q（槲皮素高劑量1 μg·mL-1）組、PCOS+H-Q+FZ（槲皮素高劑量1 μg·mL-1+FZ 500 nmol·L-1）組、PCOS+二甲雙胍（metformin hydrochloride，MH）組，MH用藥劑量參考Huang等[6]的實(shí)驗(yàn)研究，另取正常大鼠的顆粒細(xì)胞作為對照組。阻斷劑組以FZ預(yù)處理30 min，各組培養(yǎng)2 d后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.5.3 MTT檢測細(xì)胞活力

1.5.3.1 MTT檢測槲皮素對正常顆粒細(xì)胞活力的影響 細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后，按每孔2×103個的數(shù)量接種于96孔板，每孔200 mL，設(shè)置5個復(fù)孔。給予不同濃度槲皮素（0、0.01、0.1、1、10 μg·mL-1）處理24、48 h，利用MTT法測定細(xì)胞活力。

1.5.3.2 MTT檢測不同藥物處理對PCOS顆粒細(xì)胞活力的影響 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，按每孔2×103個的數(shù)量接種于96孔板，每孔200 mL，設(shè)置5個復(fù)孔。各組別參照1.5.2中給藥劑量并設(shè)對照組處理24、48 h，利用MTT法測定細(xì)胞活力。

1.5.4 ELISA檢測激素含量 按照ELISA試劑盒操作說明，測定細(xì)胞上清液中E2、P、FSH、LH和T的含量。

1.5.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞以每孔1.2×106個的數(shù)量接種于6孔板中，按照分組給藥處理24 h后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL。依次加入500 μL結(jié)合緩沖液，棄去上清液，再次加入100 μL結(jié)合緩沖液后混勻，分別加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記磷脂結(jié)合蛋白（Annexin-fluorescein isothiocyanate isomer，AnnexinⅤ-FITC）5 μL與碘化丙啶（propidium iodide，PI）10 μL，避光孵育后再次加入400 μL結(jié)合緩沖液，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡。

1.5.6 ROS活性檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化后制成1×105/mL細(xì)胞懸液，加入24孔板中，然后加入2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯50 μL，37 ℃下避光孵育20 min，洗滌后倒置顯微鏡觀察并拍攝圖像。

1.5.7 Real-time qPCR檢測RAGE、Bax、Bcl-2及炎性介質(zhì)HMGB1的mRNA表達(dá) 收集細(xì)胞，提取RNA，配置反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及Real-time qPCR反應(yīng)，檢測RAGE、Bax、Bcl-2及炎性介質(zhì)HMGB1的mRNA表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5.8 免疫印跡法檢測AGEs、RAGE、MAPK、ERK蛋白水平 收集細(xì)胞，裂解后提取總蛋白，電泳和轉(zhuǎn)膜后，加入一抗、二抗孵育，化學(xué)發(fā)光顯影，檢測AGEs、RAGE、MAPK、ERK蛋白水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析，同組間采用SNK分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢顆粒細(xì)胞的鑒定結(jié)果 光鏡下大鼠卵巢顆粒細(xì)胞生長旺盛，形態(tài)多呈梭形或多邊形。HE染色顯示，貼壁細(xì)胞邊緣清晰、形態(tài)完整，核染成藍(lán)紫色，胞質(zhì)為淡粉色。見圖1。

圖1 卵巢顆粒細(xì)胞的鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of ovarian granulosa cells

2.2 各組細(xì)胞活力比較 對于正常大鼠顆粒細(xì)胞，給予不同濃度的槲皮素處理后，僅10 μg·mL-1組細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而在PCOS大鼠顆粒細(xì)胞中，與對照組比較，PCOS組細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.01）。與PCOS組比較，藥物作用24 h后，PCOS+H-Q+FZ組和PCOS+MH組細(xì)胞活性顯著升高（P＜0.01）；藥物作用48 h后，PCOS+FZ組、PCOS+H-Q組、PCOS+H-Q+FZ組和PCOS+MH組細(xì)胞活性均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞活力比較Fig.2 Comparison of cell viability in each group

2.3 各組細(xì)胞中激素含量比較 與PCOS組比較，PCOS+FZ 組、PCOS+H-Q 組、PCOS+H-Q+FZ 組 和PCOS+MH組細(xì)胞中E2、LH、T的含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組細(xì)胞E2、P、FSH、LH、T含量比較Tab.2 Comparison of contents of E2，P，F(xiàn)SH，LH and T in each group（）

表2 各組細(xì)胞E2、P、FSH、LH、T含量比較Tab.2 Comparison of contents of E2，P，F(xiàn)SH，LH and T in each group（）

注：與PCOS組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。Note: Compared with PCOS group，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01.

2.4 各組細(xì)胞凋亡情況比較 與PCOS 組比較，PCOS+FZ 組、PCOS+H-Q 組、PCOS+H-Q+FZ 組 和PCOS+MH組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞凋亡情況比較Fig.3 Comparison of cell apoptosis in each group

2.5 各組卵巢顆粒細(xì)胞中ROS活性比較 與PCOS組比較，PCOS+FZ組、PCOS+H-Q組、PCOS+H-Q+FZ組和PCOS+MH組卵巢顆粒細(xì)胞中ROS的熒光強(qiáng)度顯著減弱（P＜0.05，P＜0.01），說明細(xì)胞中ROS活性顯著降低。見圖4。

圖4 各組卵巢顆粒細(xì)胞中ROS熒光表達(dá)情況Fig.4 ROS fluorescence expression in ovarian granulosa cells of each group

