水稻環(huán)境敏感雄性不育研究現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)

彭國清，劉明龍，周 海，莊楚雄

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510642)

1 水稻環(huán)境敏感雄性不育的研究背景

1.1 雜交水稻發(fā)展與應(yīng)用

水稻是世界至少一半人口依賴的糧食，隨著人口的不斷增長(zhǎng)和可耕地面積的不斷減少，需要不斷提高單位面積糧食產(chǎn)量以保障糧食安全[1]。雜種優(yōu)勢(shì)是雜種F1代在多種性狀(包括產(chǎn)量、適應(yīng)性、抗性和品質(zhì)等)上超過雙親的現(xiàn)象，在動(dòng)植物中普遍存在[2-4]。雜交作物的產(chǎn)量往往比常規(guī)自交繁殖的產(chǎn)量高10%～20%，故雜交玉米、水稻、小麥和油菜等被廣泛推廣種植，成為提高作物產(chǎn)量的重要手段[5]。但是由于許多農(nóng)作物是兩性花，能夠自花授粉，雜交制種時(shí)需要人工去雄，導(dǎo)致雜交制種效率低和成本高，其應(yīng)用受到很大程度的限制；所以找到合適的雄性不育系，而且又能通過某種途徑恢復(fù)其育性是關(guān)鍵。在20世紀(jì)70年代初，中國育種家發(fā)現(xiàn)野敗型細(xì)胞質(zhì)不育水稻，并很快育成了由不育系、保持系和恢復(fù)系組成的三系雜交水稻(第1代雜交水稻)，首次實(shí)現(xiàn)了雜交水稻的大規(guī)模應(yīng)用，在中國、越南、印度尼西亞、菲律賓和美國等國家得到了廣泛的推廣，為保障人類糧食安全做出了重要貢獻(xiàn)[6]。

隨后，在20世紀(jì)70年代，中國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了水稻環(huán)境敏感雄性不育，并首創(chuàng)了以環(huán)境敏感雄性不育系和恢復(fù)系為核心的兩系雜交水稻(第2代雜交水稻)，進(jìn)一步推動(dòng)了雜交水稻育種技術(shù)的發(fā)展[6-8]。相對(duì)于三系法水稻，兩系法雜交水稻具有許多優(yōu)勢(shì)。首先，不像三系法受到嚴(yán)格的恢保關(guān)系限制，兩系法不需要特殊的恢復(fù)基因，幾乎所有正常品種都可作為恢復(fù)系，配組自由，選到優(yōu)良組合的幾率大大高于三系法，更加利于雜種優(yōu)勢(shì)的利用，在提高雜交稻組合的產(chǎn)量、米質(zhì)、抗性等方面存在更大潛在優(yōu)勢(shì)；其次，育種程序簡(jiǎn)化，周期縮短和成本降低[6,9-10]?；谏鲜雒黠@優(yōu)勢(shì)，兩系雜交稻得到了迅速的發(fā)展。目前，多數(shù)的超級(jí)雜交稻組合都屬于兩系法雜交稻，兩系雜交稻種植面積占總雜交水稻面積的一半以上[11]。

