基于細胞自噬的靶向降解技術(shù)及在植物研究中的應(yīng)用前景

黃 曉，鄧桂玲，李發(fā)強,2

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510642； 2 廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點實驗室, 廣東 廣州 510642)

靶向降解技術(shù)是一類利用真核細胞內(nèi)天然存在的降解機制對胞內(nèi)有害物質(zhì)進行特異、高效降解的重要技術(shù)。該技術(shù)主要是通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng) (Ubiquitin-proteasome system，UPS)和自噬-溶酶體途徑(Autophagy-lysosome pathway)，清除細胞內(nèi)錯誤折疊或聚集的蛋白、大分子復(fù)合物、受損或老化的細胞器及一些非蛋白類物質(zhì) (如脂類)[1]。靶向降解技術(shù)的概念可以追溯到2001年，Crews和Deshaies等學(xué)者針對傳統(tǒng)藥物研發(fā)的諸多局限性提出靶向蛋白降解(Targeted protein degradation，TPD)技術(shù)[2]。傳統(tǒng)的藥物研發(fā)主要集中于篩選能結(jié)合靶蛋白(Protein of interest，POI)的活性位點并改變其活性的小分子，而TPD技術(shù)的策略是通過直接誘導(dǎo)靶蛋白的泛素化以促進其降解，進而達到治療疾病的目的。TPD技術(shù)的興起在一定程度上解決了諸多缺乏明顯活性位點的、“不可成藥”蛋白的藥物開發(fā)所面臨的困境[3]。這一降解技術(shù)的概念最初只是針對降解致病蛋白提出的，而隨著降解技術(shù)的突破和降解系統(tǒng)的擴展，其降解對象已經(jīng)拓展至蛋白聚集體、細胞器和一些非蛋白類物質(zhì)[1,4]。

靶向降解技術(shù)最初主要是利用UPS對目標(biāo)蛋白進行降解。UPS是負責(zé)細胞內(nèi)源性蛋白降解的主要途徑，許多調(diào)控細胞生命活動的關(guān)鍵蛋白如細胞周期調(diào)控蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵因子，均受到該系統(tǒng)的精確調(diào)控。當(dāng)細胞通過UPS降解蛋白時，首先經(jīng)由泛素激活酶(E1)、泛素偶聯(lián)酶(E2)和泛素連接酶(E3)的級聯(lián)反應(yīng)將蛋白底物泛素化，形成多聚泛素鏈，進而被26S蛋白酶體識別并降解[5]?；谶@種降解機制，Sakamoto等[2]研發(fā)了蛋白水解靶向嵌合體 (Proteolysis-targeting chimera，PROTAC) 技術(shù)。PROTAC是一類雙功能的小分子或多肽化合物，其中含有靶向目標(biāo)蛋白的配體、募集E3酶的配體以及連接這2個配體的接頭。該技術(shù)的原理是通過PROTAC分子同時與目標(biāo)蛋白和E3酶結(jié)合，形成三元復(fù)合物POI-PROTAC-E3，使目標(biāo)蛋白泛素化，隨后被U P S降解 (圖1)。自面世以來，PROTAC技術(shù)發(fā)展迅速，為眾多“不可成藥”的靶標(biāo)蛋白提供了全新的降解策略[6]。目前針對PROTAC技術(shù)存在的問題和缺點，研究人員不斷開發(fā)各種新型PROTACs，以拓展該技術(shù)的應(yīng)用場景。例如擴展可用于PROTAC技術(shù)的E3酶，以拓展靶向蛋白降解對象[1]；引入細胞穿膜肽以提高多肽類PROTAC分子的細胞通透性[7]；加入光調(diào)控元件，提高PROTACs分子靶向性等[8]。盡管PROTAC技術(shù)發(fā)展得很快，但其作用的發(fā)揮必須依賴于UPS，在降解膜蛋白、不溶性蛋白聚集體、受損的細胞器和非蛋白類物質(zhì)方面仍然有諸多限制。

圖1 基于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體/液泡途徑的靶向降解技術(shù)Fig. 1 Targeted degradation techniques based on the ubiquitin-proteasome system and the autophagy-lysosome/vacuole pathway

