高脂血癥對動脈內(nèi)皮糖萼及動脈粥樣硬化的影響

潘俊，孫世超，羅雅嫻，周揚(yáng)，周晨明，徐彥楠

（河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050017）

0 引言

高脂血癥（Hyperlipidemia，HLP）是由于人體內(nèi)脂肪代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)異常引起的血清脂質(zhì)和脂蛋白水平升高的一種代謝性疾病[1]。其作為動脈粥樣硬化的首要危險(xiǎn)因素，已被循證醫(yī)學(xué)證實(shí)是心腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[2]。內(nèi)皮糖萼（Endothelialglycocalyx, EGX）主要覆蓋于的血管內(nèi)皮上，位于血管內(nèi)皮與血液之間的復(fù)合物[3]。其作為血管內(nèi)皮的屏障，在調(diào)節(jié)血管通透性、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、感測流體的剪切力、抗凝等起著重要作用[4]。雖然近些年內(nèi)皮糖萼相關(guān)研究逐年增多，但是內(nèi)皮糖萼在動脈粥樣硬化中所起作用的具體機(jī)制尚不清楚。因此，本文旨在探討高脂血癥對動脈內(nèi)皮糖萼及動脈粥樣硬化的影響，以期為動脈粥樣硬化機(jī)理的闡釋及其防止提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本實(shí)驗(yàn)以5月齡倉鼠為動物模型，將動物分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各五只。對照組以普通繁殖飼料喂養(yǎng)12周，實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)高脂飼料12周（10%豬油，5%蔗糖，2%膽固醇，0.5%牛膽鹽，0.2%丙基硫氧嘧啶）。所有實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)房，遵循PF級S實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)條件。

1.2 方法

1.2.1 相關(guān)試劑

醛鑭灌流固定液：1%硝酸鑭-3%戊二醛-2%多聚甲醛-0.1mol/L二甲砷酸鈉

電鏡標(biāo)本制備所需漂洗液：1%硝酸鑭-0.1mol/L二甲砷酸鈉

1.2.2 標(biāo)本的收集

用4%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉，打開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，用注射器從右心耳采集心臟血液2mL，置于4℃冰箱保存待測。取血后，立即采用硝酸鑭示蹤技術(shù)，用醛鑭灌流固定液進(jìn)行灌流固定，取胸主動脈，分成三部分：經(jīng)石蠟包埋切片后進(jìn)行HE染色；經(jīng)冰凍切片后進(jìn)行油紅O染色。經(jīng)樹脂包埋，進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.2.3 血清學(xué)檢測

將 收集 的血 液離 心 (4000r/min，10 min)，取上層血漿樣品，用酶反應(yīng)比色法按照試劑盒說明書檢測總膽固醇(TC)、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.2.4 HE染色

取一段胸主動脈標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、浸蠟及包埋后，切成厚度為2μm的石蠟切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇水化、蘇木素和伊紅染色，逐級梯度酒精脫水，二甲苯透明，晾干后用中性樹膠封片，顯微鏡采集圖像。

1.2.5 油紅O染色

取一段胸主動脈標(biāo)本在冰凍切片機(jī)上切成 8 μm 厚的切片，切片經(jīng)60%異丙醇2min，用提前配置好的油紅 O 染液避光染色10min，60%異丙醇染色5s，隨后用蘇木素染色染核 5 min，甘油明膠進(jìn)行封片，顯微鏡采集圖像。

1.2.6 硝酸鑭示蹤透射電鏡技術(shù)

取一段胸主動脈標(biāo)本，經(jīng)醛鑭灌流固定液前固定液 4℃ 固定過夜，漂洗液漂洗3次，1% 四氧化鋨-1%硝酸鑭后固定2h，經(jīng)50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脫水，Epon812樹脂包埋，超薄切片機(jī)切50nm超薄切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色，在透射電鏡下檢測、拍照。相同放大倍數(shù)下,每只鼠拍照不同部位的內(nèi)膜照片5 張，每張圖用 Photoshop 軟件分割成等份的方格，測量每個(gè)方格內(nèi)由內(nèi)皮細(xì)胞上糖萼層頂端到內(nèi)皮細(xì)胞膜的垂直距離，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，作單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結(jié)果P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測

為了檢測造模是否成功，對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行血清學(xué)檢測，結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組TC、TG、LDL-C水平顯著升高， HDL-C水平降低（P＜0.05），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

圖1 兩組血脂水平比較

2.2 HE染色

結(jié)果顯示，對照組主動脈血管壁結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)皮表面光滑，厚度分布均勻，結(jié)構(gòu)完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則，無增生；而模型組，內(nèi)皮表面粗糙，厚薄不均，凹凸不平，中膜平滑肌排列紊亂，細(xì)胞間纖維組織異常增生（圖2）。

圖2 兩組主動脈HE染色的觀察(A:對照組 B：模型組)

2.3 油紅O染色

結(jié)果顯示:對照組主動脈內(nèi)膜無脂質(zhì)沉積；而模型組可見動脈內(nèi)膜有明顯的脂質(zhì)沉積（圖3）。

圖3 兩組主動脈油紅O染色的觀察(A:對照組 B：模型組)