1.2 水稻環(huán)境敏感雄性不育的類型與基因克隆

植物的雄配子發(fā)育受到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核遺傳物質(zhì)的精密調(diào)控，而且在生殖階段最容易受到外界條件如光照、溫度和濕度等因素的影響。植物在生理存活條件下，雄配子的發(fā)育易受到環(huán)境條件的影響而導(dǎo)致雄性不育稱之為環(huán)境敏感雄性不育(Environment-sensitive genic male sterility，EGMS)。EGMS主要包括光敏雄性不育(Photoperiodsensitive genic male sterility，PGMS)、溫敏雄性不育(Thermo-sensitive genic male sterility，TGMS)、濕敏雄性不育(Humidity-sensitive genic male sterility，HGMS)和氮敏感雄性不育(Nitrogen-sensitive genic male sterility，NGMS)。一般來講，光敏雄性不育是指大于臨界光照時(shí)間表現(xiàn)為雄性不育，小于臨界光照時(shí)間則表現(xiàn)為雄性可育，反之稱為反光敏雄性不育(Reverse PGMS, rPGMS)。同理，溫敏雄性不育是指高于臨界溫度表現(xiàn)為雄性不育，低于臨界溫度則表現(xiàn)為雄性可育，反之則稱為反溫敏雄性不育(Reverse TGMS, rTGMS)。濕敏雄性不育指在低濕條件下表現(xiàn)為雄性不育，而在高濕條件下表現(xiàn)為雄性可育。氮敏感雄性不育在缺氮條件下表現(xiàn)為雄性不育，而高氮條件下為雄性可育。環(huán)境敏感雄性不育的育性對(duì)環(huán)境條件特別敏感，通過對(duì)其不育機(jī)理的研究，有助于理解生殖階段的植物如何感應(yīng)環(huán)境因子變化[12]?？傊?，對(duì)植物環(huán)境敏感型不育的調(diào)控機(jī)理進(jìn)行研究，不僅有利于提高其在兩系雜交育種中的利用水平，也利于理解植物如何感應(yīng)環(huán)境變化，具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

我國育種學(xué)家石明松于1973年首次發(fā)現(xiàn)的光敏雄性不育系‘農(nóng)墾58S’(NK58S)，在日照長(zhǎng)度大于14 h時(shí)表現(xiàn)為雄性不育，而日照長(zhǎng)度小于13.7 h則育性恢復(fù)。根據(jù)此特點(diǎn)，在1981年首次提出了“長(zhǎng)日雜交制種，短日自交繁種”的思路[7,13]。隨后，鄧華鳳等[14]于1988年發(fā)現(xiàn)了水稻溫敏雄性不育系‘安農(nóng)S-1’(AnS-1)，表現(xiàn)為高溫雄性不育，低溫雄性可育?；诠?溫敏基因能夠調(diào)控雄性育性的轉(zhuǎn)化特性，逐漸形成了以光/溫敏感雄性不育為主的環(huán)境敏感核雄性不育為基礎(chǔ)的兩系雜交水稻育種技術(shù)，是繼三系法雜交水稻成功以后又一個(gè)水稻雜種優(yōu)勢(shì)利用的有效途徑，開啟了兩系雜交水稻育種時(shí)代。

2 水稻環(huán)境敏感雄性不育的分子調(diào)控機(jī)理

目前，在水稻中發(fā)現(xiàn)了幾十個(gè)環(huán)境敏感雄性不育基因，但是只克隆了13個(gè)(表1)，大部分未被克隆(表2)。對(duì)它們的分子調(diào)控機(jī)理進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，它們涉及了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA代謝、氨基酸代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和花粉壁合成等過程。

表1 已經(jīng)克隆的水稻環(huán)境敏感型雄性不育基因Table 1 The cloned environment-sensitive genic male sterility genes in rice

表2 水稻中未克隆的環(huán)境敏感型雄性不育基因Table 2 The un-cloned environment-sensitive genic male sterility genes in rice

2.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程

在水稻中，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)光敏雄性不育和1個(gè)PHD轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)溫敏雄性不育。突變體csa(Carbon starved anther)為反光敏雄性不育，在短日照條件下雄性不育，在長(zhǎng)日照下雄性可育[19]；而CSA的同源基因CSA2突變后則表現(xiàn)為光敏雄性不育，在長(zhǎng)日照表現(xiàn)為半不育，而短日照表現(xiàn)為完全可育[20]。CSA編碼R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控單糖轉(zhuǎn)運(yùn)體基因OsMST8表達(dá)[43]；CSA2也同樣編碼R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子，但是并不直接調(diào)控OsMST8，可能調(diào)控其他糖類轉(zhuǎn)運(yùn)基因[20]。在短日照條件下，CSA突變后導(dǎo)致OsMST8轉(zhuǎn)錄下調(diào)，不能將糖從劍葉運(yùn)輸?shù)交ㄋ幎鴮?dǎo)致雄性不育[19]；同樣，在長(zhǎng)日照條件下，csa2突變體不能將糖從劍葉運(yùn)輸?shù)交ㄋ幎鴮?dǎo)致雄性半不育[20]。這些結(jié)果表明，CSA和CSA2既有通過調(diào)節(jié)糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因響應(yīng)光周期影響花粉發(fā)育的共同特點(diǎn)，也存在不同的表達(dá)模式和靶基因的功能分化。它們調(diào)控的下游底物及相互關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