近年來，研究人員開始將目光轉(zhuǎn)向真核細胞內(nèi)的另一個保守的降解體系-自噬-溶酶體途徑，相繼開發(fā)了一系列基于自噬途徑的新型靶向降解技術(shù)，包括分子伴侶介導(dǎo)的自噬 (Chaperonemediated autophagy，CMA) 嵌合體技術(shù)、自噬體綁定化合物 (Autophagosome-tethering compound，ATTEC) 技術(shù)、自噬靶向嵌合體AUTAC (Autophagytargeting chimera)技術(shù)和AUTOTAC (AUTOphagy-TArgeting Chimera) 技術(shù)[4]。這些靶向降解技術(shù)通過自噬-溶酶體途徑，不僅能特異降解細胞內(nèi)的可溶性蛋白，還能特異降解不溶性蛋白聚集體、大分子復(fù)合物和碎片化的細胞器如線粒體等，有望應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病等多種疾病的治療。

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)李發(fā)強教授課題組(本課題組)近年來在植物中也開展了一些基于自噬-液泡途徑的靶向降解技術(shù)的探索性工作。本綜述首先詳細介紹了各類基于自噬-溶酶體途徑的靶向降解技術(shù)的作用機制、特點以及優(yōu)勢；并且結(jié)合本課題組的研究工作，著重介紹了設(shè)計和改造植物選擇性自噬銜接蛋白方面的研究和設(shè)想，以期達到將對植物生長發(fā)育不利的因子經(jīng)由細胞自噬轉(zhuǎn)運并區(qū)室化隔離于液泡的目的，進而開發(fā)能夠抵御病毒侵染或抵抗有害物質(zhì)的農(nóng)作物新品種；最后展望了靶向自噬的降解技術(shù)在植物科學(xué)研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的潛在應(yīng)用前景和所面臨的挑戰(zhàn)。

1 基于細胞自噬的靶向降解技術(shù)

細胞自噬 (Autophagy) 是真核生物中一類高度保守的、依賴于溶酶體(動物)和液泡(植物和酵母)的代謝途徑。細胞通過自噬將胞內(nèi)功能受損的蛋白、細胞器或外源成分降解成生物小分子，以維持胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和促進營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)利用。根據(jù)形成和作用機理的不同，自噬分為分子伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)、微自噬(Microautophagy)和巨自噬(Macroautophagy)[9-10]。CMA是指在伴侶蛋白的識別和協(xié)助下，目標(biāo)蛋白去折疊，經(jīng)由溶酶體膜上的受體轉(zhuǎn)運入溶酶體腔內(nèi)降解，目前該機制的報道僅限于動物細胞。與CMA不同，微自噬和巨自噬均涉及囊泡形成。微自噬是指溶酶體或液泡直接通過膜內(nèi)陷的方式包裹待降解的胞內(nèi)物質(zhì)，然后吞噬入液泡腔內(nèi)進行降解的過程。巨自噬的發(fā)生則需要一系列的自噬相關(guān)(AuTophaGy-related，ATG)蛋白相互協(xié)調(diào)，按照一定的步驟發(fā)揮功能，首先在胞質(zhì)中利用內(nèi)膜系統(tǒng)形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體 (Autophagosome)，然后將胞內(nèi)物質(zhì)包裹并運送到溶酶體或液泡中降解。這3種自噬類型中，巨自噬是最主要的、也是研究最多的一種自噬降解途徑[9-10]。下文提及的自噬均為巨自噬的簡稱。

自噬在研究早期僅被認為是一種非選擇性的、適應(yīng)饑餓的代謝機制，但近年來的深入研究發(fā)現(xiàn)細胞還能通過該途徑特異性靶向各種蛋白、蛋白聚集體、細胞器甚至病原體，從而維持細胞的穩(wěn)態(tài)和功能。因此，自噬途徑的失調(diào)與人類的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、心血管疾病、腫瘤及白血病等一系列的疾病密切相關(guān)[11]。在植物的生長、發(fā)育和衰老過程中，自噬同樣行使著重要的調(diào)節(jié)作用，參與植物營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)利用、非生物脅迫響應(yīng)和免疫應(yīng)答等多個生物學(xué)過程[9]。

1.1 基于CMA的靶向降解技術(shù)

