晚期非小細(xì)胞肺癌中突變型p53和HIF-1α的表達(dá)及臨床意義

金得芳，司馬李杰，曾騰達(dá)，尹華婕，劉新福

(南華大學(xué)附屬邵陽(yáng)醫(yī)院 血液腫瘤科，湖南 邵陽(yáng)，422000)

據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)[1]，2020年全球有220萬(wàn)的新增肺癌病例，其人數(shù)雖次于排在首位的女性乳腺癌，但肺癌的死亡人數(shù)卻是最多的，每年估計(jì)有180萬(wàn)人死亡。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)是肺癌中最常見(jiàn)的類型，約占所有病例的85%，主要包括腺癌和鱗狀細(xì)胞癌[2]。根治性手術(shù)是早期肺癌治療的有效手段。但由于NSCLC發(fā)病比較隱蔽，僅約1/3的NSCLC患者能行手術(shù)切除治療[3]，絕大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。近年來(lái)，表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)的出現(xiàn)[4]，已成為NSCLC治療的重大突破。然而，隨著臨床的廣泛應(yīng)用，耐藥性已成為一個(gè)新的問(wèn)題。因此，尋找潛在的生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)NSCLC的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后顯得格外重要。

p53是人類腫瘤中最重要的抑癌基因。在缺氧、DNA損傷、熱休克等細(xì)胞應(yīng)激條件下，轉(zhuǎn)錄形成的p53抑癌蛋白，能通過(guò)引發(fā)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期和抑制血管生成等腫瘤抑制機(jī)制實(shí)現(xiàn)細(xì)胞基因組的完整性和動(dòng)態(tài)平衡[5]。因此，p53也被稱作“基因組守護(hù)者”[6]。但研究表明，50%的人類癌癥中有p53突變，其中無(wú)義突變、移碼缺失及錯(cuò)義突變是最常見(jiàn)的突變類型[7]。p53一旦發(fā)生突變，會(huì)喪失其維持基因組穩(wěn)定性的功能，導(dǎo)致染色體或基因組不穩(wěn)定，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。野生型p53蛋白半衰期短(5～30 min)、易分解、細(xì)胞內(nèi)含量極低，難以檢測(cè)到，但突變型p53蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變，穩(wěn)定性高，可以通過(guò)免疫組織化學(xué)法能檢測(cè)到[8]。因此，臨床上用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)到的p53蛋白均為突變型。

缺氧是實(shí)體瘤中最常見(jiàn)和最明顯的腫瘤微環(huán)境，而缺氧誘導(dǎo)因子1α[9](hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)作為細(xì)胞缺氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖、新陳代謝、免疫應(yīng)答、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程[10]。研究表明，HIF-1α在多種實(shí)體瘤如宮頸癌、胃癌及大腸癌等中均是高表達(dá)的，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]。

目前，國(guó)內(nèi)外的很多研究發(fā)現(xiàn),突變型p53和HIF-1α的表達(dá)水平與宮頸癌、乳腺癌及肝癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后可能有關(guān)[5，11]。但較少有研究探討突變型p53和HIF-1α的表達(dá)水平與NSCLC預(yù)后的關(guān)系。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)突變型p53和HIF-1α在晚期NSCLC組織中的表達(dá)，探討其表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選取邵陽(yáng)市中心醫(yī)院2019年1月1日至2020年10月31日期間收治的200例晚期NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)有明確的病理診斷，按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(union for international cancer control,UICC)第8版肺癌TNM分期，均屬于不可手術(shù)的IV期患者；(2)確診后的預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月，有完整的隨訪資料；(3)確診前未接受過(guò)放化療、靶向治療、免疫治療等相關(guān)的抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并感染性、中毒性、血液性、創(chuàng)傷性及自身免疫性疾病者；(2)有嚴(yán)重的肝腎疾病或高度過(guò)敏體質(zhì)者，不能耐受≥2個(gè)一線化療周期；(3)確診前合并≥2種原發(fā)腫瘤者；(4)行基因檢測(cè)后，有驅(qū)動(dòng)基因突變的NSCLC患者(如EGFR、ALK及ROS1等基因突變)。本研究經(jīng)邵陽(yáng)市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集與隨訪

