蘭州百合鱗片氣培腐爛病病原菌的分離與鑒定

胡雨萌，曹彩霞，呂莉珍，巨秀婷，

（青海大學(xué)，a.農(nóng)牧學(xué)院；b.高原花卉研究中心/青海省園林植物與觀賞園藝研究重點實驗室，西寧 810016）

蘭州百合（Lilium davidiivar.unicolor）屬川百合的變種，味甘而不苦，被稱為甜百合，其鱗片緊密包合、色澤白皙、肉質(zhì)豐厚［1］，多年生可食用植物，主要種植在甘肅省中部地區(qū)［2］，也是中國的傳統(tǒng)藥用植物［3］。蘭州百合以無性繁殖為主，最常用和繁殖系數(shù)最高的材料是鱗片［4］。氣培法繁殖是在人工控制條件下將蘭州百合鱗片裸露于空氣中培養(yǎng)的一種無性繁殖方式［5］。利用氣培法生產(chǎn)蘭州百合種球，操作方法簡單易行，且投資較少，生長周期短，繁殖速率高，可進行規(guī)?；a(chǎn)［6］。氣培過程雖不使用培養(yǎng)基質(zhì)和營養(yǎng)液，但在培養(yǎng)初期鱗片仍易發(fā)生腐爛病害，使得繁殖速率受到影響，降低繁殖系數(shù)。

百合是一種較易感病的植物，病害可能成為生產(chǎn)中的重要制約因素［7］，且真菌性病害占較大比重［8］，并已有多種百合在培養(yǎng)過程中發(fā)生此類病害的相關(guān)報道［9-11］。蘭州百合病害的病原菌研究主要集中在鱗莖腐爛方面，在貯藏期間分離得到引起鱗莖腐爛的病原菌分別為黃曲霉和米根霉［12］；在生長期間發(fā)生的蘭州百合枯萎病主要是由鐮刀菌侵染所引起的土傳病害，會使肉質(zhì)根和基盤變褐腐爛［13］。目前，關(guān)于蘭州百合在氣培過程中鱗片腐爛病的研究鮮見報道。

為明確蘭州百合在氣培過程中發(fā)生鱗片腐爛病的原因，并確定其病原菌種類，本研究采集在氣培初期出現(xiàn)腐爛病害的發(fā)病組織，對病原物進行分離、純化、致病性測定，并對致病菌進行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)的雙重鑒定，為深入探究蘭州百合鱗片在氣培過程中腐爛病的發(fā)病規(guī)律及在生產(chǎn)過程中進行有效的病害控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

選取飽滿、無病蟲損傷的蘭州百合鱗莖，剝?nèi)△[片消毒，置于具有透水孔的催培盤中進行空氣培養(yǎng)。氣培初期（3?7 d），收集所有出現(xiàn)褐色、變軟、潰爛癥狀的疑似有腐爛病發(fā)生的鱗片，進行病原菌分離。

1.2 病原菌的分離與純化培養(yǎng)

采用組織分離法，用無菌水清洗具腐爛癥狀的蘭州百合鱗片，將病健組織交界處剪成5 mm×5 mm的小塊，用75%乙醇消毒30 s，7.5%次氯酸鈉處理3 min，無菌水沖洗3次；置于PDA平板培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度25℃，培養(yǎng)3?5 d。保留同批PDA培養(yǎng)基作為空白對照。待長出菌絲后，挑取不同菌落邊緣，分別置于PDA培養(yǎng)基中進行進一步純化，在25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3?5 d，多次分離直至純化，觀察菌落形態(tài)。菌株編號方式為菌落編號-菌落分離培養(yǎng)皿編號-純化培養(yǎng)皿編號（如1-A-11、1-B-1等）。

1.3 致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則選取健康的蘭州百合鱗片，用75%乙醇進行表面消毒，無菌水清洗。在超凈工作臺內(nèi)用滅菌手術(shù)刀將消毒后的健康鱗片劃傷，并用滅菌接種針挑取分離純化得到的菌株邊緣菌絲，將菌絲覆蓋在健康鱗片的傷口上，每種菌重復(fù)3次，并設(shè)空白對照。將接種的蘭州百合鱗片置于有浸水濾紙的培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)，每天檢查濾紙是否濕潤，若濾紙變干，在培養(yǎng)皿中加無菌水，直到濾紙濕潤，水略多于濾紙表面，補水完成。在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。

