廣西莪術(shù)優(yōu)良種質(zhì)單株產(chǎn)量和揮發(fā)油含量的聚類分析

楊妮，謝巍，王建

（1.柳州市婦幼保健院（廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院、兒童醫(yī)院），廣西 柳州 545001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001）

廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensis）為姜科姜黃屬植物，以干燥根莖入藥，其味辛、苦，性溫，具有行氣破血、消積止痛的作用［1］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，廣西莪術(shù)中可分離得到多種化學(xué)成分，主要包括揮發(fā)油類和姜黃素類化合物，具有抗腫瘤、抗血小板聚集、抗血栓、調(diào)血脂、抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖、抗氧化等多種藥理作用，具有良好的臨床應(yīng)用前景［2，3］。目前國內(nèi)外學(xué)者對廣西莪術(shù)的研究主要包括藥用良種選育、藥用栽

培、化學(xué)成分、藥材質(zhì)量控制、藥理作用、觀賞園藝等方面［4-9］。楊妮等［4］、王建等［5］對廣西莪術(shù)良種選育、植株形態(tài)學(xué)、藥材性狀、成分分析進(jìn)行了研究。為進(jìn)一步選育優(yōu)良廣西莪術(shù)種質(zhì)資源，本研究以不同種質(zhì)廣西莪術(shù)的產(chǎn)量、揮發(fā)油含量及成分為評價指標(biāo)，采用系統(tǒng)聚類法對產(chǎn)量及揮發(fā)油含量高的種質(zhì)進(jìn)行分析，為建立廣西莪術(shù)品種選育提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

FA1004型電子天平（上海精科天平儀器廠），98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司），揮發(fā)油提取器，Agilent 7890N/5975NGC-MS型聯(lián)用儀（美國安捷倫）；超聲儀；LG16-W型離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；試劑均為國產(chǎn)分析純。藥材采自廣西玉林、興業(yè)、欽州、靈山、貴港、桂平、平南、青塘、橫縣、邕寧、金秀等地，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)王建教授鑒定為姜科植物廣西莪術(shù)，不同種質(zhì)材料共計150份，按照植物學(xué)性狀（株高、葉長、葉寬、葉面有無被毛）及藥材性狀進(jìn)行分類編號，集中種植于廣西南寧市仙葫種植基地，并統(tǒng)一栽培管理，保證了除種質(zhì)本身存在差異外其他條件（栽培基地條件、氣候條件、田間管理、施肥種類、施肥時間與數(shù)量等）完全一致，連續(xù)種植繁育6年，保證非處理因素的一致性。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)量測定將成熟后采收的不同種質(zhì)的廣西莪術(shù)材料共150份，置于通風(fēng)庇蔭處存放2 d，風(fēng)干表面泥沙，防止發(fā)霉變質(zhì)。用枝剪剪去須根，分離出莪術(shù)（Curcuma aeruginosaRoxb.）和郁金（Curcuma rcenyujinY，H.Chenet C.Ling），其次用刷子刷去莪術(shù)和郁金表面的泥沙及頂端枯葉，為準(zhǔn)確測量數(shù)據(jù)做準(zhǔn)備，并對每個材料的藥材性狀進(jìn)行詳細(xì)記錄。將上述清理干凈的藥材進(jìn)行準(zhǔn)確稱量，天平稱定單株莪術(shù)藥材重量。

1.2.2 揮發(fā)油提取將上述稱重后材料中單株莪術(shù)重量大于150 g的材料取出備用。提取試驗(yàn)方法參照《中國藥典》（2015版）四部通則中揮發(fā)油測定法，分別取不同種質(zhì)廣西莪術(shù)當(dāng)選株系的根狀莖洗凈、晾干，每份取鮮品100.0 g，切碎。置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL，加熱煮沸并保持微沸7 h，待冷卻靜置分層后讀取揮發(fā)油體積，并收集揮發(fā)油置于2 mL離心管中保存，計算得油率，揮發(fā)油得油率=（V/m）×100%，其中，V為提取揮發(fā)油體積（mL）；m為藥材質(zhì)量（g）。含油量≥0.5 mL/100 g的種質(zhì)被認(rèn)定為含油量高種質(zhì)。1.2.3揮發(fā)油成分GC-MS分析樣品預(yù)處理：取揮發(fā)油約0.05 mL，加入甲醇稀釋至約1.5 mL，超聲5 min后取出，加入無水硫酸鈉適量除去水分，離心10 min，取出備用。

GC-MS測定條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×0.32 mm×0.25 μm）。升溫程序?yàn)槌跏?0℃（4 min），以10℃/min升溫至100℃，再以4℃/min升溫至108℃，保持2 min，以4℃/min升溫至156℃，保持10 min，以20℃/min升溫至280℃，保持2 min；氣化溫度250℃，檢測器溫度280℃；載氣為高純氦氣；載氣流量1.5 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比50∶1；溶劑延遲3 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃；圖譜庫為NIST08。

