貓泛白細(xì)胞減少癥病毒PCR檢測方法的建立

王利霞，扈嘉琪，王 平，鄔源泉，田 輝，楊文祥*

（1.湖北省疾病預(yù)防控制中心（應(yīng)用毒理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），湖北武漢 430070；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊 830052；3.武漢科前生物股份有限公司，湖北武漢 430070）

0 引言

貓泛白細(xì)胞減少癥是由貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV）引起的一種高度接觸性急性傳染病，也稱貓瘟熱、貓細(xì)小病毒病，該病在自然條件下可感染貓科、浣熊科和鼬科等家貓、野貓及野生動物包括動物園內(nèi)如虎、獅、豹、浣熊等動物，患病動物表現(xiàn)為高熱、嘔吐、腹瀉和白細(xì)胞明顯減少等癥狀。

FPV屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬，于1928年首次被發(fā)現(xiàn)，1935年被正式命名為貓泛白細(xì)胞減少癥病毒。該病毒傳染性極強(qiáng)，可通過糞便、尿液、嘔吐物、唾液、鼻涕等進(jìn)行傳播，可垂直傳播，亦可通過跳蚤等蟲媒傳播，可致妊娠母貓流產(chǎn)或畸胎，死亡率高。

貓在分類學(xué)上屬于動物門、哺乳綱、食肉目、貓科、貓屬。貓具有獨(dú)特的生物學(xué)特征，早在19世紀(jì)末，就有科學(xué)家將貓用于動物實(shí)驗(yàn)。目前，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，尤其是在神經(jīng)類、心血管類藥物、降壓物質(zhì)檢驗(yàn)等領(lǐng)域，有著不可替代的地位?！吨袊幍洹芬?guī)定貓是藥品檢驗(yàn)——藥品降壓物質(zhì)檢查實(shí)驗(yàn)的唯一實(shí)驗(yàn)用動物。

雖然貓被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)，但目前缺乏實(shí)驗(yàn)用貓相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)，僅有部分省份制定了地方標(biāo)準(zhǔn)，湖北省在實(shí)驗(yàn)用貓標(biāo)準(zhǔn)這一塊尚為空白?，F(xiàn)在用于實(shí)驗(yàn)的貓多來源于農(nóng)貿(mào)市場，遺傳背景不清楚，微生物和寄生蟲等病原攜帶情況不明確，貓的質(zhì)量難以得到有效保障，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性、重復(fù)性無法保證。

因FPV是侵害貓的重要病原微生物，該病的發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響貓的健康，本研究旨在建立一種針對FPV的快速高效的PCR檢測方法，用于篩選健康的實(shí)驗(yàn)用貓，進(jìn)而保障實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，同時為湖北省實(shí)驗(yàn)用貓地方標(biāo)準(zhǔn)制定提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與樣品。貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（FPV）、貓皰疹病毒（Feline herpes virus，F(xiàn)HV）、貓冠狀病毒（Feline coronavirus virus，F(xiàn)CV）來自武漢科前生物股份有限公司；疑似FPV感染貓臨床樣品來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院和華星動物醫(yī)院（武漢大學(xué)店）。

1.1.2 主要儀器和試劑。D2000 DNA Marker、2×Taq plus Master Mix（含染料）購自北京蘭杰柯科技有限公司；血液基因組DNA提取試劑盒、微量樣品基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。PCR 儀、凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國 Bio-RAD公司；超微量紫外可見分光光度計購自美國丹諾爾Denovix公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成。根據(jù)GenBank上FPV基因組（ID：KP769859.1）的保守序列VP2 基因，使用NCBI在線設(shè)計引物，序列為FPV-F：5’-TGGAAAACGGATGGGTGGAAA-3’；FPV-R：5’-TCCATGGAGTTGGTATGGTTGG -3’，目的片段長度為465 bp，引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。

1.2.2 病毒DNA及樣品DNA的提取。FPV、FHV、FCV按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，疑似FPV感染貓臨床樣品按照微量樣品基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.3 PCR檢測方法的建立。構(gòu)建PCR擴(kuò)增體系25μL：2×Taq plus Master Mix 12.5μL，模板3μl，引物FPV-F和FPV-R（10μm/L）各0.2μl，雙蒸水補(bǔ)足25μl。95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段送武漢賽維爾生物科技有限公司測序。

