褪黑素干預(yù)對(duì)延緩大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生的作用研究

趙夢(mèng)迪，趙文革

褪黑素為哺乳動(dòng)物分泌的一種吲哚類激素，在位于間腦腦前丘和丘腦之間的松果體中由色氨酸經(jīng)羥化、脫羧、乙?；凹谆襟E合成[1]。褪黑素的合成與分泌活動(dòng)與光暗環(huán)境有關(guān)，光照環(huán)境會(huì)抑制褪黑素的合成及分泌，而黑暗環(huán)境則相反，通常凌晨2-3點(diǎn)時(shí)褪黑素的分泌量達(dá)到頂峰[2]。褪黑素具有多種對(duì)人體有益的生理功能，如清除與人體衰老直接相關(guān)的自由基以延緩衰老；發(fā)揮抗氧化作用以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；激活免疫細(xì)胞的增殖以調(diào)節(jié)免疫；調(diào)節(jié)生物節(jié)律以改善睡眠等[3]。因此，維持正常作息、避免夜晚時(shí)處于光照的環(huán)境對(duì)于維持正常的生物節(jié)律十分關(guān)鍵。褪黑素與運(yùn)動(dòng)的關(guān)系十分密切，對(duì)于有睡眠障礙及運(yùn)動(dòng)損傷的運(yùn)動(dòng)員，褪黑素都有很好的調(diào)節(jié)及促進(jìn)恢復(fù)作用。

運(yùn)動(dòng)疲勞是指由于機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)間過長(zhǎng)或強(qiáng)度過大而引起的機(jī)體無法維持原運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度從而致使身體機(jī)能下降的一種生理現(xiàn)象，這種運(yùn)動(dòng)疲勞也稱為中樞運(yùn)動(dòng)疲勞[4]。運(yùn)動(dòng)疲勞是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和康復(fù)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，通常將運(yùn)動(dòng)疲勞機(jī)制總結(jié)為四大理論體系，包括中樞疲勞理論、外周疲勞理論、神經(jīng)-肌肉接點(diǎn)疲勞理論與綜合性運(yùn)動(dòng)疲勞理論[5]，其中研究較為深入的為中樞疲勞理論和外周疲勞理論，中樞疲勞理論是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)出抑制信號(hào)使身體運(yùn)動(dòng)能力下降從而保護(hù)機(jī)體免受損傷；外周疲勞理論是指因肌肉組織代謝產(chǎn)物堆積而引起肌肉疲勞，無論是中樞疲勞還是外周疲勞均會(huì)引起機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力的下降。提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力、緩解疲勞的發(fā)生是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與康復(fù)領(lǐng)域研究的核心問題，為提出行之有效的方法，專家學(xué)者們從多個(gè)方面深入探究造成運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生的因素[6]，主要包括神經(jīng)遞質(zhì)失衡、自由基堆積、乳酸代謝堆積、支鏈氨基酸濃度降低等[7]。其中，神經(jīng)遞質(zhì)失衡與自由基堆積被認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生中較為重要的因素，因此，緩解運(yùn)動(dòng)疲勞的研究多基于此。

當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)保護(hù)性抑制時(shí)，神經(jīng)遞質(zhì)會(huì)降低神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，主要表現(xiàn)為神經(jīng)遞質(zhì)失衡，從而加快運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生。研究表明褪黑素可能會(huì)對(duì)機(jī)體的神經(jīng)遞質(zhì)的含量存在的影響，即通過影響神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡以調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性[8-9]，但其對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的具體影響研究不足。此外，褪黑素還會(huì)作為細(xì)胞內(nèi)的自由基清除劑以防止或延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生，主要包括清除超氧化物陰離子、游離氧分子、過氧化氫陰離子等[10]。本文就褪黑素如何影響運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生及其機(jī)制進(jìn)行探究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SD大鼠30只，體重170g～200g之間(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)。大鼠正常分組(3只/籠)，成年雄性SD大鼠飼養(yǎng)于首都師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心大鼠飼養(yǎng)房，自由飲水，飲食，溫度為18～24℃，空氣相對(duì)濕度40%～60%，正常晝夜節(jié)律。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 褪黑素處理

