基于GC-MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)的抗炎作用機(jī)制

曾格格，劉毅，劉天琪，黃振陽(yáng)，丁晨薇

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/湖北省藥用植物研發(fā)中心，武漢 430065）

按照中藥配伍“相須、相使、相畏、相殺、相惡、相反”的原理，體現(xiàn)四氣五味、升降浮沉、歸經(jīng)等中藥藥性理論，藥對(duì)已經(jīng)成為現(xiàn)代中醫(yī)臨床常用的配伍組合［1］。中藥當(dāng)歸（Angelica sinensisRadix）來(lái)源于傘形科植物當(dāng)歸（Angelica sinensis（Oliv.）Diels）的干燥根，當(dāng)歸甘、辛、溫，歸肝、心、脾經(jīng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸不僅養(yǎng)血活血，其有效成分當(dāng)歸多糖、藁本內(nèi)酯還具有抗炎、抗血小板凝集以及抗氧化等藥理作用［2］。中藥肉桂（Cinnamomi cortex）來(lái)源于樟科植物肉桂（Cinnamomum cassiaPresl）的干燥樹(shù)皮。肉桂辛、甘、大熱，歸腎、脾、心、肝經(jīng)。肉桂中所含的肉桂醛等成分具有抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗寄生蟲(chóng)等藥理作用。現(xiàn)代研究證實(shí)，當(dāng)歸、肉桂合用可以擴(kuò)張周?chē)?，改善微循環(huán)，增加局部血液循環(huán)，促進(jìn)炎癥吸收和局部消腫作用［3］。炎癥作為一種保護(hù)性免疫反應(yīng)，炎癥反應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致病原體持續(xù)感染，而過(guò)度炎癥則導(dǎo)致慢性或系統(tǒng)性炎癥性疾?。?］。許多疾病的本質(zhì)均為炎癥反應(yīng)。因此，挖掘新型抗炎藥物對(duì)于解決炎癥性疾病具有重要作用。在《景岳全書(shū)》《備急千金要方》等相關(guān)著作中，當(dāng)歸-肉桂作為藥對(duì)制備出的各種復(fù)方制劑，常用于治療月經(jīng)不調(diào)、寒濕痹痛、肌膚麻木及關(guān)節(jié)不利等癥［5］，療效顯著，但目前關(guān)于當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)抗炎活性成分相關(guān)研究較為鮮見(jiàn)。因此，本研究采用GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜）對(duì)當(dāng)歸、肉桂及其藥對(duì)進(jìn)行比較分析，再借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出抗炎主要活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及潛在信號(hào)通路，從系統(tǒng)生物學(xué)角度探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器手動(dòng)固相微萃?。⊿PME型）進(jìn)樣裝置，德國(guó)IKA公司；氣相-質(zhì)譜-計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀（Agilent 6890/5973型），美國(guó)Hewlett-Packard公司；頂空瓶（15 mL）；65 μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取纖維頭，美國(guó)Supelco公司；電子天平（ALC-210.2型），北京賽多利斯天平有限公司。1.1.2藥材當(dāng)歸、肉桂藥材均購(gòu)于湖北辰美中藥有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定，分別為傘形科植物當(dāng)歸的干燥根及樟科植物肉桂的干燥樹(shù)皮。

1.1.3 藥材的前處理將當(dāng)歸、肉桂藥材分別用粉碎機(jī)打成粉末并過(guò)16目篩，取出備用。

1.2 方法

1.2.1 GC-MS色譜與質(zhì)譜條件

1）GC條件。色譜條件HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：從50℃開(kāi)始，以10℃/min升溫至230℃，保留3 min；載氣：高純度He（99.999%），柱流速：0.8 mL/min，進(jìn)樣口溫度：230℃。

2）MS條件。EI源；離子源溫度230℃，電離能70 eV；四級(jí)桿溫度150℃；掃描質(zhì)量范圍35? 550m/z。

1.2.2 頂空固相微萃取條件將當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)粗粉混合，以萃取吸附量多少、能否達(dá)到最佳萃取效果、總峰面積盡可能大作為參考要求。將樣品量、萃取溫度、萃取以及解析時(shí)間分別進(jìn)行單因素考察。最終確定GC-MS的最佳條件：精密稱(chēng)取當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)粉末0.6 g（當(dāng)歸、肉桂各0.3 g），置于15 mL頂空瓶中，插入裝有65 μm PDMS/DVB型萃取纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，100℃預(yù)平衡20 min，再伸出萃取頭頂空萃取15 min，取出后立即插入色譜儀進(jìn)樣口（溫度230℃），解吸3 min。

1.2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1）成分?jǐn)?shù)據(jù)收集與獲取。將當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)揮發(fā)性成分CAS號(hào)輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）［6］搜索欄進(jìn)行檢索，獲取化合物的相關(guān)靶點(diǎn)信息。并在Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）［7］搜索欄輸入成分的CAS號(hào)，得到其分子結(jié)構(gòu)，并保存為Canonical SMILES格式。將下載的SMILES格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）［8］，選定研究物種為“Homo sapiens”，得到成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，整合TCMSP和Swiss Target Prediction靶點(diǎn)結(jié)果，刪去重復(fù)的作用靶點(diǎn)，得到組分潛在作用靶點(diǎn)。