1.2.4 揮發(fā)油成分聚類分析系統(tǒng)聚類分析，可以將多個樣本按照設(shè)定的距離聚成新的一類，操作較為簡便且結(jié)果直觀。利用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包中的聚類分析程序分別以莪術(shù)揮發(fā)油產(chǎn)量及顏色、莪術(shù)揮發(fā)油成分為指標(biāo)對篩選出的優(yōu)質(zhì)藥材進(jìn)行聚類分組。采用Z-score法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換。其中，式中，為各變量的算術(shù)平均值1，2，…，p），Sj為標(biāo)準(zhǔn)差，n為樣本點(diǎn)個數(shù)，p為自變量的個數(shù)；Zij為標(biāo)準(zhǔn)化后的變量值；xij為實(shí)際變量值。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理的變量權(quán)重相同，均值為零，方差為1。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)量種質(zhì)材料統(tǒng)計

對150份材料產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中有39個材料單株莪術(shù)重量＞200 g，被初步認(rèn)定為產(chǎn)量高的優(yōu)良種質(zhì)材料。其中，玉9/B56的產(chǎn)量最高，單株莪術(shù)重量達(dá)1 343.0 g，玉8/A81產(chǎn)量次之，單株莪術(shù)重量達(dá)916.0 g。莪術(shù)單株重量＞500 g的材料有13個，這些材料在產(chǎn)量方面表現(xiàn)出其種質(zhì)的優(yōu)越性（表1）。

表1 39個高產(chǎn)量種質(zhì)材料含油量及產(chǎn)量統(tǒng)計

2.2 高油量種質(zhì)材料統(tǒng)計

篩選單株莪術(shù)重量大于150 g的種質(zhì)材料共51份，進(jìn)行揮發(fā)油提取，統(tǒng)計揮發(fā)油出油率。51份材料中發(fā)現(xiàn)有21份材料揮發(fā)油的含量≥0.5 mL/100 g，研究認(rèn)定為含油量高的材料，其中，玉18/B97揮發(fā)油含量最高，達(dá)1.41 mL/100 g，玉11/A28含油量次之，為1.32 mL/100 g，含油量≥0.90 mL/100 g的材料有10個，這些種質(zhì)在含油量方面表現(xiàn)出種質(zhì)的優(yōu)越性（表2）。

表2 21個高油量的種質(zhì)材料含油量及產(chǎn)量統(tǒng)計

2.3 高產(chǎn)量和高油量材料統(tǒng)計

選取揮發(fā)油含量≥0.5 mL/100 g，且單株莪術(shù)重量≥400 g以上的種質(zhì)材料，認(rèn)定為產(chǎn)量和含油量均高的材料。產(chǎn)量和揮發(fā)油均高的材料有18個，其中，玉18/B97、玉11/A28的揮發(fā)油含量較高，分別達(dá)1.41、1.32 mL/100 g，同時其單株莪術(shù)藥材重也較高，分別達(dá)416.5、307.0 g，是表現(xiàn)優(yōu)良的種質(zhì)（表3）。

表3 18個高產(chǎn)量和高油量種質(zhì)材料含油量及產(chǎn)量統(tǒng)計

2.4 GC-MS檢測結(jié)果

對“2.3”篩選的18個高產(chǎn)量和高油量種質(zhì)材料進(jìn)行揮發(fā)油成分分析，吸取離心后的揮發(fā)油1 μL進(jìn)行分析測定。通過GC-MS分析，得出18個優(yōu)良種質(zhì)廣西莪術(shù)鮮品揮發(fā)油的質(zhì)譜圖，通過化學(xué)工作站數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析，按峰面積歸一化法進(jìn)行計算求得各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對百分含量。通過NIST08標(biāo)準(zhǔn)圖庫進(jìn)行檢索，選取匹配度SI＞90%的化合物，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工檢索和解析，確認(rèn)各化合物，共鑒定出36個化合物（表4）。

表4 18個高產(chǎn)量和高油量材料揮發(fā)油成分GC—MS分析

2.5 廣西莪術(shù)揮發(fā)油產(chǎn)量及顏色聚類分析

以揮發(fā)油產(chǎn)量及顏色為變量，對18個種質(zhì)進(jìn)行聚類，可分為3類（表5），其中1類有8個品種，單株重量為500 g，揮發(fā)油多為紫褐，偶有紫灰色；Ⅱ類有7個品種，單株重量為800?900 g，揮發(fā)油多為黃色，偶有淺黃色；Ⅲ類有3個品種，單株重量為400?600 g，揮發(fā)油多為淺黃色和黃色。