水稻溫敏不育系‘衡農(nóng)S-1’的不育基因tms9-1的候選基因編碼1個(gè)PHD-finger轉(zhuǎn)錄因子，該基因?yàn)閿M南芥MS1的同源基因[18]。tms9-1的1個(gè)堿基T到C的置換導(dǎo)致氨基酸從L變成了P，命名為OsMS1wenmin1。OsMS1wenmin1受到溫度的調(diào)控，并且溫度依賴與TDR轉(zhuǎn)錄因子互作調(diào)控EAT1的表達(dá)，從而調(diào)控水稻溫敏雄性不育[44]。

2.2 RNA代謝過程

在水稻中發(fā)現(xiàn)了一些非編碼RNA調(diào)節(jié)光溫敏雄性不育和RNA加工過程調(diào)節(jié)溫敏雄性不育。NK58S是第1個(gè)在水稻中發(fā)現(xiàn)的光敏雄性不育系，其遺傳機(jī)理較為復(fù)雜，NK58S的花粉育性主要受光照調(diào)控，而將不育基因轉(zhuǎn)到秈稻品種‘培矮64S’(PA64S)中，其育性卻主要受溫度調(diào)控[23]。實(shí)際上，NK58S也受溫度影響，光溫之間有互補(bǔ)效應(yīng)，更高的溫度能夠縮短育性轉(zhuǎn)換成不育所需的光照時(shí)間，而更低溫則延長(zhǎng)育性轉(zhuǎn)化成不育所需的光照時(shí)間[45]。NK58S的光溫敏不育特性至少由3個(gè)基因(pms1、pms2和pms3)調(diào)控[12,46-47]，經(jīng)過多代科學(xué)家30多年的努力，張啟發(fā)院士團(tuán)隊(duì)和莊楚雄教授團(tuán)隊(duì)同時(shí)獨(dú)立克隆了NK58S的pms3和PA64S的p/tms12-1，發(fā)現(xiàn)p/tms12-1與pms3是同1個(gè)基因[12,23]。張啟發(fā)院士團(tuán)隊(duì)利用NK58S進(jìn)行精細(xì)定位發(fā)現(xiàn)NK58S的pms3座位產(chǎn)生了C到G的1個(gè)SNP變異，位于1個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)中，并將這個(gè)lncRNA命名為L(zhǎng)DMAR(Long-day-specific male-fertility-associated RNA)[22](圖1A)。較高的LDMAR表達(dá)量是維持長(zhǎng)日照條件下花粉正常發(fā)育必需的，而C到G的SNP改變了LDMAR二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高了LDMAR啟動(dòng)子的甲基化程度，減少了LDMAR的表達(dá)量，導(dǎo)致NK58S在長(zhǎng)日照條件下花粉敗育[22]。我們認(rèn)為p/tms12-1編碼的lncRNA被加工成一系列的21-nt的phasiRNA(Phased small interfering RNAs)，其中phasiRNA osa-smR5864的第11個(gè)堿基由C突變成G可能會(huì)弱化其功能或產(chǎn)生新的功能，從而導(dǎo)致粳稻的光敏雄性不育和秈稻的溫敏雄性不育[23](圖1A)。

圖1 非編碼RNA調(diào)控水稻光敏雄性不育示意圖Fig. 1 Schematic of non-coding RNA regulating environment-sensitive genic male sterility in rice