收集病人的臨床資料(姓名、性別、年齡、吸煙史及飲酒史等)和病理資料(病理類型、腫瘤最大徑及分化程度等)。從確診日開(kāi)始，通過(guò)查詢門(mén)診或住院復(fù)查資料、短信或電話隨訪等方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪。前3個(gè)月每月隨訪1次，3個(gè)月以后每3個(gè)月隨訪1次，共隨訪15個(gè)月，最后一次隨訪的截止日期為2022年1月31日。若期間死于其他疾病、失訪及隨訪結(jié)束后仍然存活的患者視為刪失數(shù)據(jù)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色及蘇木精-伊紅染色

經(jīng)病理確診的200例晚期NSCLC患者癌組織的石蠟切片(厚4 μm)，依次在二甲苯I、二甲苯II溶液中進(jìn)行脫蠟→梯度酒精(高濃度→低濃度)中脫掉二甲苯→蒸餾水充分沖洗。

1.2.2.1 免疫組化染色的具體步驟

(1)將切片放入CBS緩沖劑及蒸餾水配置的修復(fù)液中，采用高溫高壓法行抗原酸修復(fù)。

(2)PBS緩沖液沖洗修復(fù)后的切片，并放入3%的H2O2溶液中進(jìn)行孵育。

(3)實(shí)驗(yàn)組滴加一抗(p53、HIF-1α鼠抗人單克隆抗體)，對(duì)照組用PBS緩沖液代替一抗，其應(yīng)覆蓋玻片上的全部組織，并在37 ℃的恒溫孵育箱中孵育60 min。

(4)滴加生物素標(biāo)記的二抗后，置于37 ℃的恒溫孵育箱中孵育30 min。

(5)在切片上滴加DAB顯色劑,顯色5～8 min。

(6)滴加蘇木素對(duì)切片上細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。

(7)常規(guī)脫水,透明,干燥,封片、觀察。

1.2.2.2 蘇木精-伊紅(HE)染色的具體步驟

(1)將切片在蘇木精染色液中染色5 min，用清水沖洗。

(2)用1%的鹽酸酒精溶液分化3 s，用清水沖洗。

(3)0.5%的伊紅水溶液染色2 min，用清水沖洗。

(4)常規(guī)脫水，透明，干燥，封片，觀察。

1.2.3 免疫組化染色結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

由≥2位病理科醫(yī)師采用半定量積分法[12-13]對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，如遇到分歧，通過(guò)討論得出一致結(jié)論。半定量積分=著色強(qiáng)度評(píng)分*陽(yáng)性細(xì)胞所占比評(píng)分。著色強(qiáng)度評(píng)分：不著色 0分，淡黃色 1分，棕黃色 2分，黃褐色 3分；陽(yáng)性細(xì)胞所占比評(píng)分：≤25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分。定義評(píng)分<6為陰性表達(dá)，評(píng)分≥6為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 患者的一般資料特征

入組的200例患者，其中鱗癌108例，腺癌92例；年齡>60歲134例，<60歲66例；男136例，女64例；吸煙117例，不吸煙83例；飲酒109例，不飲酒91例；腫瘤最大徑>3 cm 132例，<3 cm 68例；周圍型98例，中央型102例；分化程度：高分化25例，中分化85例，低分化90例。

2.2 HE染色結(jié)果

200例晚期NSCLC組織中,蘇木素-伊紅(HE)染色結(jié)果為：(1)肺腺癌92例(46%)，其細(xì)胞異型性明顯，結(jié)構(gòu)不一，可見(jiàn)管狀或腺樣結(jié)構(gòu)。(2)肺鱗狀細(xì)胞癌108例(54%)，其組織中出現(xiàn)角化現(xiàn)象或細(xì)胞間橋(圖1)。