表5 18個高產(chǎn)量和高油量材料揮發(fā)油產(chǎn)量及顏色聚類分析

2.6 揮發(fā)油成分的聚類分析

利用SPSS 22.0聚類分析軟件，先對全部數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化處理，再利用標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。分別篩選特征性組分，以不同的成分為變量進(jìn)行分析。由圖1可以看出，以全部成分為變量時所得成分聚類分為2類，玉14/C29、C108、玉11/A28、玉13/C106、玉18/B97、藥用2、A28聚為一類；廣城1、玉10/A12、藥圃、C39、C105、C16、玉6/C84、玉22、玉1/C59、玉17/B6、玉4/B81聚為一類。

圖1 以揮發(fā)油所有成分為變量所得成分聚類分析

3 小結(jié)與討論

3.1 不同種質(zhì)廣西莪術(shù)藥材產(chǎn)量及揮發(fā)油含量比較

150份研究材料產(chǎn)量及揮發(fā)油含量統(tǒng)計結(jié)果顯示，不同種質(zhì)產(chǎn)量及揮發(fā)油含量均存在一定差異，其中，玉9/B56、玉8/A81等13個材料在產(chǎn)量方面表現(xiàn)出其種質(zhì)的優(yōu)越性，莪術(shù)單株重量＞500 g；揮發(fā)油提取數(shù)據(jù)可得出21份材料揮發(fā)油的含量≥0.5 mL/100 g，其中，玉18/B97、玉11/A28的材料含油量較高，后期應(yīng)繼續(xù)關(guān)注成分分析研究。

3.2 產(chǎn)量及揮發(fā)油均高的廣西莪術(shù)優(yōu)良種質(zhì)篩選

根據(jù)2015年版《中國藥典》規(guī)定，莪術(shù)干品含揮發(fā)油≥1.5%（mL/g）。莪術(shù)折干率5∶1，因此莪術(shù)鮮品揮發(fā)油應(yīng)≥0.3%（mL/g），故認(rèn)為廣西莪術(shù)鮮品每100 g中揮發(fā)油提取量≥0.3 mL的樣品為優(yōu)質(zhì)品種。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)量及揮發(fā)油含量均高的種質(zhì)共18種，主要包括玉18/B97、玉11/A28、藥圃等。其中，玉11/A28為長勢好、含油量及產(chǎn)量高的優(yōu)質(zhì)品種，與其歸為一類的莪術(shù)具有以下特征：揮發(fā)油顏色多為紫褐，偶有紫灰色；揮發(fā)油含量較高，可達(dá)1.2 mL/100 g，藥材單株質(zhì)量500 g。

3.3 揮發(fā)油成分差異比較

對產(chǎn)量及揮發(fā)油均高的18個廣西莪術(shù)種質(zhì)進(jìn)行GC-MS揮發(fā)油成分分析，發(fā)現(xiàn)共有成分樟腦、β-欖香烯、莪術(shù)烯、龍腦含量差異較大，各樣品色譜圖的有效成分出峰時間基本相同，但因所含的成分各不相同，每個樣品的色譜峰均有差異。其中有效成分莪術(shù)烯、β-欖香烯均能檢測到，而重要有效化學(xué)成分吉馬酮，依據(jù)匹配度SI＞90%進(jìn)行檢索，并未檢索到吉馬酮，可能由于揮發(fā)油提取過程中保存不當(dāng)損失所致。根據(jù)以上結(jié)果分析，綜合單株產(chǎn)量、揮發(fā)油得油率、有效成分相對含量3個方面考慮，A28、玉14/C29、玉18/B97、玉11/A28、藥用2、C39在所有樣品中品質(zhì)較優(yōu)，該分析結(jié)果可為后期選育優(yōu)良種質(zhì)試驗(yàn)提供依據(jù)。

3.4 聚類分析在優(yōu)良種質(zhì)篩選研究中的可行性

選育優(yōu)良種質(zhì)資源時，需對所有樣本進(jìn)行初步梳理與確認(rèn)，本研究涉及樣本較多，聚類分析法可進(jìn)行品種的歸類，從而選育出每一類中的優(yōu)良品種，同時綜合多個不同側(cè)重點(diǎn)的數(shù)據(jù)篩選出長勢好、產(chǎn)量高、含油高的品種；成分聚類分析是中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的有力手段，通過聚類分析的方法可初步篩選出含有不同有效成分的廣西莪術(shù)品種，臨床應(yīng)用時可選擇有效成分含量高的種質(zhì)材料，保障臨床治療效果，減少藥材損耗量；同時聚類分析結(jié)果可為良種選育提供必要的參考依據(jù)，可初步判定不同種質(zhì)廣西莪術(shù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，進(jìn)行良種選育時可選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種進(jìn)行雜交，提高種內(nèi)變異，有助于在種內(nèi)傳遞性狀優(yōu)良的遺傳基因。