中華絨螯蟹對石油烴的富集代謝規(guī)律及閾值研究

關(guān) 麗，郭欣碩，徐小雅，黃萍萍，藺翠翠

(遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧 沈陽 110003)

石油烴污染是當今世界各國普遍關(guān)注的污染問題之一，隨著我國石油化工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，部分海區(qū)、河流和底質(zhì)受到石油類污染[1-2]，水產(chǎn)品的產(chǎn)地環(huán)境也面臨著石油烴污染的威脅，石油烴污染不僅影響水產(chǎn)品的食用價值，而且其致癌性、致畸性和難降解性也令消費者“談油色變”，嚴重影響水產(chǎn)品的經(jīng)濟價值[3-5]。中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是我國特有的大型淡水蟹類，因具有特殊的風味和豐富的營養(yǎng)價值及藥用價值而廣受國人青睞。近年來，我國的中華絨螯蟹產(chǎn)量逐年增長，目前年產(chǎn)量已達到80×104t左右[6]，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的《2021中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》的數(shù)據(jù)計算，中華絨螯蟹產(chǎn)量占我國淡水水產(chǎn)品總產(chǎn)量的2.4%左右[7]。中華絨螯蟹已成為我國一種重要的淡水水生生物資源。

目前，國內(nèi)外學者對石油烴在生物體內(nèi)的富集機理及組織器官間的分布等進行了許多研究[8-9]。石油烴對我國水生生物的污染動力學研究主要集中在其對藻類、貝類、魚類等物種早期發(fā)育的影響[10-12]，而石油烴對甲殼類的污染動力學研究相對較少，甲殼類對石油烴的富集代謝規(guī)律及石油烴在養(yǎng)殖環(huán)境和甲殼類體內(nèi)的含量關(guān)系等方面仍缺少系統(tǒng)的研究。因此，本研究選用甲殼類中具有代表性的中華絨螯蟹為對象，通過生態(tài)實驗手段和化學分析相結(jié)合的方法，在實驗室模擬研究了中華絨螯蟹對石油烴的富集代謝規(guī)律，量化石油烴在中華絨螯蟹體內(nèi)的生物富集系數(shù)(Bioconcentration factor，BCF)，根據(jù)蟹體內(nèi)石油烴的限量判定其安全閾值，旨在為制定中華絨螯蟹的健康化養(yǎng)殖規(guī)范和衛(wèi)生標準提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用水

遼寧省盤錦市大洼縣稻田蟹養(yǎng)殖水經(jīng)脫油過濾、48 h沉淀、氣石曝氣后，備用。溶解氧濃度大于8.0 mg/L，水溫20～23℃。

1.1.2 實驗生物

實驗受試生物中華絨螯蟹均取自盤錦稻田蟹養(yǎng)殖區(qū)，體質(zhì)量50 g左右，雌、雄隨機，實驗前暫養(yǎng)7 d，選擇大小適宜、健康無病、活動正常的中華絨螯蟹，備用。

1.1.3 石油烴標準品

石油烴標準品(1 000 mg/L)，編號GBW(E)080913，購于國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心。

1.1.4 石油烴母液(WSF)的配制

1 L燒杯中加入0#柴油和實驗用水，體積比約為1∶1，磁力攪拌器攪拌24 h，放置分層，虹吸下層溶液作為實驗用母液。穩(wěn)定后測定母液中石油烴濃度為2.25 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 水中石油烴的測定

采用HJ 637—2012《水質(zhì) 石油類和動植物油類的測定 紅外分光光度計法》[13]測定水中石油烴濃度。

1.2.2 中華絨螯蟹中石油烴的測定

參照GB 17378.6—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范 第6部分 生物體分析》，采用熒光分光光度法[14]測定中華絨螯蟹中的石油烴含量。

1.2.3 生物富集實驗

設(shè)3個實驗組、1個空白對照組，每組設(shè)2個平行，每個容器40只中華絨螯蟹。以體積約30 L的水族箱作為實驗容器，加入10 L實驗用水。內(nèi)置一個循環(huán)泵充氧，水中溶解氧濃度不低于8.0 mg/L。3個實驗組養(yǎng)殖水體中石油烴濃度分別為2.25、1.81和1.43 mg/L，穩(wěn)定24 h后放入中華絨螯蟹進行生物富集，分別于富集的0.5、1、2、4、6、8、10、12和14 d采集中華絨螯蟹樣品，各實驗組隨機選取2只中華絨螯蟹，剪碎去殼后，取肌肉和內(nèi)臟團混合并用勻漿器勻漿，置于-18℃保存，待測石油烴含量。

中華絨螯蟹對石油烴的富集能力用生物富集系數(shù)(BCF)表示。BCF=Cfs/Cws，式中Cfs為平衡時生物體內(nèi)石油烴含量；Cws為平衡時養(yǎng)殖水體中石油烴濃度。