當(dāng)CMA發(fā)生時，分子伴侶熱休克蛋白HSC70(Heat shock cognate protein 70)首先會識別目標(biāo)底物的KFERQ基序，與之形成蛋白復(fù)合物。在其他輔助分子伴侶的協(xié)助下，該復(fù)合物與溶酶體跨膜蛋白LAMP2A (Lysosomal-associated membrane protein 2A) 結(jié)合，驅(qū)動LAMP2A的寡聚，進而介導(dǎo)HSC70復(fù)合物的跨膜運輸，進入溶酶體腔內(nèi)降解(圖2A)[12]。利用CMA特異性降解蛋白的原理，Bauer等[13]構(gòu)建了一個通過“劫持”CMA以降解致病變異亨廷頓蛋白 (Mutant Huntington，mHTT)的多肽分子(圖2A)。該多肽分子含有與HSC70互作的CMA靶向基序 (CMA-targeting motif，CTM)和特異識別mHTT的多聚谷氨酰胺結(jié)合肽1(Polyglutamine-binding peptide 1, QBP1)序列，能夠與mHTT及HSC70形成三元復(fù)合物，促進mHTT的溶酶體降解。在小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞Neuro2a中表達該多肽可明顯促進mHTT的降解，抑制mHTT聚集體的形成。在亨廷頓氏病模型小鼠中的研究結(jié)果也清楚地表明，表達該多肽可有效改善亨廷頓氏病的癥狀。

圖2 基于自噬-溶酶體/液泡途徑的靶向降解策略示意圖Fig. 2 Schematic diagram for the targeted degradation technique based on the autophagy-lysosome/vacuole pathway

同樣受CMA機制的啟發(fā)，F(xiàn)an等[14]構(gòu)建了一系列含有CTM和靶蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙功能多肽分子，通過CMA途徑介導(dǎo)細胞內(nèi)蛋白的降解；在此基礎(chǔ)上，進一步在多肽分子的N-端添加了細胞穿膜肽，以提高多肽分子通過細胞膜屏障和血腦屏障的效率。結(jié)果顯示，這一技術(shù)能特異性降解神經(jīng)元中的多個活性蛋白，包括被中風(fēng)激活的死亡相關(guān)蛋白激酶DAPK1 (Death-associated protein kinase 1)、突觸可塑性相關(guān)蛋白PSD-95 (Postsynaptic density protein-95)、與帕金森病等神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)的α-突觸核蛋白 (α-synuclein)[14]。利用該技術(shù)，研究人員進一步實現(xiàn)了對活性形式的DAPK1的特異降解。DAPK1是一類Ca2+/鈣調(diào)蛋白(CaM)依賴型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在缺血性腦卒時被激活，可引起一系列的神經(jīng)元細胞凋亡。研究者利用N-甲基-D-天冬氨酸受體NMDAR (N-methyl-Daspartate receptor) 的GluN2B亞基只與活性形式的DAPK1特異結(jié)合的特性，以GluN2B亞基的C-端為靶蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，設(shè)計了靶向活性形式的DAPK1的多肽分子。通過靜脈注射將這種多肽分子注入大鼠中風(fēng)模型，成功地在受損的大腦區(qū)域特異性降解了活性形式的DAPK1蛋白，減少了血液供給受阻造成的組織死亡。

此外，Wang等[15]在探究免疫檢查點分子PDL1 [Programmed cell death 1 (PD-1) ligand 1]的溶酶體降解機制時，發(fā)現(xiàn)亨廷頓蛋白互作蛋白1相關(guān)蛋白HIP1R (Huntington-interacting protein 1-related)能與PD-L1互作，并通過其C-端的“雙亮氨酸 (Di-leucine)”溶酶體分選信號把PD-L1定向轉(zhuǎn)運至溶酶體降解；利用HIP1R與PD-L1互作的特性，該課題組設(shè)計了特異降解PD-L1的多肽分子PD-LYSO，該多肽包括CTM和PD-L1結(jié)合序列，能夠?qū)D-L1靶向至溶酶體進行降解。同樣基于CMA機制，Zhou等[16]設(shè)計了CMA靶向多肽分子Tat-CDK5-CTM，實現(xiàn)了細胞周期蛋白依賴性激酶CDK5 (Cyclin-dependent kinase 5) 的特異性自噬降解。