2）疾病靶點(diǎn)獲取。搜索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org）［9］和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）［10］，以inflammation為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得作用靶點(diǎn)，將上述數(shù)據(jù)庫(kù)所獲取的靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值后進(jìn)行合并。

3）潛在作用靶點(diǎn)獲取。使用UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）［11］將疾病靶點(diǎn)與藥物成分的潛在靶點(diǎn)統(tǒng)一規(guī)范為Gene Symbol，其后將化合物、疾病的靶點(diǎn)錄入Venny 2.1.0軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線(xiàn)作圖工具平臺(tái)，繪制韋恩圖，得到兩者交集（即共同靶標(biāo)），作為潛在作用靶點(diǎn)。

將TCMSP和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)收集的潛在作用靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)成分分別導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件［12］，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，使用Network Analyzer功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)Degree、Betweenness、Closeness篩選出其抗炎的主要活性成分。

1.2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析將疾病與藥物的交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)［13］獲取靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)模型，設(shè)置minimum required interaction score為0.4，刪除孤立點(diǎn)；獲得蛋白相互作用信息，并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)渲笜?biāo)分析，篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.5 富 集 分 析利 用“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包（Bioconductor）［14］對(duì)疾病與藥物的交集靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息富集分析，包括GO分析以及KEGG通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)揮發(fā)性成分分析

通過(guò)選定的萃取條件對(duì)當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)進(jìn)行試驗(yàn)，得到當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)GC-MS總離子流。通過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及文獻(xiàn)比對(duì)，從當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)中共檢測(cè)出51個(gè)峰（圖1），初步鑒定出35種成分，占總揮發(fā)性成分的70.53%。其中，揮發(fā)性成分含量較高的有α-蒎烯（29.80%）、Δ-杜松烯（8.59%）、（3E）-3，7-二甲基辛-1，3，6-三烯（7.97%）、（-）-菖蒲烯（6.64%）、β-欖香烯（4.17%）、β-石竹烯（2.87%）、α-律草烯（2.42%）等（表1）。

表1 當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)揮發(fā)性成分分析結(jié)果

圖1 當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)揮發(fā)性成分的總離子流

2.2 潛在靶點(diǎn)收集

根據(jù)藥對(duì)的CAS號(hào)，在TCMSP及Swiss數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，合并且刪掉重復(fù)的作用靶點(diǎn)，共得到靶點(diǎn)398個(gè)。通過(guò)Therapeutic target datebase數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)得到炎癥相關(guān)基因靶點(diǎn)1 639個(gè)，在Venny 2.1.0軟件在線(xiàn)作圖工具平臺(tái)上輸入成分、疾病的靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，兩者取交集后得到共同靶點(diǎn)184個(gè)（圖2）。

圖2 成分、疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

2.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將化學(xué)成分及184個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)繪制（圖3），此網(wǎng)絡(luò)由219個(gè)節(jié)點(diǎn)和659條邊構(gòu)成，并通過(guò)Network Analyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)重要的抗炎活性成分包括α-蒎烯、β-欖香烯、β-石竹烯、α-律草烯、（-）-異灑剔烯、肉桂醛、二正戊基酮、別羅勒烯、苯乙烯、（-）-菖蒲烯、鄰甲氧基肉桂醛等，均能與多個(gè)靶點(diǎn)相連接。同時(shí)，又可共同作用于一些靶點(diǎn)，體現(xiàn)了揮發(fā)油多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的綜合調(diào)節(jié)特點(diǎn)。

圖3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入184個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，得到蛋白相互作用信息，使用Cytoscape 3.7.2軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行篩選，以高于介度（Betweeness）、緊密度（Closeness）的中位數(shù)且連接度（Degree）大于2倍中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出35個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（表2），其中度值（Degree）最高的為T(mén)NF，能與128個(gè)蛋白發(fā)生相互作用，其 次 是IL-6、IL-1β、AKT1、STAT3、MAPK3、TLR4等，分別能與125、107、104、84、83、79個(gè)蛋白發(fā)生相互作用。PPI網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖4，圖形顏色越深、圖形越大，靶點(diǎn)度值越高，說(shuō)明其對(duì)應(yīng)的節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要，反之，顏色越淺，節(jié)點(diǎn)越小，代表度值越低。

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)信息

圖4 當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 靶點(diǎn)通路分析

利用“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包（Bioconductor）對(duì)疾病與藥物的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG信號(hào)通路富集分析。得到1 296個(gè)生物學(xué)過(guò)程（Biological process，BP）、31個(gè)細(xì)胞組成（Cellular component，CC）、89個(gè)分子功能（Molecular function，MF），設(shè)定P＜0.05，將每一類(lèi)按照顯著性進(jìn)行排序，將排在前10的GO富集條目和排在前20的KEGG富集條目通過(guò)氣泡圖的形式進(jìn)行展示，圓圈大小或線(xiàn)條長(zhǎng)度表示富集在GO和KEGG的基因數(shù)目，顏色代表富集的顯著性。