除了pms3基因外，光敏雄性不育基因pms1也相繼被克隆，該基因發(fā)生了1個(gè)G到A的單堿基突變，與pms3相似，是1個(gè)編碼lncRNAPMS1T的半顯性基因。lncRNAPMS1T能夠被22-nt的miR2118靶向，觸發(fā)21-nt phasiRNA生物合成(圖1B)。small RNA測(cè)序表明，有18對(duì)21-nt的phasiRNAs來源于PMS1T轉(zhuǎn)錄本。長(zhǎng)日照條件下，NK58S花粉母細(xì)胞中21-ntPMS1T-phasiRNAs的表達(dá)量高于短日照條件下的，也高于長(zhǎng)日照和短日照條件下重組自交系近等基因系群體的。這可能是由于在NK58S中，PMS1T從G到A的改變導(dǎo)致編碼的lncRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在長(zhǎng)日照條件下能夠被miR2118更加有效地切割，產(chǎn)生更多的21-nt phasiRNAs，進(jìn)而靶向下游的雄性不育基因[21](圖1B)。雖然光溫敏不育基因pms1和pms3(p/tms12-1)已經(jīng)被克隆，然而pms2尚未被克隆，而且它們?nèi)绾握{(diào)控靶基因影響花粉母細(xì)胞和絨氈層發(fā)育，以及它們之間是否存在相互調(diào)控尚未清楚。

莊楚雄教授團(tuán)隊(duì)和曹曉風(fēng)院士團(tuán)隊(duì)合作利用AnS-1和‘株1S’克隆了兩系雜交水稻中運(yùn)用最為廣泛的溫敏核雄性不育基因tms5[16]。AnS-1是最早發(fā)現(xiàn)的秈型溫敏不育系，在低溫(＜24 ℃)下表現(xiàn)為雄性可育，高溫(＞26 ℃)表現(xiàn)為雄性敗育，其溫敏特性由單個(gè)隱性基因tms5控制，該基因編碼區(qū)第71位堿基由C突變成A，導(dǎo)致翻譯提前終止[16](圖2)。TMS5基因編碼1個(gè)RNase ZS1酶，對(duì)受高溫誘導(dǎo)表達(dá)的泛素-核糖體L40家族(UbL40)mRNA具有直接而特異的切割活性，而且RNase ZS1切割UbL40mRNA依賴于底物的三葉草結(jié)構(gòu)[16,48]。UbL40mRNA表達(dá)受溫度誘導(dǎo)，高溫條件下，AnS-1由于T M S 5功能缺失而不能及時(shí)切割降解U bL 4 0mRNA，導(dǎo)致UbL40mRNA過度積累，引發(fā)花粉母細(xì)胞液泡化，最終導(dǎo)致花粉敗育(圖2)。在野生型水稻‘安農(nóng)’(A N)中，受溫度誘導(dǎo)的U bL 4 0mRNA能夠被TMS5及時(shí)降解而維持花粉正常發(fā)育。在低溫條件下，AnS-1和AN的UbL40mRNA表達(dá)量較低且相當(dāng)，因此無論是否存在有功能的TMS5，其花粉育性均正常[16](圖2)。通過免疫共沉淀(Co-IP)/質(zhì)譜鑒定，我們發(fā)現(xiàn)7個(gè)已知的控制花粉發(fā)育的蛋白可能被泛素化[49]，暗示UbL40可能影響花粉發(fā)育過程中的泛素平衡。同時(shí)翻譯組學(xué)表明，花粉發(fā)育過程的絨氈層細(xì)胞程序性死亡和脂質(zhì)代謝存在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的差異，進(jìn)而影響溫敏不育系的花粉發(fā)育過程[50]。這說明TMS5可能通過轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后多個(gè)水平調(diào)控水稻溫敏雄性不育。此外，利用CSRISPR/Cas9技術(shù)將水稻或玉米的TMS5(ZmTMS5)敲除，都能獲得相應(yīng)的溫敏雄性不育系，這說明TMS5在禾本科植物中可能具有保守的功能[51-52]。