圖1 HE染色圖片F(xiàn)ig.1 HE stained picture

2.3 晚期NSCLC組織中突變型p53和HIF-1α的表達(dá)

在200例晚期NSCLC患者中，突變型p53、HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)的分別為107例(53.5%)和147例(73.5%)；突變型p53主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，呈棕黃色顆粒狀著色，HIF-1α主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，但在細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)，呈黃褐色顆粒狀著色(圖2)。

圖2 部分免疫組化染色圖片F(xiàn)ig.2 Part of the immunohistochemical staining pictures

2.4 晚期NSCLC中突變型p53和HIF-1α的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

突變型p53的表達(dá)與吸煙史、腫瘤分化程度相關(guān)(P<0.05)，突變型p53在有吸煙史的患者中陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)吸煙史者，在低分化組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于中、高分化組織(P<0.05)；HIF-1α的表達(dá)與腫瘤分化程度有關(guān)(低分化、中分化和高分化組織中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.0%、68.2%和82.2%，χ2=7.064，P=0.029)。見(jiàn)表1。

表1 晚期NSCLC組織中突變型p53、HIF-1α蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.5 晚期NSCLC中突變型p53和HIF-1α表達(dá)水平的相關(guān)性

應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析研究突變型p53和HIF-1α在晚期NSCLC中表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)突變型p53和HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.167，P=0.018)。見(jiàn)表2。

表2 晚期NSCLC中突變型p53和HIF-1α表達(dá)的關(guān)系

2.6 晚期NSCLC組織中突變型p53、HIF-1α的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

突變型p53陽(yáng)性表達(dá)組的中位總生存期要低于陰性表達(dá)組，中位總生存期分別為10.6個(gè)月、7.6個(gè)月，χ2=21.573，P=0.001；HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)組的中位總生存期為8.3個(gè)月，陰性表達(dá)組的中位總生存期為10.9個(gè)月，兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.353，P=0.002，圖3和圖4)。

圖3 晚期NSCLC中突變型p53蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系Fig.3 Relationship between expression of mutant p53 protein and prognosis of patients with advanced NSCLC

圖4 晚期NSCLC中突變型p53蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系Fig.4 Relationship between the expression of mutant p53 protein in advanced NSCLC and prognosis of patients

2.7 影響晚期NSCLC預(yù)后的因素分析

2.7.1 單因素COX回歸分析

在單因素COX回歸分析中，以生存結(jié)局為因變量(刪失=0，死亡=1)，突變型p53、HIF-1α等分類變量作為協(xié)變量，見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，病理類型、突變型p53表達(dá)及HIF-1α表達(dá)與患者的總生存期相關(guān)(P<0.05)。而年齡、性別、病理類型、吸煙史、腫瘤最大徑、分化程度、腫瘤部位及飲酒史與患者的預(yù)后無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表3 晚期NSCLC預(yù)后的影響因素與賦值

表4 影響NSCLC患者預(yù)后的Cox單因素分析

2.7.2 多因素COX回歸分析

將單因素COX回歸分析中有意義的自變量納入多因素COX回歸分析中。結(jié)果顯示，突變型p53、HIF-1α表達(dá)與患者的總生存期相關(guān)(P<0.05)，而病理類型與總生存期無(wú)關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表5。