動(dòng)物分組及給藥：將30只SD大鼠隨機(jī)平均分配為2組(N=15)：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組：將20mg褪黑素先溶于0.5mL的無水乙醇中，取0.5mL上述溶液加入100mL的去離子水溶解飼喂大鼠，即飲用水中含有200μg/mL褪黑素；對(duì)照組：采用含有0.5mL無水乙醇的去離子水飼喂，其余條件均相同。

1.2.2 一次性力竭疲勞模型的建立

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠在飼喂21天后，將兩組大鼠應(yīng)用平板跑臺(tái)一次性力竭跑步模型處理，即大鼠每天測(cè)試前需進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練(1次/天，共3天)，該運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度低于力竭運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，待大鼠恢復(fù)2天后進(jìn)行一次性力竭跑步實(shí)驗(yàn)，即treadmill平板跑臺(tái)法，基本流程為：跑步時(shí)速：15cm/s，時(shí)間：15min；隨后，跑步時(shí)速：25cm/s，時(shí)間：15min；最后跑步時(shí)速保持在35cm/s直至力竭并記錄最終運(yùn)動(dòng)力竭時(shí)間。

1.2.3 腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)

兩組大鼠力竭跑步實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用斷頭法獲取腦組織，置于冰上并迅速分離皮質(zhì)、下丘腦、海馬、紋狀體。取部分樣品采用高氯酸提取法充分勻漿后，4000g/min離心5min，離心取上清液，-80℃凍存，采用高效液相色譜法分析各部分腦組織內(nèi)NE、DA、5-HT和DOPAC的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用t檢驗(yàn)分析，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一次性力竭跑步時(shí)間

兩組大鼠經(jīng)一次性力竭運(yùn)動(dòng)后，測(cè)定最終運(yùn)動(dòng)力竭時(shí)間，結(jié)果顯示褪黑素處理組較對(duì)照組跑步持續(xù)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，力竭出現(xiàn)時(shí)間明顯延后。褪黑素處理組大鼠跑步力竭時(shí)間為232.39±34.38min，對(duì)照組跑步力竭時(shí)間為187.17±21.08min(P<0.01)。

2.2 神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)

2.2.1 褪黑素處理對(duì)NE的影響

在對(duì)照組中NE的相對(duì)含量為4058.99±955.15，褪黑素處理組為8401.52±2581.32，褪黑素處理后，NE含量較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。

圖1 運(yùn)動(dòng)力竭時(shí)間

2.2.2 褪黑素處理對(duì)DA的影響

在對(duì)照組中DA的相對(duì)含量為3.95±1.84，褪黑素處理組為7.56±2.80，褪黑素處理后，DA含量顯著提于對(duì)照組(P<0.05)。

圖3 DA相對(duì)含量

2.2.3 褪黑素處理對(duì)5-HT的影響

在對(duì)照組中5-HT的相對(duì)含量為366.22±95.33，褪黑素處理組為131.75±66.51，褪黑素處理后，5-HT含量顯著降低(P<0.05)。