圖2 tms5調(diào)控水稻溫敏雄性不育Fig. 2 tms5 regulates thermo-sensitive genic male sterility in rice

在水稻中過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶1基因(UDP-glucose pyrophosphorylase1，Ugp1)得到1個(gè)Ugp1共抑制突變體，表現(xiàn)為溫敏雄性不育：在低溫(21 ℃)下表現(xiàn)為雄性可育，而高溫(28 ℃)下為雄性不育[15]。在高溫條件下，在減數(shù)分裂早期，該突變體花粉母細(xì)胞開始降解，而絨氈層和中層降解受到抑制。Ugp1的過量表達(dá)由玉米Ubi1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，該啟動(dòng)子包含了Ubi1的第1個(gè)外顯子和第1個(gè)內(nèi)含子。高溫下，過表達(dá)Ugp1的轉(zhuǎn)錄本中上述內(nèi)含子不能被準(zhǔn)確切除，導(dǎo)致共抑制；低溫下，部分轉(zhuǎn)錄本中的上述內(nèi)含子可以被準(zhǔn)確剪切，導(dǎo)致有少量的蛋白質(zhì)被翻譯，育性部分恢復(fù)[15]。

2.3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程

編碼富含亮氨酸重復(fù)受體樣激酶(Leucine-rich repeat receptor-like kinase，LRR-RLK)基因TMS10在水稻突變后表現(xiàn)為溫敏雄性不育，在高溫(25～32 ℃)下表現(xiàn)為雄性不育，在低溫條件(22～24 ℃)下為雄性可育[17]。其同源基因TMS10L突變?cè)诟邷睾偷蜏赜跃＃莟ms10tms10l雙突變無論在高溫還是低溫下均為雄性不育，這說明兩者存在功能冗余。而且，TMS10L的表達(dá)量在低溫下是高溫的3～5倍，說明它在低溫中是十分重要的，能夠互補(bǔ)TMS10的功能，從而恢復(fù)tms10突變體在低溫下的花粉育性[17]。

2.4 花粉壁合成過程

植物花粉壁的合成受到一系列精細(xì)的調(diào)控，對(duì)于維持花粉活性、雌雄配子識(shí)別和花粉管萌發(fā)等過程具有重要意義。OsTMS18編碼葡萄糖-甲醇-膽堿(GMC)氧化還原酶，直接受OsMS188調(diào)控，合成孢粉素以形成花粉壁[24]。OsTMS18的Gly到Ser的點(diǎn)突變表現(xiàn)出溫敏雄性不育表型。然而在水稻中敲除OsTMS18使其功能喪失則導(dǎo)致低溫和高溫下都完全雄性不育，但在擬南芥中敲除其同源基因OsTMS18則是溫敏雄性不育表型，這表明OsTMS18在水稻和擬南芥中的功能具有一定的保守性，但是其雄性育性也受遺傳背景的調(diào)控[24]。