1.2.4 感官評定實驗

實驗組別和實驗條件同1.2.3，每個容器20只中華絨螯蟹，3個實驗組濃度分別為2.25、1.81、1.43 mg/L，穩(wěn)定24 h后放入中華絨螯蟹進行生物富集，分別于富集的3、6、12、24、30、40和48 h從各實驗組中隨機選取2只中華絨螯蟹，剪碎混合后用勻漿器勻漿，待測石油烴含量。同時把取得的中華絨螯蟹樣品按順序編號。

感官評定根據(jù)《感官分析方法總論》[15]和《出口水產(chǎn)品品質(zhì)檢驗——水煮檢驗法》[10]進行，詳見表1。參加感官評定的人員共分3組，每組5人，以多數(shù)人的感官判斷結(jié)論作為本實驗的感官評定結(jié)果。具體方法：容器裝入水，將洗凈的中華絨螯蟹樣品上屜蒸15 min，用手扇蒸氣嗅別，再嘗口味。判斷標準如表1所示。

表1 感官評定判斷標準

1.2.5 石油烴代謝實驗

將富集實驗的3個實驗組養(yǎng)殖水體換成空白養(yǎng)殖水體后繼續(xù)養(yǎng)殖，其他實驗條件與1.2.3生物富集實驗相同，并分別于換水后的0.5、1、2、4、6、8、10、12和14 d從各實驗組中隨機選取2只中華絨螯蟹，剪碎混合后用勻漿器勻漿，待測石油烴含量。

1.2.6 安全閾值實驗

實驗組別和實驗條件同1.2.3，實驗組水體石油烴濃度為國家限量標準0.05 mg/L[16]，穩(wěn)定24 h后放入中華絨螯蟹進行生物富集，分別于富集后的7、14和21 d從各實驗組中隨機選取2只中華絨螯蟹，取性腺、肝胰腺和肌肉等可食部分，剪碎混合后用勻漿器勻漿，測定石油烴含量。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

石油烴含量數(shù)據(jù)采用平均值±標準差(Mean±SD)表示；數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件，進行單因素方差分析(ANOVA)及相關(guān)性分析，顯著性差異水平P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水中石油烴含量的測定

測定濃度為1、2、5、8、10 μg/mL的石油類標準系列溶液，得出水中石油烴的標準曲線回歸方程：y=0.066 291x+0.009 961 3(R2=0.999 31)，線性關(guān)系良好。

2.2 中華絨螯蟹中石油烴含量的測定

測定濃度為0、1、3、5、7、9 μg/mL的石油類標準系列溶液，得出中華絨螯蟹中石油烴的標準曲線回歸方程：y=-1.048 6x+0.014 551(R2=0.999 42)，線性關(guān)系良好。

2.3 富集規(guī)律

各實驗組的富集量及差異性分析見表2，可以看出3個不同濃度組中中華絨螯蟹均表現(xiàn)出明顯的蓄積效應(yīng)，隨著濃度增加和實驗時間的推進，蟹體內(nèi)石油烴含量明顯增大?？傮w上，各組間及同一組不同富集天數(shù)的蓄積量差異極顯著。

富集實驗初期，各實驗組對石油烴的富集速度較快，呈現(xiàn)出快速增長的趨勢，隨著實驗的推進，各實驗組的石油烴富集逐漸趨于飽和且呈現(xiàn)緩慢增長的趨勢，最終各實驗組蟹體對石油烴的富集達到飽和，富集濃度不再明顯增大。各實驗組石油烴在蟹體內(nèi)和養(yǎng)殖水體之間達到穩(wěn)態(tài)平衡的時間均為8 d左右，經(jīng)計算，各實驗組石油烴平均富集速率由大到小分別為22.0 mg/(kg·d)(實驗組1)、9.05 mg/(kg·d)(實驗組2)、6.97 mg/(kg·d)(實驗組3)。蟹體對石油烴的富集量與養(yǎng)殖水中石油烴濃度呈正相關(guān)關(guān)系，即養(yǎng)殖水體中石油烴濃度越大，蟹體富集的石油烴含量越高，進一步利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，對表2各實驗組在不同富集時間蟹體內(nèi)石油烴含量的結(jié)果進行相關(guān)性分析，得出中華絨螯蟹體內(nèi)石油烴富集量和養(yǎng)殖水體中石油烴濃度在0.01水平上呈現(xiàn)顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.654。