1.2.4 PCR檢測方法的優(yōu)化。以提取的FPV基因組為模板，設(shè)置48.0℃，48.8℃，50.3℃，52.6℃，55.4℃，57.6℃，59.1℃，60.0℃共8個退火溫度進(jìn)行PCR反應(yīng)，確定最佳復(fù)性溫度。

1.2.5 PCR的敏感性檢測。利用超微量紫外可見分光光度計測定提取的FPV基因組濃度，將FPV基因組DNA連續(xù)10倍稀釋進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳分析結(jié)果，確定PCR反應(yīng)的敏感性。

1.2.6 PCR的特異性檢測。以構(gòu)建的最佳PCR反應(yīng)條件對FHV、FPV和FCV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳分析結(jié)果。

1.2.7 臨床樣品檢測。在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院和華星動物醫(yī)院（武漢大學(xué)店）共采集了8份貓的肛拭子樣品，臨床診斷為疑似FPV感染。按照微量樣品基因組DNA提取試劑盒說明書對肛拭子樣品進(jìn)行基因組DNA提取，使用本研究建立的PCR方法進(jìn)行檢測和結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測方法的建立

引物FPV-F和FPV-R成功擴(kuò)增出FPV的VP2基因目的片段，約500bp，與預(yù)期基因片段長度相符，見圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 PCR產(chǎn)物的鑒定及分析

PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示獲得有效序列片段442bp，經(jīng)BLAST分析，與GenBank公布的貓泛白細(xì)胞減少癥病毒HN39AA株VP2基因序列（ID：MK357738.1）同源性為98%，與設(shè)計引物的靶基因序列同源性為97%。

2.3 PCR檢測方法的優(yōu)化

通過設(shè)置不同的退火溫度，優(yōu)化PCR的擴(kuò)增條件，結(jié)果如圖2 所示，8個退火溫度均能夠擴(kuò)增到明顯目的帶，但是在55.4℃時，目的帶的亮度最高，因此確定55℃為最佳退火溫度。

圖2 PCR檢測方法的優(yōu)化

2.4 PCR的敏感性檢測

原始FPV基因組的質(zhì)量為4.42 ng/μL，經(jīng)連續(xù)10倍稀釋后作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示PCR的最低檢測量為4.42×10-5ng/μL，見圖3。

圖3 PCR的敏感性檢測

2.5 PCR的特異性檢測

選擇臨床上常見的感染貓的FHV、FPV、FCV進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，同時設(shè)陰、陽性對照。結(jié)果顯示，僅FPV可以擴(kuò)增到特異性條帶（圖4）。

圖4 PCR的特異性檢測

2.6 臨床樣品檢測

采集8份疑似FPV感染的貓肛拭子樣品，提取DNA后，采用本研究建立的PCR檢測方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示2份樣品為FPV陽性（圖5）。

圖5 臨床樣品檢測

3 結(jié)論

貓泛白細(xì)胞減少癥常表現(xiàn)為白細(xì)胞計數(shù)嚴(yán)重減少和腸炎伴腸絨毛退化，具有高度傳染性，并伴有高發(fā)病率和高死亡率。隨著貓越來越多地應(yīng)用到科學(xué)研究和藥物檢測中，增加了貓瘟等傳染性疾病傳播流行的潛在風(fēng)險。PCR方法具有敏感、特異、技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)，便于在臨床使用。

本研究通過優(yōu)化PCR反應(yīng)的退火溫度，確定最佳反應(yīng)條件，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測序分析，確定PCR反應(yīng)可以有效擴(kuò)增到目的片段。同時對PCR檢測方法的敏感性和特異性進(jìn)行了檢測，確定該P(yáng)CR反應(yīng)的靈敏度高、特異性好，并進(jìn)行了初步的臨床應(yīng)用，該方法適用于貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的檢測。

目前，標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動物如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、犬、猴等，均有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)對其微生物和寄生蟲檢測指標(biāo)做了規(guī)定，但缺乏貓的相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)，我省擬制定實(shí)驗(yàn)用貓的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。貓泛白細(xì)胞減少癥病毒作為對貓健康狀況有重大影響的一個病毒，是我省實(shí)驗(yàn)用貓需要檢測的微生物項(xiàng)目，本研究方法的建立將為地方標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)支撐。