高等植物受精過程需要花粉粒吸附在柱頭并產(chǎn)生水合作用，進(jìn)而花粉管萌發(fā)將精子送至胚囊中，與卵子和中央細(xì)胞結(jié)合完成受精過程。目前在水稻中發(fā)現(xiàn)了許多濕敏雄性不育基因，如OXIDOSQUALENE CYCLASES(OsOSC12/OsPTS1)、HUMIDITY-SENSITIVE GENIC MALE STERILITY 1(HMS1)、HMS1-INTERACTING PROTEIN(HMS1I)和OsCER1/OsGL1-4[11,25-26,53]。這些基因缺失導(dǎo)致濕敏雄性不育表型，即高濕表現(xiàn)為雄性不育而低濕條件育性恢復(fù)。OsOSC12編碼氧化鯊烯環(huán)化酶，能夠?qū)⒀趸徬┐呋珊坦冉q氈醇，主要在花粉發(fā)育后期特異性表達(dá)，該基因的突變導(dǎo)致特長(zhǎng)鏈脂肪酸(Very-long-chain fatty acids，VLCFAs)合成受限，花粉外壁缺陷，在低濕時(shí)容易缺水而雄性不育，高濕不易缺水而雄性可育[25](圖3)。我們克隆了水稻濕敏雄性不育基因HMS1，其編碼β-酮脂酰輔酶A合成酶(β-ketoacyl-CoA synthase)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與HMS1I相互作用催化特長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成，合成產(chǎn)物隨后被OsCER1/OsGL1-4催化形成特長(zhǎng)鏈烷烴[11,26]。這些特長(zhǎng)鏈脂肪酸和烷烴的缺少都會(huì)影響花粉外被的形成；在低濕條件下，缺陷的花粉壁導(dǎo)致花粉保水能力降低，以極快的速度皺縮，失去活性，進(jìn)而影響花粉在柱頭上的附著、水合和萌發(fā)，導(dǎo)致濕敏不育系不能正常結(jié)實(shí)；而高濕可以恢復(fù)濕敏不育系的大部分育性[11](圖3)。此外，HMS1、HMS1I和OsCER1/OsGL1-4在擬南芥中的同源基因突變后也導(dǎo)致擬南芥濕敏不育，這說明濕敏不育在單子葉和雙子葉植物中具有保守性。濕度敏感基因通過特長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成影響花粉壁的形成，進(jìn)而影響花粉的保水能力，從而導(dǎo)致濕度敏感雄性不育。

圖3 水稻濕敏雄性不育調(diào)控機(jī)理Fig. 3 Mechanism of humidity-sensitive genic male sterility in rice

2.5 氨基酸代謝過程

最近在水稻中發(fā)現(xiàn)了1種新型氮素依賴的環(huán)境敏感雄性不育。ETFβ編碼1個(gè)線粒體定位的電子轉(zhuǎn)運(yùn)黃素蛋白β亞基，參與支鏈氨基酸的代謝。ETFβ結(jié)合電子并將電子轉(zhuǎn)運(yùn)給下游的輔酶Q氧化還原酶ETFQO，推動(dòng)氧化磷酸化，參與機(jī)體供能。etfβ突變體中，減數(shù)分裂表現(xiàn)出明顯的氮素依賴，低氮下減數(shù)分裂異常，而高氮下可以恢復(fù)育性[27]。

3 水稻環(huán)境敏感雄性不育在生產(chǎn)應(yīng)用中存在的挑戰(zhàn)與展望

3.1 環(huán)境敏感雄性不育的種質(zhì)資源較為單一

目前雖然發(fā)現(xiàn)和克隆了許多環(huán)境敏感雄性不育基因，但是大部分依然未被克隆，在生產(chǎn)上應(yīng)用的環(huán)境敏感雄性不育基因還比較少。在中國水稻兩系雜交育種中，目前95%以上不育系利用的是溫敏不育基因tms5，不利于發(fā)揮兩系雜交水稻育種的潛力。為了解決這個(gè)問題，首先，要盡可能克隆更多的環(huán)境敏感雄性不育基因，研究清楚其調(diào)控機(jī)理，以便更好地應(yīng)用于育種。其次，已知許多環(huán)境敏感雄性不育基因在不同物種中保守，可以將環(huán)境敏感雄性不育基因應(yīng)用于其他作物當(dāng)中。例如，在水稻中應(yīng)用最為廣泛的溫敏雄性不育基因TMS5，可以利用近年發(fā)展的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在玉米中敲除TMS5同源基因，導(dǎo)致玉米也具有溫敏不育表型[51]，同時(shí)使育種時(shí)間大大縮短，提高了育種效率[52]。利用基因編輯技術(shù)編輯不同物種間保守的環(huán)境敏感雄性不育基因不僅可快速獲得環(huán)境敏感雄性不育系，而且還擴(kuò)大了物種間環(huán)境敏感雄性不育基因種質(zhì)資源，大大提高其他農(nóng)作物的雜交育種潛力。