與RNA干擾等核酸層面的技術(shù)相比，基于CMA的靶向降解技術(shù)具有更快的降解速度，并且可以通過調(diào)節(jié)多肽分子的濃度和施加時間來控制靶蛋白的降解程度，顯示出更優(yōu)的可逆性和劑量依賴性；此外，該技術(shù)具有更強的專一性，可以特異性降解特定形式的蛋白[14]。但是，這項技術(shù)仍然有一定的局限性和面臨的挑戰(zhàn)：1) 與基于UPS的PROTAC技術(shù)類似，該技術(shù)只能降解一些特定蛋白而不能降解蛋白聚集體、蛋白復(fù)合物等大型的胞內(nèi)物質(zhì)；2) 該技術(shù)的專一性依賴于高選擇性和高親和力肽段的篩選，需要通過合理利用一系列技術(shù) (如噬菌體展示、肽陣列、人工智能輔助的虛擬篩選等)去更高效地獲得與靶蛋白特異結(jié)合的肽段；3) 穩(wěn)定性差和跨膜遞送效率低一直是多肽類分子藥物亟待解決的瓶頸問題。

1.2 基于選擇性自噬的靶向降解技術(shù)

細胞利用選擇性自噬特異降解各種底物的過程是通過一類自噬銜接蛋白 (Autophagy adaptor) 的介導(dǎo)來完成[17]。自噬銜接蛋白作為一個雙功能分子，既可以識別并特異結(jié)合自噬底物，也可以通過自身含有的、能與自噬核心蛋白ATG8結(jié)合的互作基序(ATG8-interacting motif，AIM) 或泛素相互作用基序(Ubiquitin-interacting motif，UIM) 錨定在自噬囊泡膜上，從而將底物導(dǎo)入自噬體中[9,18]。在動物中AIM基序又被稱為LC3相互作用區(qū) (LC3-interacting region，LIR)，由一段保守的氨基酸序列組成，其序列為 [W/F/Y]XX[L/I/V]，其中“X”可為任一種氨基酸[18-19]。在過去大約20年里，研究者們對酵母Saccharomyces cerevisiae、動物和植物的自噬途徑進行了深入研究，鑒定了將近100個不同的自噬銜接蛋白[17]。Atg19是酵母中發(fā)現(xiàn)的第1個自噬銜接蛋白，負責(zé)氨基肽酶Ape1 (Aminopeptidase I)、甘露糖酶Ams1 (α-mannosidase) 等幾種液泡酶前體的轉(zhuǎn)運[20-21]。哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的第1個自噬銜接蛋白是SQSTM1/p62，在清除泛素化蛋白和受損的細胞器中起著重要作用[22-23]。對植物選擇性自噬的研究雖然起步較晚，但是在近幾年發(fā)展迅速，多個相關(guān)基因及編碼蛋白的功能被一一揭示，增加了我們對自噬底物廣泛性的認識。植物選擇性自噬底物包括單個或聚集狀態(tài)的蛋白、大分子復(fù)合物 (如蛋白酶體和核糖體)、細胞器 (如線粒體、過氧化物酶體和葉綠體)，甚至非蛋白類生物分子(如卟啉)等[24-25]。

受選擇性自噬機制的啟發(fā)，研究人員通過模擬自噬銜接蛋白開發(fā)了幾種降解蛋白、脂滴以及細胞器的新技術(shù)[4]。例如復(fù)旦大學(xué)魯伯塤、丁澦、費義艷團隊發(fā)明了一種ATTEC技術(shù)，應(yīng)用于mHTT的降解；通過高通量篩選，該團隊找到了一類功能上類似于自噬銜接蛋白的ATTEC小分子，這些ATTEC小分子能同時結(jié)合ATG8和mHTT，但不能結(jié)合野生型HTT，從而實現(xiàn)對mHTT的特異性降解(圖2B)[26]。此外，該研究團隊近期還開發(fā)了降脂化合物L(fēng)D-ATTECs (Lipid droplet-ATTEC)，實現(xiàn)了對脂滴的自噬特異性降解，將靶向降解底物的范圍拓展至非蛋白類生物大分子[27]。

