不同IBV疫苗免疫雞感染GVI-1型毒株后固有免疫相關基因的表達差異研究

李 敏，呂佳玳，劉月月，李俐睿，周瀟瀟，李桂黎，岳建國，黃 勇*

（1.四川省成都市動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；2.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川 成都 611130）

本試驗選用國內具有代表性的兩個IBV疫苗株H120 和4∕91 和課題組 分離的GVI-1 分離株ZQX 作為研究對象，先選取在抵抗IBV 感染中發(fā)揮重要作用的固有免疫相關基因（TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β、IL-6）為目的基因，設計引物，制作標準曲線，建立檢測目的基因表達的熒光定量RT-PCR 方法，然后用兩種常用的疫苗株H120和4∕91 分別免疫雞，2 周后使用ZQX 攻毒，觀察臨床癥狀，統(tǒng)計發(fā)病率、死亡率，并采用熒光定量RT-PCR 方法測定不同疫苗免疫組在不同時間的固有免疫相關基因的表達倍數(shù)。從固有免疫角度對兩個疫苗株的免疫機理進行分析，為明確IBV 的免疫機理和GVI-1 型毒株的致病機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 SPF雞胚及IBV毒株 本試驗所用SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司，并在實驗室自行孵化。4∕91疫苗購自Intervet公司，H120 疫苗購自中國獸藥監(jiān)察所，攻毒所用毒株ck∕CH∕YNSL∕160501（NCBI登錄號：MN096598，以下簡稱ZQX）從四川省一家養(yǎng)殖場分離。采用Reed-Muench 法測定分離株ZQX 和疫苗株H120、4∕91 的雞胚半數(shù)感染量（EID50）［1］，結果分別為105.28∕0.1 mL、106.80∕0.1 mL、106.32∕0.1 mL。

1.2 主要試劑 總RNA 提取試劑盒（Trizol），PrimeScript RT-PCR Kit 反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒（SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ）、PMD19-T載體、限制性內切酶、Premix Taq，購自大連寶生物有限公司；PBS緩沖液；DNA Marker-L，購自生工生物工程（股份）有限公司。

1.3 構建熒光定量PCR標準曲線

1.3.1 引物設計 根據(jù)參考文獻［2］的結果，直接選擇ACTB 作為內參基因，內參基因ACTB 的引物參考已發(fā)表的文獻，根據(jù)NCBI 上已發(fā)表的目的基因TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β、IL-6 的核苷酸序列，利用Oligo7.0軟件設計并優(yōu)化引物，使擴增的目的片段保持在100～200 bp 之間，用于目的片段的擴增及標準曲線的建立。所有引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體信息見表1。

表1 熒光定量引物信息

1.3.2 標準曲線構建 參照文獻［3］方法建立標準曲線。將標準質粒用ddH2O進行10倍倍比稀釋，在LightCycler?96 SW 熒光定量PCR 儀上進行Real-time PCR反應，采用10 μL體系（上、下游引物各1.0 μL，0.8 μL 標準質粒和7.2 μL 雙蒸水）。引物與模板兩兩組合，反應程序設定為：預變性95 ℃30 s，變性95 ℃5 s，退火52～57 ℃30 s，延伸72 ℃20 s，40個循環(huán)。確定線性回歸，并根據(jù)循環(huán)閾值（Ct 值）繪制含有插入物的質粒DNA 拷貝數(shù)的對數(shù)值，將Ct 值轉換為拷貝數(shù)，構建內參基因及目的基因的標準曲線。

1.4 試驗方法

1.4.1 免疫和攻毒方案 1 日齡SPF 雞48 只，隨機分為4組，每組12只，分別飼養(yǎng)在4個相互隔離的區(qū)域。在10 日齡時對雞群免疫，24 日齡時對雞群攻毒。具體方案為：A組、B組不免疫（用PBS緩沖液代替），10日齡時對C 組、D 組雞分別進行H120和4∕91免疫，免疫劑量為105EID50∕0.1 mL，免疫方式為點眼和滴鼻；24日齡時分別對B、C、D組雞接種ZQX 株，劑量為104EID50∕0.1 mL；A 組作為空白對照組接種PBS，劑量為0.1 mL∕只，接種方式為點眼和滴鼻。每組雞自由采食，隔離飼養(yǎng)。攻毒后持續(xù)觀察并記錄各組雞的臨床癥狀、發(fā)病率、死亡率及組織剖檢變化。