2.6 各組細(xì)胞RAGE、Bax、Bcl-2及HMGB1的mRNA表達(dá)比較 與PCOS組比較，PCOS+H-Q組、PCOS+H-Q+FZ 組、PCOS+MH 組中RAGE、HMGB1 及Bax mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞RAGE、Bax、Bcl-2及HMGB1的mRNA表達(dá)比較Fig.5 Comparison of mRNA expression of RAGE，Bax，Bcl-2 and HMGB1 in each group

2.7 各組細(xì)胞AGEs/RAGE及ERK/MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與PCOS 組比較，PCOS+FZ 組、PCOS+H-Q、PCOS+H-Q+FZ組和PCOS+MH組AGEs和RAGE 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），PCOS+H-Q組、PCOS+H-Q+FZ組和PCOS+MH組中的p-ERK和p-p38MAPK 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖6。

圖6 各組細(xì)胞AGEs、RAGE、p-ERK、ERK、p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表達(dá)比較Fig.6 Comparison of protein expressions of AGEs，RAGE，p-ERK，ERK，p-p38MAPK and p38MAPK in each group

3 討論

PCOS屬于生殖障礙與代謝紊亂并存的疾病，臨床治療雖然可使患者獲得一定質(zhì)量的卵母細(xì)胞，但是卻無法獲得較多高質(zhì)量的成熟卵母細(xì)胞[7-8]，因此積極深入探究其發(fā)病機(jī)制是如今PCOS研究的關(guān)鍵問題。本研究首先通過MTT法檢測細(xì)胞活力，以確定槲皮素的合適干預(yù)濃度。以連續(xù)灌胃來曲唑并配合高脂飼料的方式，建立PCOS大鼠模型，并將陰道涂片失去完整動情周期作為模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。T增高作為本病的典型內(nèi)分泌改變，與月經(jīng)稀發(fā)、無排卵、不孕等密切相關(guān)。本研究提示，槲皮素干預(yù)后性激素水平也得到改善，提示槲皮素在改變PCOS大鼠異常性激素水平方面有較好的潛能，并且高劑量組改善效果更為明顯。Jahan等[9]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素處理22 d后，PCOS大鼠卵巢直徑以及囊性卵泡的直徑均顯著減小，并且T、LH含量降低，與本文結(jié)論一致。

RAGE是一種具有重要功能的細(xì)胞表面受體，當(dāng)其與配體AGEs結(jié)合后，能夠引起下游多條信號通路的改變，引起一系列生物學(xué)反應(yīng)，加快機(jī)體細(xì)胞的凋亡[10]。FZ是一種近期發(fā)現(xiàn)的AGEs/RAGE通路小分子阻斷劑，在多項(xiàng)研究中已有運(yùn)用。本研究運(yùn)用槲皮素及AGEs/RAGE通路阻斷劑對PCOS大鼠的卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，從而能夠更明確地探究槲皮素對AGEs/RAGE通路的作用機(jī)制。在陽性藥物選擇上，針對IR，將臨床應(yīng)用最廣泛的二甲雙胍列入實(shí)驗(yàn)分組中[11]，從而能夠更好地評價槲皮素的作用。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)觀察到PCOS組細(xì)胞凋亡率最高，而加入阻斷劑及高劑量槲皮素處理后，細(xì)胞凋亡率顯著減低，與PCOS+MH組結(jié)果趨同，并且其中僅加入阻斷劑和僅進(jìn)行高劑量藥物處理組均能夠顯著降低細(xì)胞凋亡，可以推測槲皮素可能發(fā)揮與阻斷劑相同的作用，阻斷AGEs/RAGE通路活性，從而保護(hù)細(xì)胞。

HMGB1是一種新發(fā)現(xiàn)的炎癥因子，可介導(dǎo)IR，從而誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡[12]。與細(xì)胞凋亡關(guān)系最密切的當(dāng)屬Bcl-2家族，其中以Bcl-2和Bax最具典型。Bcl-2是一種癌基因，能夠作為潛在的抑制因子調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡；而Bax與之相反，是一種凋亡促進(jìn)因子[13]。本研究中，槲皮素高劑量組及阻斷劑加高劑量組HMGB1及Bax的mRNA表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2的mRNA表達(dá)水平顯著升高，推測槲皮素可抑制細(xì)胞凋亡。另外，加入阻斷劑及槲皮素處理均可見卵巢顆粒細(xì)胞中ROS的熒光強(qiáng)度顯著減弱，提示ROS活性降低。申超[10]在研究中指出，ROS是激活促炎反應(yīng)的重要上游介質(zhì)，因此可推斷槲皮素或許可以降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)，起到細(xì)胞保護(hù)作用，這一作用有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

MAPK屬于絲氨酸蛋白激酶，在磷酸化過程中可促進(jìn)其他胞質(zhì)蛋白磷酸化，ERK是MAPK家族成員，能夠在細(xì)胞增殖、分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[14]。ERK表達(dá)量升高時會導(dǎo)致胰島素信號傳導(dǎo)通路受到破壞，從而增強(qiáng)IR，因此降低EPK表達(dá)，升高p-ERK表達(dá)將能夠減輕細(xì)胞損傷。研究指出，p38MAPK與IR的形成密切相關(guān)，p-p38 MAPK含量與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，但有關(guān)p-p38 MAPK、p-ERK與AGEs/RAGE通路的研究卻較少見于報(bào)道[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，加入槲皮素及通路阻斷劑后，AGEs和RAGE的蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明AGEs/RAGE通路活性受到抑制；而p-ERK和p-p38 MAPK的蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，提示AGEs/RAGE通路活性受到抑制時，細(xì)胞增殖調(diào)控因子含量升高，從而起到細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠抑制PCOS模型大鼠中卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，其作用主要是通過抑制AGEs/RAGE通路活性實(shí)現(xiàn)的。