圖4 5-HT相對(duì)含量

2.2.4 褪黑素處理對(duì)DOPAC的影響

在對(duì)照組中DOPAC相對(duì)含量為37.56±27.39，褪黑素處理組為59.49±16.49，兩組DOPAC含量無顯著性差異(P>0.05)。

圖5 DOPAC相對(duì)含量

3 分析及討論

3.1 褪黑素處理延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間

實(shí)驗(yàn)表明，褪黑素處理會(huì)顯著延長(zhǎng)SD大鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。這與其他文獻(xiàn)中的報(bào)道一致，如大鼠的負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)中，褪黑素的應(yīng)用明顯延長(zhǎng)了大鼠的游泳時(shí)間[11]，研究表明這與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性相關(guān)。興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)以及神經(jīng)遞質(zhì)和受體之間存在動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體經(jīng)過一段時(shí)間特定強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)后，神經(jīng)遞質(zhì)的失衡會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生，相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)包括多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(E)、5-羥色胺(5-HT)、乙酰膽堿(Ach)、谷氨酸(GA)等。因此，本實(shí)驗(yàn)將NE、DA、5-HT、DOPAC作為檢測(cè)目標(biāo)，分析褪黑素處理延緩運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生的機(jī)制。

3.2 褪黑素處理對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

3.2.1 多巴胺結(jié)果分析

多巴胺是神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)機(jī)體運(yùn)動(dòng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，由酪氨酸經(jīng)轉(zhuǎn)化而來，重要的代謝產(chǎn)物包括去甲腎上腺素和二羥苯乙酸[13]。因此多巴胺代謝水平的高低直接影響到其他被檢測(cè)的神經(jīng)遞質(zhì)的含量，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，去甲腎上腺素的含量與多巴胺的含量變化趨勢(shì)一致。多巴胺與運(yùn)動(dòng)的關(guān)系一直是運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究表明，當(dāng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)，DA及其代謝產(chǎn)物NE濃度均升高[14-15]。這與其作用相關(guān)，即DA與NE會(huì)提高神經(jīng)系統(tǒng)興奮、增強(qiáng)肌肉協(xié)調(diào)、升高血糖供給能量等，這在機(jī)體運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮了重要的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中褪黑素處理導(dǎo)致的多巴胺的含量顯著升高，這說明褪黑素可能通過提高多巴胺的含量提高運(yùn)動(dòng)能力，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間。

3.2.2 去甲腎上腺素結(jié)果分析

去甲腎上腺素作為機(jī)體中一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和升血糖激素，在運(yùn)動(dòng)過程中會(huì)提高神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性以提高運(yùn)動(dòng)能力，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間，除此之外，去甲腎上腺素會(huì)提高血糖的含量以提供機(jī)體運(yùn)動(dòng)所需能量[16]。

去甲腎上腺素由多巴胺轉(zhuǎn)化而來，其含量的高低受到多巴胺代謝的影響。同時(shí)，去甲腎上腺素又是褪黑素合成的原料，代謝水平的高低直接影響褪黑素的合成。在本實(shí)驗(yàn)中，褪黑素對(duì)大鼠的處理使其去甲腎上腺素含量顯著升高，可能是由于機(jī)體內(nèi)褪黑素含量升高導(dǎo)致的后續(xù)代謝產(chǎn)物對(duì)去甲腎上腺素的合成存在影響，這刺激了去甲腎上腺素的合成。褪黑素通過影響多巴胺、去甲腎上腺素發(fā)揮作用，促使中樞神經(jīng)持續(xù)興奮從而延緩了神經(jīng)系統(tǒng)的疲勞。

3.2.3 5-羥色胺結(jié)果分析

5-羥色胺是衡量運(yùn)動(dòng)疲勞的標(biāo)志性神經(jīng)遞質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示褪黑素處理組中5-羥色胺的含量顯著低于對(duì)照組。5-羥色胺作為運(yùn)動(dòng)研究領(lǐng)域的“明星分子”，關(guān)于其在運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中的作用及機(jī)制的研究較為廣泛且深入。研究顯示，由于血腦屏障的存在，5-羥色胺只能在腦內(nèi)合成，當(dāng)運(yùn)動(dòng)一段時(shí)間后，隨著運(yùn)動(dòng)疲勞的出現(xiàn)，血液中游離氨基酸含量上升并與色氨酸競(jìng)爭(zhēng)受體位點(diǎn)，這使得游離色氨酸含量增加進(jìn)而進(jìn)入腦內(nèi)，導(dǎo)致腦內(nèi)5-羥色胺合成含量的升高[17]。腦內(nèi)5-羥色胺含量的增加會(huì)使得大腦皮層抑制性加強(qiáng)，降低多種酶的活性，減少ATP的合成量，致使機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力降低[18]。采用褪黑素處理大鼠可能通過抑制腦內(nèi)5-羥色胺的含量從而導(dǎo)致大腦皮層的興奮性增強(qiáng)，進(jìn)而延緩了運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生。