1.4.2 固有免疫相關基因mRNA 表達差異的測定 分別在攻毒后1、3、5、7 d 每組隨機剖殺3 只雞，觀察記錄組織病變，無菌采集雞的氣管（不包括喉頭）于液氮中保存?zhèn)溆谩夤芷书_，用手術刀片刮取氣管黏膜，提取RNA，反轉錄得到cDNA，于-70 ℃保存?zhèn)溆?。以cDNA 為模板，采用已構建好的PCR 方法檢測各個樣品中內參基因ACTB及目的基因TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β、IL-6的表達量，隨后計算B、C、D組各個目的基因相對于對照組的表達倍數(shù)，使用2-△△Ct法計算表達比率，△△Ct＝（試驗組目的基因的Ct值-試驗組內參基因的Ct 值）-（對照組目的基因的Ct 值-對照組內參基因的Ct 值）。最后用GraphPad Prism 8軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 試驗結果

2.1 熒光定量PCR標準曲線的建立 本試驗共建立了6個RT-qPCR標準曲線，將10倍倍比稀釋的標準質粒在LightCycler?96 SW熒光定量PCR儀上進行Real-time PCR 反應，反應結束后對樣品進行編輯并分析，依次添加需要分析的選項，軟件自動生成標準曲線。內參基因ACTB 的熒光定量標準曲線為Y＝-3.504LgX+2.93（X為起始模板的量，Y為Ct 值）；目的基因TLR3 的標準曲線為Y＝-3.314LgX+3.92；TLR7 的標準曲線為Y＝-3.289LgX+2.36；MDA5 的標準曲線為Y＝-3.508 1LgX+2.14；IFN-β的標準曲線為Y＝-3.115 7LgX+3.67；IL-6 的標準曲線為Y＝-3.497 51LgX+1.75。

2.2 動物實驗

2.2.1 臨床表現(xiàn) 攻毒后B、C、D 組雞相繼出現(xiàn)呼吸癥狀，表現(xiàn)為：打噴嚏、呼吸困難、氣管啰音，且羽毛蓬松、精神沉郁、采食量下降，全程無雞只死亡。A 組無臨床癥狀，B 組攻毒對照組發(fā)病率為66.7%，C 組和D 組的發(fā)病率分別為25%、33.33%，說明疫苗株H120 和4∕91 對分離株ZQX均有一定的保護作用，能夠明顯降低雞傳支的發(fā)病率。

2.2.2 剖檢病變 剖檢結果表明，ZQX引起的最普遍病變?yōu)闅夤艹鲅⒂叙ひ?，其次為盲腸扁桃體出血、腎臟腫大及腸道出血，但是腎臟病變不是特別明顯。疫苗株H120和4∕91對ZQX都具有一定的保護作用，兩者差異不明顯，統(tǒng)計結果見表2。

表2 剖檢病變統(tǒng)計

2.3 固有炎癥因子IFN-β mRNA表達水平的測定 IFN-β mRNA在攻毒后不同時間點氣管黏膜中的表達情況如圖1所示。A組為空白對照組，B組為攻毒組，C、D 組分別為H120、4∕91 免疫攻毒組。攻毒后免疫組C 組的IFN-β mRNA 表達水平在第1 d 和第5 d 出現(xiàn)了顯著上調，D 組僅在第5 d 出現(xiàn)了上調；免疫組C、D 組的IL-6 mRNA 表達水平在第1 d顯著上調，且C組上調水平高于D組，C、D 組在第3 d 也出現(xiàn)了上調，其余時間點及其他組的轉錄水平則都趨于穩(wěn)定。