由圖5可知，當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)發(fā)揮抗炎作用主要涉及的生物學(xué)過(guò)程（BP）包括對(duì)脂多糖的反應(yīng)（Re-sponse to lipopolysaccharide）、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)（Response to molecule of bacterial origin）、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)（Response to nutrient levels）等；細(xì)胞組成富集分析（CC）包括膜筏（Membrane raft），膜微區(qū)（Membrane microdomain），膜區(qū)（Membrane region）等；分子功能富集分析（MF）包括細(xì)胞因子受體結(jié)合（Cytokine receptor binding）、血紅素結(jié)合部位（Cytokine receptor binding）、類(lèi)固醇結(jié)合（Steroid binding）等。

圖5 GO功能富集分析

KEGG通路分析結(jié)果（圖6）顯示，當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)發(fā)揮抗炎作用排名前20的信號(hào)通路，關(guān)鍵通路包括脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、人巨細(xì)胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、乙型肝炎（Hepatitis B）、點(diǎn)樣受體信號(hào)通路（NOD-like receptor signaling pathway）等，表明揮發(fā)油可通過(guò)作用于不同的生物過(guò)程和通路協(xié)同發(fā)揮抗炎作用。

圖6 KEGG通路富集分析

3 小結(jié)與討論

本研究采用GC-MS對(duì)當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)的揮發(fā)性成分進(jìn)行比較分析，從當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)中鑒定出35個(gè)成分，占總揮發(fā)性成分的70.53%。將藥對(duì)與炎癥潛在作用靶點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)成分分別導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，篩選出其主要的活性成分，發(fā)現(xiàn)α-律草烯，α-蒎烯、正丁烯基苯酞、β-石竹烯、β-欖香烯、Δ-杜松烯等揮發(fā)性成分，有研究表明其均具有良好的抗炎、抗癌、鎮(zhèn)痛等作用，具有較高的保健和醫(yī)療應(yīng)用價(jià)值，還具有抗氧化、抗衰老、抗炎、保護(hù)心血管、防治腫瘤、改善免疫功能等作用［15-18］。α-蒎烯能抑制大鼠巨噬細(xì)胞中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、NO的生成及核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)通路（NF-κB通路），從而具有抗炎作用［19］；β-石竹烯、β-欖香烯通過(guò)對(duì)PPARA-RXRA-NCOA2信號(hào)軸與PTGS2、PTGS1、IL-6等炎性因子的潛在作用，從而發(fā)揮產(chǎn)熱、減脂、抗炎作用［20］。PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，從184個(gè)潛在作用靶點(diǎn)中篩選出35個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)主要通過(guò)TNF、IL-6、IL-1β、AKT1等炎癥因子相互作用協(xié)同發(fā)揮抗炎作用。腫瘤壞死因子（TNF）［21］在抑制炎癥反應(yīng)之外可以誘發(fā)降壓以及腎臟利尿排鈉反應(yīng)；IL-6作為一種由T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等細(xì)胞分泌出來(lái)的炎性細(xì)胞因子，具有較突出的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化、免疫抑制等功能；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）作為目前臨床工作中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素，主要功能在于參與內(nèi)源性致熱源與炎癥反應(yīng)［22］。KEGG通路結(jié)果表明，當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)主要通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、點(diǎn)樣受體信號(hào)通路（NOD-like receptor signaling pathway）、弓形體?。═oxoplasmosis）、IL-17信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、耶爾森菌感染（Yersinia infection）、Toll樣受體（Toll-like receptor）、TNF等信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。其中，IL-17信號(hào)通路被認(rèn)為可影響mRNA轉(zhuǎn)錄，在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，IL-17是一種強(qiáng)有力的炎癥性白細(xì)胞介素，能激活其他促炎細(xì)胞因子的表達(dá)［23］，其主要由輔助性T細(xì)胞（Th17細(xì)胞）和其他來(lái)源產(chǎn)生，包括自然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。TNF信號(hào)通路可通過(guò)CD14+巨噬細(xì)胞共同刺激和激活固有層T淋巴細(xì)胞（CD14+細(xì)胞膜結(jié)合的TNF與固有層T細(xì)胞上的TNFR2相互作用）來(lái)調(diào)節(jié)腸道炎癥?？傊?，本研究采用GC-MS對(duì)當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)進(jìn)行分析，并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示了抗炎活性成分及其作用機(jī)制，結(jié)果表明，當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)通過(guò)多種成分、多靶點(diǎn)共同調(diào)控炎癥信號(hào)通路及炎癥疾病通路，影響炎癥生物學(xué)過(guò)程，發(fā)揮抗炎作用，從而治療疾病，為當(dāng)歸-肉桂藥對(duì)后續(xù)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和方向。