3.2.4 3,4-二羥苯乙酸結(jié)果分析

3,4-二羥苯乙酸作為多巴胺的代謝產(chǎn)物在運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域中的研究較少。我們的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)褪黑素處理并沒有改變3,4-二羥苯乙酸的含量，推測(cè)3,4-二羥苯乙酸并不參與運(yùn)動(dòng)疲勞的延緩，因此褪黑素處理延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生與神經(jīng)遞質(zhì)3,4-二羥苯乙酸無關(guān)。

3.3 褪黑素通過改善神經(jīng)遞質(zhì)失衡延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的機(jī)制推測(cè)

前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠在負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)中，褪黑素處理組中血清乳酸脫氫酶的活性顯著高于對(duì)照組[11]，同時(shí)，褪黑素處理會(huì)降低熱應(yīng)激小鼠的氧化損傷[12]，這表明褪黑素具有清除自由基及抗氧化的作用。褪黑素極易穿過血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，并在其中發(fā)揮強(qiáng)大的自由基清除作用，同時(shí)可以減輕自由基導(dǎo)致的線粒體損傷和腫脹，這就讓褪黑素成為了神經(jīng)的保護(hù)劑，產(chǎn)生了抗興奮作用[19]。在機(jī)體運(yùn)動(dòng)初期，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)DA、NE濃度升高，隨著特定強(qiáng)度下運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)為了保護(hù)機(jī)體免受損傷而產(chǎn)生抑制信號(hào)，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)疲勞，DA、NE濃度下降，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-HT濃度升高。本次實(shí)驗(yàn)采用褪黑素處理時(shí)，褪黑素可能穿過血腦屏障對(duì)中樞神經(jīng)起到保護(hù)作用進(jìn)而促進(jìn)了DA、NE含量的增加，抑制了5-HT的濃度，延緩了運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生。

神經(jīng)細(xì)胞中天冬氨酸為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，γ氨基丁酸為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。小鼠經(jīng)褪黑素灌胃后測(cè)定天冬氨酸、γ-氨基丁酸呈現(xiàn)晝夜節(jié)律變化，γ氨基丁酸含量升高[20]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生運(yùn)動(dòng)疲勞時(shí)，褪黑素處理導(dǎo)致的γ氨基丁酸升高會(huì)導(dǎo)致中樞抑制作用進(jìn)而對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞也有很好的調(diào)節(jié)作用[21-22]。這也可能是褪黑素發(fā)揮作用的潛在機(jī)制。

4 結(jié)論

1.通過力竭運(yùn)動(dòng)模型發(fā)現(xiàn)，褪黑素處理組SD大鼠的最終力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著高于對(duì)照組，表明褪黑素處理可以顯著延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生。

2.在SD大鼠的力竭運(yùn)動(dòng)模型中，褪黑素處理顯著提高了興奮性神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素、多巴胺的含量，降低了抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺的含量，因此推測(cè)褪黑素延緩SD大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生的機(jī)制為：提高興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的含量，降低抑制性神經(jīng)遞質(zhì)含量來維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，改善因長(zhǎng)時(shí)間或高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)失衡，這可能通過褪黑素本身具有的自由基清除及抗氧化作用提高了大鼠的運(yùn)動(dòng)能力以此延緩了運(yùn)動(dòng)力竭出現(xiàn)的時(shí)間。