1.4 形態(tài)學(xué)鑒定

將致病菌菌株的菌絲挑出，用壓片法制成臨時玻片，置于電子顯微鏡（Nikon DS-Fi2）下觀察菌絲及孢子形態(tài)。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

利用CTAB法進行致病菌DNA提取，用真菌鑒定的通用引物對致病菌菌絲DNA進行ITS-PCR擴增。參照擴增程序［11］進行優(yōu)化：預(yù)變性94℃，34 min；變性94℃，1 min；退火54℃，1 min；延伸72℃，1 min，共36個循環(huán)；最后72℃，10 min；4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增結(jié)果。將500 bp左右的清晰條帶進行切膠回收，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。

利用NCBI中提供的Blast工具對所得序列進行同源性比對分析，并下載與致病菌菌株相似度最高的ITS序列，采用鄰接法，運用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

色澤潔白、品相良好且飽滿的蘭州百合鱗片（圖1A）放置在催培盤中進行氣培。培養(yǎng)初期發(fā)病鱗片凹面變紅，培養(yǎng)7?9 d鱗片頂部及基部開始形成略顯褐色的點狀物，逐漸擴展成為不規(guī)則的褐色病斑，隨著培養(yǎng)時間的延長，病斑逐漸向四周擴展，腐爛組織不斷增加，培養(yǎng)15 d左右整個鱗片軟化腐爛（圖1B），無分化小鱗莖能力。在25℃、500 lx氣培環(huán)境條件下蘭州百合鱗片腐爛率可達11.5%。

圖1 蘭州百合鱗片腐爛病癥狀

2.2 病原菌的分離純化、致病性測定

采集鱗片腐爛病不同發(fā)病組織9份，分離純化后共獲得18株真菌分離物并全部進行致病性檢測。其中，1-A-11、10-A-1、10-A-2、1-B-1菌株接種于蘭州百合健康鱗片后，培養(yǎng)5 d開始出現(xiàn)不同程度的腐爛癥狀，并與自然發(fā)病的典型腐爛病癥狀一致。菌株1-A-11（圖2A）、10-A-1（圖2B）、10-A-2（圖2C）接種培養(yǎng)7 d后，接種部位均出現(xiàn)規(guī)則的褐色病斑，病斑上附著白色絲狀物，病斑中央呈腐爛狀，隨著培養(yǎng)時間延長并逐漸向四周擴展（圖2）；3個菌株接種發(fā)病率分別為95%、75%、75%。菌株1-B-1的接種部位除出現(xiàn)上述癥狀外，還伴有灰色霉層產(chǎn)生（圖2D），接種發(fā)病率為100%。對照在氣培過程中生長良好，無任何發(fā)病癥狀（圖2E）。在回接的發(fā)病部位分離到與原接種菌形態(tài)一致的分離物，再次根據(jù)柯赫氏法則進行致病性檢測，驗證得到菌株1-A-11、10-A-1、10-A-2、1-B-1為致病菌。

圖2 人工接種病原菌蘭州百合鱗片的感病癥狀

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株1-A-11、10-A-1、10-A-2、1-B-1分別在PDA培養(yǎng)基25℃恒溫培養(yǎng)后，按照培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征可大致分為2類。

2.3.1 以1-A-11、10-A-2為代表的菌株菌落正面菌絲呈致密絲絨狀，白色并附有淡黃色（圖3A），菌落背面中心呈淡紫色輪紋，基物不變色，分支較少（圖3B）。小型分生孢子呈橢圓形或卵圓形，無色，中間寬，兩端漸尖，有1?2隔，大小為（4.5?13.1）μm×（1.2?3.7）μm；大型分生孢子鐮刀狀，兩端略尖，有2?3隔，大小為（26.4?42.1）μm×（3.9?6.7）μm（圖3C、圖3D）?？沙醪借b定病原菌類型為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

2.3.2 以10-A-1、1-B-1為代表的菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落正面呈圓形，菌絲為棉絮狀（圖3E），背面為明顯的淺紫色放射狀菌落，有隔菌絲，分支較多，菌絲內(nèi)有圓形內(nèi)容物（圖3F）。小型分生孢子數(shù)量多，鏈狀生長，有棒形、柱形，單細(xì)胞或有1?2隔，大小為（4.8?13.9）μm×（1.4?3.2）μm；大型分生孢子呈鐮刀狀，兩端尖，有3?5個隔膜，大小為（23.8? 42.5）μm×（4.1?7.1）μm；產(chǎn)孢細(xì)胞為單瓶梗，未見厚垣孢子（圖3G、圖3H）。初步鑒定為富士鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）。