表2 生物富集實驗中華絨螯蟹體內(nèi)石油烴含量

BCF指污染物在生物體內(nèi)富集達到穩(wěn)態(tài)平衡時，生物體內(nèi)污染物濃度與水環(huán)境中污染物濃度的比值，是評估水生生物對污染物富集水平的一個重要參數(shù)[16-17]。通過測定BCF值可以反推水環(huán)境中污染物的安全限量。如表2所示，經(jīng)過8 d左右，不同濃度實驗組石油烴在養(yǎng)殖水體中和蟹體內(nèi)均達到了分配穩(wěn)態(tài)平衡。通過表3、圖1，由富集實驗8～14 d中華絨螯蟹和養(yǎng)殖水體中的石油烴含量結(jié)果可推算，實驗組1、2和3的BCF平均值分別為58.6、39.1和31.7，因此中華絨螯蟹對石油烴的BCF為31.7～58.6，平均值為43.1。

表3 中華絨螯蟹生物富集系數(shù)計算結(jié)果

2.4 感官評定

人類的嗅覺、味覺對石油烴異味比較敏感，因此可以用感官評定法對經(jīng)過石油烴富集后的中華絨螯蟹的食用性作出感官判斷。感官實驗結(jié)果見表4，實驗組3的各時間段中華絨螯蟹煮熟后，氣味和口味正常，感官評定人員未發(fā)現(xiàn)有石油烴異味存在。實驗組2的中華絨螯蟹煮熟后，基本無異樣，但是當富集時間達到40 h時，中華絨螯蟹體中石油烴含量達到12.09 mg/kg，蟹體出現(xiàn)輕微的石油烴異味，已不適宜食用。實驗組1的中華絨螯蟹在石油烴富集6 h后便開始出現(xiàn)少量的石油烴異味；當富集時間累積達到12 h時，中華絨螯蟹體中石油烴含量為15.07 mg/kg，其可產(chǎn)生口味異味；當富集時間累積達到24 h時，中華絨螯蟹體中石油烴含量達到44.62 mg/kg，已能夠被明顯分辨出石油烴異味，已嚴重影響了中華絨螯蟹的品質(zhì)，完全不適宜食用。因此根據(jù)本實驗結(jié)果，確定中華絨螯蟹的石油烴異味閾值為12.09～15.07 mg/kg。

表4 石油烴感官評定結(jié)果

2.5 代謝規(guī)律

將3個實驗組的中華絨螯蟹從含有石油烴的養(yǎng)殖水體中更換至空白養(yǎng)殖水體中，進行石油烴污染物的代謝規(guī)律研究，不同代謝時間段對中華絨螯蟹體中石油烴殘留量的檢測結(jié)果見表5。由于代謝實驗中每天更換實驗用水，因此石油烴趨向于由生物體向養(yǎng)殖水體中排放的趨勢，但是由于石油烴的難代謝、難降解等特性，使其代謝排出的速度趨于逐漸放緩。各實驗組的中華絨螯蟹隨著養(yǎng)殖環(huán)境中石油烴的去除，其體內(nèi)的石油烴含量均表現(xiàn)出降低趨勢，高濃度組的中華絨螯蟹排出石油烴的速度較快，中、低濃度組的中華絨螯蟹排出石油烴速度較慢，整體上，實驗組間和實驗組內(nèi)的不同時間段蟹體內(nèi)石油烴含量的差異極顯著。經(jīng)過14 d代謝實驗后，各實驗組蟹體內(nèi)石油烴的含量均大幅降低，實驗組1蟹體內(nèi)石油烴的平均含量由131.24 mg/kg降低至21.27 mg/kg，實驗組2和實驗組3蟹體內(nèi)石油烴含量均降至初始含量的1/5左右，且低濃度組(實驗組3)蟹體內(nèi)石油烴含量最終降至國家標準要求的限量15 mg/kg以下，但中、高濃度組(實驗組2和實驗組1)實驗蟹體內(nèi)的石油烴含量仍未降至限量以下。

表5 代謝實驗中華絨螯蟹體內(nèi)石油烴含量

2.6 安全閾值

在中華絨螯蟹養(yǎng)殖水體中添加濃度為國家限量標準0.05 mg/L的石油烴并用其養(yǎng)殖中華絨螯蟹21 d，結(jié)果表明，蟹體內(nèi)石油烴含量在7 d左右達到含量最大值2.21 mg/kg，14 d和21 d均降低至檢出限(1.0 mg/kg)以下，均低于農(nóng)業(yè)行業(yè)標準對中華絨螯蟹體中石油烴的限量要求。因此，養(yǎng)殖水體中石油烴的安全閾值為0.05 mg/L。