3.2 光敏雄性不育的遺傳特性不穩(wěn)定

兩系雜交水稻最開始是利用來自NK58S的光溫敏不育基因，但是其光溫敏不育特性不穩(wěn)定，繁殖多代后育性逐漸升高導(dǎo)致最后不能應(yīng)用于雜交育種，大大限制了其利用[54]。因此后來兩系雜交水稻逐漸利用遺傳特性單一且穩(wěn)定的溫敏不育基因tms5[52]。從育種安全性來說，在雜交育種中使用光敏不育系是最為安全的，因?yàn)樵谧匀粭l件下光周期比溫度、濕度等其他環(huán)境因素更穩(wěn)定。但是目前發(fā)現(xiàn)的光敏不育系的育性不僅僅只受光周期控制，還受到溫度的影響[21]。此外，光敏不育基因在不同的遺傳背景下可能會(huì)出現(xiàn)溫敏不育表型。例如，主要受光周期調(diào)控的光敏不育系NK58S，將其光敏基因?qū)攵i稻品種PA64S后，其不育性狀卻主要受溫度的調(diào)控[23]。同樣，光敏基因csa在粳稻‘9522’背景中表現(xiàn)為反光敏不育，但是在粳稻‘空育131’背景中同時(shí)表現(xiàn)為反光敏和溫敏特性[19,55]。這種在不同遺傳背景表現(xiàn)出不同的光溫敏特性的現(xiàn)象說明，環(huán)境敏感雄性不育特性除了受環(huán)境敏感雄性不育基因調(diào)控外，還受到其他基因的修飾作用。今后，如果能發(fā)現(xiàn)純粹的光敏不育基因，可以提高兩系雜交制種的安全性。

3.3 溫敏不育系的不育起點(diǎn)溫度較高影響制種安全

不育起點(diǎn)溫度(Critical sterility-inducing temperature)指溫敏不育系從可育轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆珨∮呐R界溫度，是雜交制種安全的關(guān)鍵。相同的溫敏基因在不同的品種背景中存在不同的不育起點(diǎn)溫度，具有較高的不育起點(diǎn)溫度會(huì)大大影響溫敏不育系的制種安全，限制兩系雜交育種方法的應(yīng)用范圍[52]。例如，水稻溫敏不育系的不育起點(diǎn)溫度偏高時(shí)，在夏季雜交制種時(shí)偶遇低溫天氣，溫度低于不育系的不育起點(diǎn)溫度時(shí)則會(huì)自交結(jié)實(shí)，導(dǎo)致制種不純或者失敗。據(jù)報(bào)道由于環(huán)境溫度的波動(dòng)導(dǎo)致兩系法育種失敗時(shí)有發(fā)生，多次直接經(jīng)濟(jì)損失超億元，間接損失更是無法估計(jì)[56]。所以獲得穩(wěn)定遺傳、不育起點(diǎn)溫度較低的溫敏不育系提高制種安全性，成為發(fā)展兩系雜交水稻的重要任務(wù)[57]。水稻溫敏不育系理想的不育起點(diǎn)溫度為21～24 ℃，不育起點(diǎn)溫度過低也不利于自身繁種[56,58]。然而許多水稻溫敏不育系(特別是粳稻背景)具有較高的不育起點(diǎn)溫度，大大影響制種安全甚至不能應(yīng)用于生產(chǎn)[52]。溫敏不育的不育起點(diǎn)溫度受到多個(gè)微效基因的調(diào)控，所以微效不育基因的雜合性可能是引起不育系不育起點(diǎn)溫度漂變的主要原因[59]。光溫敏核不育系核心種子生產(chǎn)的過程也是微效不育基因純合的過程，一旦微效不育基因全部純合，不育起點(diǎn)溫度將不再漂變[60-61]。但是目前鮮見關(guān)于不育起點(diǎn)溫度基因克隆和分子機(jī)理研究的報(bào)道，其中的調(diào)控機(jī)理尚不清楚，所以未來需要在這方面進(jìn)行深入研究，解決不育起點(diǎn)溫度高和不穩(wěn)定問題。