AUTAC的概念是由Arimoto課題組基于細胞清除A組鏈球菌(Group AStreptococcus，GAS) 的自噬機制提出的[28]。當(dāng)真核細胞被鏈球菌入侵時，會通過鳥嘌呤衍生物 (8-nitro-cGMP) 對鏈球菌表面相關(guān)蛋白進行S-鳥苷酸化修飾，誘導(dǎo)這些蛋白的K63泛素化修飾，進而招募自噬體將鏈球菌包裹，送入溶酶體中進行降解[29]?；谠摍C制設(shè)計的AUTAC分子主要由靶向底物的特異配體、模仿鳥嘌呤衍生物的降解標(biāo)簽以及連接子3部分組成(圖2C)。AUTAC可以通過配體與底物特異結(jié)合，同時通過降解標(biāo)簽?zāi)MS-鳥苷酸化修飾，誘導(dǎo)靶蛋白的多聚泛素化，最終導(dǎo)致底物的選擇性自噬降解。Arimoto課題組將AUTAC技術(shù)應(yīng)用于多個疾病相關(guān)靶蛋白的降解，成功實現(xiàn)了對甲硫氨酸氨基肽酶MetAP2 (Methionine aminopeptidase 2)、FK506結(jié)合蛋白(FK506-binding protein) FKBP12和BET (Bromodomain and extra terminal) 家族蛋白的有效降解；此外，該課題組還通過設(shè)計靶向線粒體轉(zhuǎn)位蛋白(Translocator protein，TSPO)的AUTAC分子，實現(xiàn)了碎片化線粒體的自噬降解[28]。

作為哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的第1個自噬銜接蛋白，SQSTM1/p62能被特定泛素化的自噬底物激活，進而介導(dǎo)這些底物的選擇性自噬降解?；趯ψ允摄暯拥鞍譸62的研究，韓國首爾大學(xué)Yong Tae Kwon課題組開發(fā)了一種雙功能的AUTOTAC分子；該分子一端能夠與靶標(biāo)底物結(jié)合，另一端能夠與p62銜接蛋白結(jié)合并誘導(dǎo)自噬，從而將靶標(biāo)底物轉(zhuǎn)移到溶酶體中進行降解(圖2D)[30]。通過該技術(shù)，成功實現(xiàn)了多種可溶性靶蛋白的降解，包括MetAP2、雌激素受體ERβ (Estrogen receptor beta)和雄激素受體(Androgen receptor)。此外，研究者針對能引起阿爾茨海默病的tau蛋白突變體tauP301L，設(shè)計了一種能與之結(jié)合并促進其降解的AUTOTAC分子，tauP301L突變體易錯誤折疊，聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)；研究結(jié)果顯示，不論是在體外，還是在腦部表達tauP301L突變體的小鼠模型中，AUTOTAC分子均能夠有效清除tauP301L形成的聚集體，表明AUTOTAC具有一定的靶向錯誤折疊蛋白的能力[30]。

同樣基于選擇性自噬機制，本課題組設(shè)計了一套植物蛋白降解系統(tǒng)[31]。該系統(tǒng)由3部分組成(圖2E)：來自擬南芥Arabidopsis thaliana的自噬銜接蛋白NBR1 (Next to BRCA1 gene 1) 的AIM基序、與靶蛋白特異結(jié)合的短肽或結(jié)構(gòu)域、以及用于示蹤的熒光蛋白。該系統(tǒng)通過靶蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和AIM分別與靶蛋白和ATG8結(jié)合，招募自噬體將靶蛋白轉(zhuǎn)運至液泡中降解。我們通過更換不同的靶蛋白結(jié)合短肽或結(jié)構(gòu)域?qū)@套系統(tǒng)進行了測試。首先利用對綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP) 具高度親和力的納米抗體 (GFP-binding protein，GBP)為Binder，構(gòu)建了介導(dǎo)GFP融合蛋白降解的自噬銜接蛋白AIM-GBP-mCherry。在煙草中瞬時共表達的結(jié)果顯示，AIM-GBP-mCherry能介導(dǎo)多種GFP標(biāo)記的蛋白和細胞器轉(zhuǎn)運至液泡，包括定位于細胞核的bZIP轉(zhuǎn)錄因子TGA5、錨定于質(zhì)膜的油菜素甾體受體BRI1 (Brassinosteroid-insensitive 1)以及過氧化物酶體。我們進一步利用能與油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑核心調(diào)控激酶BIN2 (Brassinosteroidinsensitive 2) 特異互作的短肽為Binder，構(gòu)建了自噬銜接蛋白AIM-BZR1C82-mCherry，并在擬南芥中穩(wěn)定表達，發(fā)現(xiàn)該銜接蛋白能選擇性自噬降解內(nèi)源的BIN2。以上研究結(jié)果證明了這套基于植物細胞自噬的蛋白降解系統(tǒng)的特異性、廣泛的應(yīng)用范圍和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2 靶向自噬的降解技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用前景