圖1 ZQX攻毒后氣管中炎癥因子IFN-β mRNA的表達情況

2.4 固有免疫相關基因mRNA 表達水平的測定 TLR3、TLR7、MDA5的mRNA水平在攻毒后不同時間點氣管黏膜中的表達情況如圖2 所示。A組為空白對照組，B組為攻毒組，C、D組分別為H120、4∕91 免疫攻毒組。攻毒后，C、D 免疫組TLR3 的mRNA 表達水平在第3 d 顯著上調，且C組的上調水平顯著高于D組，其他時間點都趨于穩(wěn)定；B 組攻毒組TLR7 mRNA 的表達水平在第5 d出現(xiàn)了顯著上調，免疫組中只有C組在攻毒后第3 d 出現(xiàn)了顯著上調，其余時間點及其他組的轉錄水平則都趨于穩(wěn)定甚至顯著下調；對于MDA5 mRNA的表達水平，C組在第1 d就出現(xiàn)了顯著上調，D 組到第3 d 才出現(xiàn)了這種顯著性上調，而后在第5、7 d 免疫組與感染組都呈現(xiàn)出不同程度的顯著下調，TLR7也出現(xiàn)了相同的狀況。

圖2 ZQX攻毒后氣管中TLR3、TLR7、MDA5 mRNA的表達情況

3 討論

疫苗免疫是防控雞傳支（IB）的主要策略，但IBV 毒株的變異常降低疫苗的有效性和保護性［4］。IBV 疫苗的免疫和保護機制非常復雜［5］。GVI-1型分離株ZQX 是近幾年流行的IBV 新毒株［6］，致病性不強，動物實驗的解剖病變與H120 免疫攻毒組和4∕91免疫攻毒組相比差異不明顯，因此進一步通過實時熒光定量PCR對其5個目的基因的表達水平進行檢測。

比較不同組間炎癥因子mRNA 的表達水平，可以發(fā)現(xiàn)免疫組的表達量在前期均高于空白對照組和攻毒組，但是對比攻毒組其上調趨勢隨著時間的推移逐漸減緩，逐步與機體本身炎癥因子的表達水平持平，這可能是因為免疫組前期通過上調抗病毒天然免疫通路對病毒進行清除，導致了下游干擾素與白介素因子的一部分上調。

綜合比較H120免疫攻毒組和4∕91免疫攻毒組各個目的基因表達高峰出現(xiàn)的時間，發(fā)現(xiàn)H120免疫攻毒組中基因的表達高峰幾乎都在4∕91 免疫攻毒組之前，也就是說H120 疫苗株發(fā)揮作用的時間早于4∕91疫苗株。由于H120免疫株是由IBV Mass 型的H株傳120獲得的，故其對機體的適應性更高，在相同情況下的復制能力比4∕91更強，對機體的保護作用也更迅速。

4 結論

H120 和4∕91 疫苗對ZQX 株能提供一定程度的臨床保護。H120 疫苗攻毒組，在攻毒后1 d MDA5 mRNA 的表達水平達到高峰，攻毒后3 d TLR3、TLR7 mRNA的表達水平達到高峰；4∕91疫苗攻毒組，在攻毒后7 d TLR3、TLR7 mRNA的表達水平達到高峰，在攻毒后3 d MDA5 mRNA 的表達水平較高。H120 疫苗攻毒組，在攻毒后1 d IFN-β mRNA、IL-6 mRNA 的表達水平達到高峰；4∕91疫苗攻毒組，IFN-β mRNA的表達水平在攻毒后5 d 達到高峰，IL-6 mRNA 的表達水平在攻毒后1 d 達到高峰?？梢奌120 免疫組感染ZQX 后固有免疫相關基因的表達比4∕91 免疫組更為快速。

本研究探討了H120免疫攻毒組和4∕91免疫攻毒組中5 個固有免疫相關基因在攻毒后1、3、5、7 d 的表達差異，得到了各個基因的表達動態(tài)，有利于在免疫學水平上闡明機體抵抗病毒感染的原因，為以后IBV 的天然免疫研究提供一定的參考。