3 討論

3.1 中華絨螯蟹體中石油烴異味閾值

石油烴異味實驗結(jié)果顯示，當蟹體內(nèi)石油烴含量達12.09 mg/kg時，中華絨螯蟹可產(chǎn)生氣味異味；當石油烴含量達15.07 mg/kg時，中華絨螯蟹可產(chǎn)生口味異味，因此本研究確定12.09～15.07 mg/kg為中華絨螯蟹出現(xiàn)石油烴異味的閾值，這小于魚類50～100 mg/kg和雙殼貝類25～30 mg/kg的石油烴異味閾值[8]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部標準NY 5073—2006《無公害食品 水產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)限量》中規(guī)定水產(chǎn)品中石油烴限量為15 mg/kg，而當中華絨螯蟹體內(nèi)石油烴含量為12.09 mg/kg時，即可通過氣味辨識出石油烴的存在，但其異味閾值區(qū)間12.09～15.07 mg/kg也基本在限量之下，因此即使在安全限量以下的中華絨螯蟹產(chǎn)品也有可能產(chǎn)生石油烴異味，從而影響中華絨螯蟹的食用品質(zhì)。

3.2 生物富集代謝規(guī)律

中華絨螯蟹對石油烴的富集呈現(xiàn)出前期快、后期慢的規(guī)律，這與其他水生生物對石油烴的富集規(guī)律一致[18]，富集放緩與中華絨螯蟹的外殼屏障作用、蟹體特殊的生理結(jié)構(gòu)和體內(nèi)各類酶對有害物質(zhì)的防御機制有關(guān)[19]。蓄積8 d左右，石油烴在養(yǎng)殖水體中和蟹體內(nèi)處于動態(tài)平衡，這與姜朝軍等[10]對菲律賓蛤仔的實驗結(jié)果4 d相比，穩(wěn)態(tài)平衡所需的時間更長，因此石油烴在蟹體中的富集較貝類緩慢。在富集實驗養(yǎng)殖水體中，石油烴濃度與蟹體內(nèi)石油烴的蓄積量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，在0.01水平上相關(guān)系數(shù)為0.654，由此可知養(yǎng)殖環(huán)境中的石油烴可直接導致蟹體的石油烴污染，并表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。

BCF是評估水生生物對污染物富集水平的一個重要參數(shù)，本實驗得到中華絨螯蟹對石油烴的BCF為31.7～58.6，平均值為43.1，而姜朝軍等[10]研究貝類對石油烴的BCF為545；林建清等[20]研究鱸魚對石油烴中毒性最強的多環(huán)芳烴的BCF大于500。與之相比，本研究中華絨螯蟹對石油烴的蓄積水平低于貝類和魚類，但蔡玉婷等[21]對福建沿海生物體內(nèi)石油烴含量的監(jiān)測結(jié)果是甲殼類中石油烴含量介于魚類和貝類之間，出現(xiàn)結(jié)果偏差的原因可能是石油烴的組成和特性、水溫、pH、受試生物大小、性別、品質(zhì)、生長周期、養(yǎng)殖水體中石油烴的濃度等諸多因素都會對BCF值產(chǎn)生影響，因此不同研究實驗所測得的BCF值會存在較大的差異[17,22]。

中華絨螯蟹體內(nèi)石油烴的排出規(guī)律同樣呈現(xiàn)出前期快、后期慢并逐漸趨于平衡的規(guī)律，通過把受石油烴污染的中華絨螯蟹放置在潔凈環(huán)境中養(yǎng)殖一段時間后，結(jié)果可明顯降低中華絨螯蟹體內(nèi)石油烴的殘留量，但即使經(jīng)過與富集時間相同的天數(shù)后，中華絨螯蟹體內(nèi)的石油烴含量仍未恢復到富集初期水平，蟹體內(nèi)的石油烴含量越高，其代謝周期越長，由此可見，石油烴具有難代謝性。石油烴成分復雜，其中多環(huán)芳烴(PAHs)是造成其難代謝的主要成分，它不僅降解率低，還會導致生物受到毒害。多環(huán)芳烴的成分也十分復雜，其中某些組分的癌癥潛伏期長達50年[10]。由于石油烴的難代謝性和強毒性，圍繞石油烴的相關(guān)研究越發(fā)受到各地漁業(yè)部門的重視[23-25]。

3.3 養(yǎng)殖水體中石油烴安全閾值的探討

根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部NY 5361—2016《無公害農(nóng)產(chǎn)品 淡水養(yǎng)殖產(chǎn)地環(huán)境條件》對養(yǎng)殖水體中石油烴的限量要求，甲殼類養(yǎng)殖水體中石油烴的安全限量為0.05 mg/L[26]。當養(yǎng)殖水體中石油烴濃度為0.05 mg/L時，中華絨螯蟹中富集的石油烴含量在12 mg/kg以下，低于石油烴的異味閾值，也低于我國現(xiàn)存的甲殼類石油烴的安全限量[27]，因此根據(jù)本文的實驗結(jié)果，0.05 mg/L作為養(yǎng)殖水體中石油烴的安全限量是比較合理的。