2.1 細胞自噬在植物抗病毒中的潛在應(yīng)用前景

由于細胞自噬在植物生長發(fā)育及逆境應(yīng)答等過程中具有重要作用，研究人員近年來在提高細胞自噬活性以培育高產(chǎn)、抗逆作物新品種方面開展了一些探索性的工作。例如，ATG5和ATG7作為ATG8脂化修飾中的限速因子，它們的突變均會導(dǎo)致自噬途徑的阻斷，而在擬南芥中過表達ATG5和ATG7可顯著增強轉(zhuǎn)基因植物的自噬活性，提高其氮利用效率、產(chǎn)量和種子的含油率[32]。在擬南芥或水稻Oryza sativa中表達不同的ATG8拷貝也獲得了類似的效果[33-37]。過表達自噬關(guān)鍵基因還能顯著提高植物對干旱、高鹽及氧化脅迫等多種非生物逆境的耐受性和對一系列病原菌的抗性[38]。以上對自噬基因過表達的研究表明，提高細胞自噬活性對設(shè)計和培育高產(chǎn)高抗作物新品種具有理論意義和潛在的應(yīng)用價值[38]。

眾多研究表明，細胞自噬在植物抵御病毒侵染中發(fā)揮重要的作用[39]。當(dāng)病毒侵染時，植物細胞通過自噬蛋白與病毒蛋白互作，介導(dǎo)病毒蛋白的降解來消除和抑制病毒。例如自噬銜接蛋白NBR1與來自花椰菜花葉病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)的衣殼蛋白P4和來自蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus，TuMV) 的HCpro抑制子[40]，ATG6與來自TuMV的RNA依賴性RNA聚合酶Nib[41]，ATG8與來自木爾坦棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMuV)的毒性因子βc和來自水稻條紋病毒 (Rice stripe virus，RSV) 的衣殼蛋白P3等[42-43]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)了1個新的介導(dǎo)病毒蛋白降解的選擇性自噬受體rgs-CaM。rgs-CaM是1個鈣調(diào)素樣蛋白，可以識別和降解來自TuMV的HCpro抑制子和來自黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)和番茄不孕病毒 (Tomato aspermy virus，TAV) 的2b蛋白[44]。反之，病毒可以干擾、操縱、甚至劫持宿主的自噬途徑來促進其侵染。例如馬鈴薯葉卷病毒 (Potato leafroll virus) 的P0蛋白可以觸發(fā)植物RNA沉默復(fù)合體 (RNAinduced silencing complex，RISC)組分蛋白AGO1(ARGONAUTE1 ) 的泛素化，促進AGO1的自噬降解，從而逃逸宿主的免疫機制[45]。

上述研究表明，選擇性自噬降解病毒蛋白是一種非常重要的植物抗病毒免疫機制，也提示了一種新的抗病毒策略：設(shè)計能與病毒蛋白結(jié)合的自噬銜接蛋白，借助細胞自噬途徑以實現(xiàn)對病毒侵染的抑制。與靶向CMA的降解技術(shù)類似，該技術(shù)的實現(xiàn)同樣需要能與病毒蛋白特異性結(jié)合的多肽，這可以利用如噬菌體展示、肽陣列、人工智能輔助的虛擬篩選等技術(shù)來獲得。此外，能與植物病毒特異結(jié)合的納米抗體也將有助于這項技術(shù)的實現(xiàn)。Ghannam等[46]利用噬菌體展示技術(shù)分離出8個對蠶豆斑駁病毒 (Broad bean mottle virus，BBMV) 具有高親和力的特異性納米抗體，進一步在體外和在蠶豆葉片中瞬時表達，發(fā)現(xiàn)其中3個能中和病毒，并減弱它的傳播。另一項研究同樣顯示，在煙草Nicotiana benthamiana和葡萄砧木中穩(wěn)定表達一種對葡萄扇葉病毒(Grapevine fanleaf virus，GFLV) 特異性納米抗體后，可顯著提高植物對病毒的抗性[47]?？梢灶A(yù)見，納米抗體與靶向自噬降解技術(shù)的結(jié)合將會極大地促進抗病毒作物新品種的培育。