2.4 透射電鏡觀察內(nèi)皮糖萼超微結(jié)構(gòu)的改變。

結(jié)果顯示對照組內(nèi)皮糖萼分布均勻，厚薄一致；而模型組內(nèi)皮糖萼層變薄變稀疏，并伴有部分缺失的現(xiàn)象（圖3）。經(jīng)測量統(tǒng)計(jì)后，對照組內(nèi)皮糖萼平均厚度為（353.13±181.81）nm，模型組為（188.33±119.50）nm，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)（表1）。

圖3 兩組主動脈內(nèi)皮糖萼透射電鏡的觀察(A:對照組 B：模型組)

表1 兩組內(nèi)皮糖萼的厚度比較（±s）

注 : *P＜0.05 vs 對照組

組別 n 內(nèi)皮糖萼厚度(nm)對照組 5 353.13±181.81模型組 5 188.33±119.50 F值 5.565 P值 ＜0.05

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人口老齡化及人們生活習(xí)慣的改變，動脈粥樣硬化已成為全球死亡率上升的主要原因之一[5]。作為心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，動脈粥樣硬化的預(yù)防與治療已成為重點(diǎn)研究對象，而血脂異常又是動脈粥樣硬化發(fā)病的主要因素之一[6]。

目前，小鼠和大鼠已被廣泛應(yīng)用于動脈粥樣硬化的研究。但有研究顯示，小鼠以及大鼠對飲食誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化具有不同程度的抵抗力，而倉鼠在高脂模型的制備中，主動脈和冠狀動脈中顯示出更多的動脈粥樣硬化病變，因此本實(shí)驗(yàn)選用倉鼠作為高脂血癥模型動物[7]。高脂血癥是脂質(zhì)異常的一種表現(xiàn)，其特征是TC、TG、LDL明顯升高，HDL降低。雖然高脂血癥不能直接引起顯著的臨床癥狀，但由于膽固醇和甘油三酯在器官內(nèi)的積累，高脂血癥可導(dǎo)致動脈粥樣硬化性心血管疾病[8]。本實(shí)驗(yàn)通過對模型組給予高脂飲食喂養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，模型組血清中的TC、TG、LDL明顯升高，HDL降低，提示高脂血癥模型造模成功。

動脈粥樣硬化形成因素眾多，其中高血脂尤為顯著。動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制“脂質(zhì)浸潤學(xué)說”認(rèn)為，過量的TC 在血管壁沉積后，引起巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞吞噬脂質(zhì)，形成泡沫細(xì)胞，同時(shí)使內(nèi)皮增厚[9]。此外，過量的LDL積聚于內(nèi)皮下，并被血管壁分泌的氧化活性物質(zhì)氧化修飾形成ox-LDL，與此同時(shí)又觸發(fā)血管壁的炎癥反應(yīng)，引發(fā)了如血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1（(VCAM-1)）、E-選擇素、P-選擇素等多種炎癥因子的表達(dá)[10]。在驅(qū)化作用下，單核細(xì)胞進(jìn)入血管壁并分化為巨噬細(xì)胞，攝取ox-LDL成為泡沫細(xì)胞，進(jìn)一步導(dǎo)致血管炎癥和動脈粥樣硬化的形成[11]。本實(shí)驗(yàn)通過用HE染色和油紅O染色對血管內(nèi)皮進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮不均勻增厚增厚，且有脂質(zhì)沉積，內(nèi)膜呈現(xiàn)粥樣硬化的早期病理改變。

內(nèi)皮糖萼主要由蛋白聚糖、糖胺聚糖、糖蛋白、糖脂構(gòu)成的復(fù)合物，是血管內(nèi)皮的重要屏障[12]。釕紅染色是透射電鏡觀察糖萼的經(jīng)典方法，但其具有局限性，因釕紅屬于大分子物質(zhì)，不能完全進(jìn)入整個(gè)糖萼層使其著色，影響觀察，并且釕紅易與糖萼側(cè)鏈作用改變其空間幾何構(gòu)型，從而造成觀察上的假象，因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用硝酸鑭示蹤來顯示內(nèi)皮糖萼超微結(jié)構(gòu), 實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀且明確。透射電鏡結(jié)果顯示與對照組相比，模型組內(nèi)皮糖萼層變薄變稀疏，并伴有部分缺失的現(xiàn)象。提示高脂血癥可破壞內(nèi)皮糖萼。有研究表明內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化病理進(jìn)展的始動因素[13]。糖萼脫落導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其通透性增加，促進(jìn)血管壁脂質(zhì)沉積以及炎癥因子釋放，從而誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附、巨噬細(xì)胞浸潤以及泡沫細(xì)胞形成，加速動脈粥樣硬化疾病的進(jìn)展[14]。此外，糖萼脫落導(dǎo)致細(xì)胞間通訊功能改變，剪切力傳導(dǎo)障礙，進(jìn)一步促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的形成。

綜上所述，高脂血癥在影響內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的同時(shí)還破壞內(nèi)皮糖萼，而內(nèi)皮糖萼的破壞又進(jìn)一步促進(jìn)了脂質(zhì)的沉積，二者共同促進(jìn)了動脈粥樣硬化的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)為動脈粥樣硬化機(jī)理的闡釋及其防止提供新的理論依據(jù)。