3 討論

p53是LANE等[14]于1979年在SV40轉(zhuǎn)化的小鼠細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，在癌癥生物學(xué)中起重要的調(diào)控作用。p53分為野生型p53和突變型p53兩種亞型。當(dāng)細(xì)胞受到壓力或損傷時(shí)，野生型p53基因編碼的p53蛋白能阻止受損的細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞所出現(xiàn)的癌變風(fēng)險(xiǎn)。在許多情況下，可通過(guò)觸發(fā)各種下游通路來(lái)激活細(xì)胞的程序性死亡(凋亡)，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體[15]。而突變型p53可以通過(guò)阻礙正常p53蛋白的合成或通過(guò)改變正常p53蛋白中的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而損害正常p53蛋白抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的能力，促進(jìn)細(xì)胞增殖與癌變[16]。DING等[17]對(duì)188例肺癌患者的DNA進(jìn)行測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，吸煙者中p53的突變概率顯著高于從不吸煙的個(gè)體，表明p53突變與吸煙密切有關(guān)。而最近，ZHOU等[12]通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法也觀察到p53蛋白的表達(dá)水平與吸煙狀況有很強(qiáng)的相關(guān)性(P=0.007)。韓麗麗等[18]發(fā)現(xiàn)突變型p53表達(dá)與分化程度、TNM分期相關(guān)。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)200例晚期NSCLC組織中p53的表達(dá)，結(jié)果與文獻(xiàn)[12，17-18]研究結(jié)果一致，即p53在晚期NSCLC中的表達(dá)與吸煙、腫瘤的分化程度密切相關(guān)。另外，研究發(fā)現(xiàn)，與野生型p53患者相比，突變型p53患者的OS及PFS較差[19]。而最近，TOMASINI等[20]對(duì)218例NSCLC患者進(jìn)行研究后得出，與p53突變組相比，不伴有p53突變的患者的OS更長(zhǎng)。本研究利用Kaplan-Meier生存曲線分析突變型p53的表達(dá)水平與生存時(shí)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)p53陽(yáng)性表達(dá)組的生存時(shí)間要低于p53陰性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)進(jìn)一步的多因素COX回歸分析后，發(fā)現(xiàn)突變型p53是晚期NSCLC患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

腫瘤的分化程度是指腫瘤組織在形態(tài)和功能上與某種正常組織的相似程度[21]，腫瘤組織分化程度越低，提示惡性程度越高，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的可能性越大。本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達(dá)與組織的分化程度存在相關(guān)性，且與文獻(xiàn)[22-23]的研究結(jié)果相一致，即低分化的肺癌組織中HIF-1α的表達(dá)水平要高于中、高分化組織，這提示HIF-1α的表達(dá)可能與肺癌的惡性程度有關(guān)，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定的作用。然而，ZHENG等[13]發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達(dá)與NSCLC的分化程度無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。鄧萬(wàn)生等[24]也發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達(dá)與分化程度無(wú)關(guān)。因此，對(duì)于HIF-1α是否與分化程度存在相關(guān)性，尚不是很清楚，這可能與研究中納入的人群、HIF-1α的檢測(cè)試劑和方法、免疫組織化學(xué)判讀標(biāo)準(zhǔn)等的不同相關(guān)，未來(lái)還需要更大規(guī)模的、多中心的研究來(lái)進(jìn)一步明確。目前，關(guān)于HIF-1α的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，大多數(shù)研究都集中在可手術(shù)的NSCLC患者，如李黎等[25]通過(guò)評(píng)估77例手術(shù)治療的NSCLC患者，發(fā)現(xiàn)HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)的患者會(huì)出現(xiàn)更低的生存率。ZHENG等[13]研究結(jié)果也表明，HIF-1α可能是預(yù)測(cè)256例早期NSCLC患者預(yù)后的一個(gè)潛在標(biāo)志物。本研究利用Kaplan-Meier生存曲線分析突變型p53的表達(dá)水平與總生存期的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)HIF-1α陰性表達(dá)組的中位總生存期要高于HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)組。用多因素COX回歸分析發(fā)現(xiàn)，HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)是影響晚期NSCLC患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。通過(guò)Spearman秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)晚期NSCLC中突變型p53與HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)，這可能為以p53和HIF-1α為靶點(diǎn)的聯(lián)合治療NSCLC提供了依據(jù)。

綜上所述，晚期NSCLC患者癌組織中，突變型p53的表達(dá)與吸煙史及分化程度相關(guān)，HIF-1α的表達(dá)與分化程度相關(guān)，兩者的表達(dá)呈正相關(guān)。突變型p53、HIF-1α的表達(dá)水平可作為晚期NSCLC預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。