靶向病毒降解的自噬銜接蛋白除了通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物體內(nèi)穩(wěn)定表達外，體外表達后作為生物農(nóng)藥直接噴施也是一個值得考慮探究的策略。其開發(fā)與創(chuàng)制可以參考以來自病原微生物的免疫激活蛋白研發(fā)作物免疫誘抗劑的方法和思路[48]。另外以納米載體為媒介，利用納米粒子的功能修飾 (如聚陽離子修飾) 以及與穿膜肽融合，有望克服植物細胞壁和細胞膜屏障的困擾，提高自噬銜接蛋白導(dǎo)入植物細胞的效率[49]。

2.2 改造自噬途徑以降低重金屬對植物毒害的設(shè)想

除了能降解吞噬的蛋白和細胞器，液泡作為植物細胞中的大型降解場所，還能區(qū)室化隔離胞內(nèi)的有害物質(zhì)，從而降低它們對植物的毒害。那么，細胞自噬作為一條介導(dǎo)胞內(nèi)物質(zhì)到液泡的運輸途徑，是否可以用來轉(zhuǎn)運和隔離胞內(nèi)的有害物質(zhì)呢？最近LD-ATTECs對脂滴的特異性自噬降解表明基于選擇性自噬的靶向降解技術(shù)能夠降解非蛋白類物質(zhì)[27]，這也暗示了可以通過設(shè)計自噬銜接蛋白，將一些對植物生長發(fā)育不利的非生物脅迫因子 (如重金屬離子)，經(jīng)由細胞自噬轉(zhuǎn)運并隔離于液泡內(nèi)以降低其毒害。

重金屬脅迫作為一種非生物逆境脅迫，對植物特別是農(nóng)作物的各個生長階段均能造成嚴(yán)重的不良影響，是制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個重要因素。鎘(Cd)是毒性最強的重金屬元素之一，它在植物中的積累主要包括3個過程：根系吸收、根向地上部分的轉(zhuǎn)運、以及從莖和葉片到種子的重新分配[50]。鎘沿著與必需元素錳和鐵相同的途徑被吸收進入植物。水稻吸收鎘主要是通過其根系的錳轉(zhuǎn)運蛋白OsNramp5 (Natural resistance-associated protein 5)[51]。被根系吸收后，一部分鎘會被轉(zhuǎn)運至液泡中區(qū)隔起來，限制其向地上部分轉(zhuǎn)運，在水稻中是由重金屬ATP酶OsHMA3 (Heavy metal ATPase3)[52-53]負責(zé)執(zhí)行。鎘向地上部分的轉(zhuǎn)運主要是通過HMA3的同源蛋白HMA2/4來介導(dǎo)Cd的木質(zhì)部裝載[54-55]。在鎘的長距離轉(zhuǎn)運和再分配過程中，轉(zhuǎn)運蛋白OsLCT1 (Low-affinity cation transporter 1)[56]和OsHMA2[55]介導(dǎo)了Cd從水稻節(jié)向籽粒的轉(zhuǎn)移。另外，一個在根部表達的植物防御素類蛋白CAL1(Cd accumulation in leaf 1) 螯合鎘后可以通過跨膜運輸進入木質(zhì)部，再經(jīng)長距離轉(zhuǎn)運到葉片[57]；但此螯合態(tài)的鎘不易被重新分配，因而積累在葉片等營養(yǎng)器官中。