圖3 菌落形態(tài)及鏡檢

2.4 分子生物學(xué)鑒定

以菌株1-A-11、10-A-1、10-A-2、1-B-1的菌絲DNA為模板，經(jīng)通用引物ITS1/ITS4擴增后，得到ITS序列長度為500?600 bp的條帶（圖4）。測序后進行Blast同源性比對，菌株1-A-11與Fusarium oxysporumstrain MJ-23（登錄號：KF751873）相似性最高，為99.47%；菌株10-A-2與Fusarium oxysporumf.sp.lentis isolate FLS65（登錄號：KU671042）一致性達99.82%；菌株10-A-1與Fusarium fujikuroiisolate YN27（登錄號：MN696097）序列相似性為99.82%；菌株1-B-1與Fusarium fujikuroistrain SAPB7（登錄號：KX343958）相似性最高，為99.64%（圖5）。

圖4 4株菌株rDNA-ITS序列的PCR擴增

基于rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），表明4個病原菌菌株1-A-11、10-A-2、10-A-1、1-B-1與鐮刀菌屬的多條序列聚集在一個大的樹狀分支上，其中，菌株1-A-11、10-A-2與尖孢鐮刀菌（登錄號：KF751873、KU671042、MF629741）聚在同一小分支上，并與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，將其鑒定為尖孢鐮刀菌；菌株10-A-1、1-B-1與富士鐮刀菌（登錄號：KX343958、MN696097）聚在同一小分支上，同樣與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，將其鑒定為富士鐮刀菌。

圖5 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建4種蘭州百合鱗片腐爛病病原菌及相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結(jié)與討論

在百合病害中，鱗莖腐爛病是近年來發(fā)生最普遍的真菌性病害，發(fā)病率達20%?30%。在1926年首次證實該病害是由鐮刀菌引起［14］，且在龍牙百合［15］、西班牙百合［16］、蘭州百合［17］中已有相關(guān)報道。鐮刀菌可為害百合植株各器官，尤其是地下鱗莖，嚴(yán)重時會對百合產(chǎn)量和品質(zhì)有很大影響。鐮刀菌形態(tài)多樣，并在生長過程中會發(fā)生較大的形態(tài)變異，單純應(yīng)用形態(tài)學(xué)鑒定的方法很難將其準(zhǔn)確鑒定到種［18］。近年來，在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上利用分子生物學(xué)鑒定鐮刀菌的方法被廣泛應(yīng)用［19］。通過形態(tài)特征并輔以分子生物學(xué)的手段，也是近年來有效鑒定病原微生物的途徑［20，21］。本研究通過組織分離、致病性測定以及柯赫氏法則驗證獲得4株病原菌株，利用形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)手段，4株菌株鑒定為2類鐮刀菌。在尖孢鐮刀菌生長特性研究中也表明其培養(yǎng)過程的前、后期形態(tài)上會發(fā)生變化，且同一鐮刀菌在同一環(huán)境中培養(yǎng)顏色也會發(fā)生階段性的變化［22］。

潘其云等［23］在百合鐮刀菌枯萎病的研究中認(rèn)為病害的發(fā)生與溫濕度關(guān)系密切，且枯萎病的發(fā)病適溫為20?26℃，說明在此溫度范圍是鐮刀菌生長和繁殖的最佳溫度。而蘭州百合鱗片進行氣培時，選擇的環(huán)境溫度為22℃，非常適宜鐮刀菌的生存，也是腐爛病害發(fā)生的病因之一。因此，鱗片消毒和空氣環(huán)境因子的確定在氣培過程顯得尤為重要。

鐮刀菌是一種既可以侵染植物又具有廣泛寄主的土傳病害，可對多種作物造成危害。針對現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)，并且利用真菌基因組較小這一特點，后續(xù)可利用鐮刀菌進行無毒基因克隆，獲得抗性基因，進行抗性種質(zhì)的研究，以期解決蘭州百合生產(chǎn)甚至是更多作物生產(chǎn)過程中由鐮刀菌引起的真菌性病害問題。