在以上對植物鎘吸收、轉(zhuǎn)運和積累分子機制的研究基礎(chǔ)上，研究者們一方面可以通過敲除或敲降OsNramp5、OsHMA2或OsLCT1等基因以減少水稻對鎘的吸收、轉(zhuǎn)運和重新分配；另一方面可通過過表達OsHMA3增強根細胞對鎘的液泡區(qū)室化，或者過表達CAL1定向調(diào)控鎘在葉片等器官的積累，以培育秸稈鎘高積累而籽粒鎘含量安全的水稻品種，同時移除土壤中的鎘。但是上述這些基因也參與了水稻必需金屬元素如錳、鐵、鋅的吸收與轉(zhuǎn)運，它們的缺失或過表達或多或少會影響必需營養(yǎng)元素的吸收、轉(zhuǎn)運和在籽粒中的積累。針對這一問題，本課題組提出了利用細胞自噬這條與液泡運輸相關(guān)的途徑來轉(zhuǎn)運和隔離鎘的設(shè)想。本課題組以能強烈螯合鎘的金屬硫蛋白為接頭設(shè)計自噬銜接蛋白，例如來自超積累植物伴礦景天Sedum plumbizincicola的金屬硫蛋白SpMTL (Metallothionein-like)[58]，利用自噬途徑將鎘導(dǎo)入并隔離在液泡內(nèi)。此外，通過更換不同的結(jié)合蛋白，人工改造的自噬銜接蛋白將能特異性結(jié)合不同的重金屬離子或其他非生物脅迫因子，從而擴展待自噬降解的目標(biāo)底物種類。

3 總結(jié)與展望

靶向降解技術(shù)是一類利用真核細胞內(nèi)天然存在的降解機制對有害物質(zhì)進行特異降解、以維持和改善細胞穩(wěn)態(tài)的重要技術(shù)。近年來發(fā)展迅速、目前應(yīng)用最廣泛的是PROTAC技術(shù)。該技術(shù)通過“劫持”UPS以改善細胞內(nèi)的蛋白穩(wěn)態(tài)，從而干預(yù)和治療疾病。除此之外，近幾年興起的一系列基于自噬途徑的降解技術(shù)，如CMA嵌合體、ATTEC、AUTAC和AUTOTAC等擴展了靶點底物范圍，能夠靶向錯誤折疊或聚集的蛋白、受損或老化的細胞器，甚至脂類等一些非蛋白類物質(zhì)，為治療神經(jīng)退行性疾病和代謝性疾病提供了全新的思路。

自噬作為細胞新陳代謝的一種主要方式，廣泛參與植物的生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)。目前主要是通過自噬途徑關(guān)鍵基因的過表達以提高植物的抗逆性和產(chǎn)量，而基于自噬的靶向降解技術(shù)在植物中的研究還處于起步階段。本課題組利用自噬銜接蛋白NBR1的AIM基序設(shè)計了一套植物蛋白降解系統(tǒng)，初步證明了靶向自噬的降解技術(shù)在植物研究中的可行性和發(fā)展?jié)摿?。但是，利用和改造細胞自噬這一降解途徑并應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)還有很長的路要走，有如下諸多挑戰(zhàn)亟待解決。1)鑒定新的植物自噬銜接蛋白和闡明其工作機制?；贏IM的降解劑的設(shè)計和優(yōu)化離不開對自噬銜接蛋白工作機制的闡明，但目前這方面的相關(guān)研究仍比較匱乏，可用于AIM降解劑設(shè)計的植物自噬銜接蛋白寥寥無幾。如何鑒定更多的、可用于AIM降解劑的銜接蛋白是該技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)之一。2)如何更深入理解靶向自噬降解劑的選擇性和特異性，和如何理性設(shè)計降解劑并有效評估其降解效率，是目前尚不明確且亟待解決的問題。其中快速有效篩選具有高選擇性和高親和力的配體將是基于自噬的靶向降解技術(shù)能否成功的關(guān)鍵。此外，引入組織特異性或時空特異性的調(diào)控元件也將有效提高靶向自噬降解劑的特異性表達。3)蛋白靶向降解技術(shù)作為一種蛋白水平層面的調(diào)控方式，能否與基因?qū)用嬲{(diào)節(jié)蛋白水平的技術(shù)，如CRISPR/Cas9和RNAi有效結(jié)合起來，以實現(xiàn)對農(nóng)藝性狀關(guān)鍵因子的多層次調(diào)控？

雖然基于自噬的靶向降解技術(shù)在植物中的應(yīng)用潛能還遠未被開發(fā)，存在諸多問題，但隨著研究的不斷深入，它們將極大地拓展靶向降解技術(shù)的潛在應(yīng)用領(lǐng)域，為植物研究提供強有力的工具，并有助于培育高產(chǎn)高抗作物新品種。