不同季節(jié)的微生物結(jié)構(gòu)對(duì)垃圾滲濾液處理影響

黃 磊，孫宇飛，尹思雨，鄧冬梅

（廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545005）

0 引言

垃圾滲濾液是垃圾填埋后長期存在的副產(chǎn)物，其典型的污染物包括高濃度的溶解有機(jī)物、銨態(tài)氮、無機(jī)鹽和各種懸浮固體。由于缺乏可生物降解的有機(jī)碳源，垃圾滲濾液被認(rèn)為是一種難以處理的廢水。生物脫氮是目前垃圾滲濾液降解的主流工藝，現(xiàn)有的生物脫氮工藝包括硝化反硝化工藝、內(nèi)源性反硝化工藝和氨氧化工藝等。其中硝化和反硝化工藝被認(rèn)為是目前最經(jīng)濟(jì)的廢水生物脫氮處理技術(shù)，并用于垃圾填埋場的初期處理中。硝化反硝化過程是在硝化菌和反硝化菌存在的情況下將氨氮轉(zhuǎn)化成為氮?dú)?，最終從水中逸出，從而達(dá)到生物脫氮的目的。由于硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌所處的環(huán)境不同，通常硝化反應(yīng)過程需要好氧條件，而反硝化反應(yīng)過程則是在缺氧條件下進(jìn)行；因此，需要將硝化和反硝化過程分開。單級(jí)A/O工藝預(yù)計(jì)不足以進(jìn)行滲濾液處理，研究結(jié)果表明采用多級(jí)工藝處理可以達(dá)到較好的處理效果。多級(jí)工藝處理即在同一個(gè)處理系統(tǒng)中串聯(lián)多個(gè)缺氧段（A）和好氧段（O），一個(gè)缺氧段和一個(gè)好氧段構(gòu)成一級(jí)反應(yīng)器，一套污水系統(tǒng)通常包含2～5個(gè)反應(yīng)器。多級(jí)硝化反硝化具有碳源利用率高，去除效果好的特點(diǎn)，而且缺氧段與好氧段的交替運(yùn)行，能夠不斷地進(jìn)行硝化與反硝化反應(yīng)，缺氧段產(chǎn)生的堿度可以補(bǔ)充好氧段消耗的堿度。另外缺氧前期的反硝化利用了大量碳源，進(jìn)入好氧階段的碳源相對(duì)較少，也可以抑制異養(yǎng)菌的生長，從而利于自養(yǎng)型硝化菌生長。膜生物反應(yīng)器（MBR）是膜分離技術(shù)與傳統(tǒng)活性污泥法相組合的新型污水處理工藝技術(shù)，具有出水水質(zhì)好、占地面積小、剩余污泥少、易于控制和改造等優(yōu)點(diǎn)；因此，MBR 已被應(yīng)用于城市污水處理、工業(yè)廢水處理、微污染飲用水凈化、填埋場和焚燒廠滲濾液處理等方面。將多級(jí)A/O 反應(yīng)器與MBR組合，可以實(shí)現(xiàn)氨氮高效去除的目的，適合應(yīng)用于城市垃圾滲濾液的大量處理。

在利用硝化反硝化處理垃圾滲濾液過程中，反應(yīng)池中微生物是處理的關(guān)鍵因素，不同地區(qū)的垃圾滲濾液的組成和水質(zhì)的處理量也有所差異，這導(dǎo)致反應(yīng)池中的微生物結(jié)構(gòu)也將不同。環(huán)境因素影響水處理的效果，比如溫度和水質(zhì)變化會(huì)影響到水處理系統(tǒng)的微生物組成。在以往的其他水處理系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)微生物的結(jié)構(gòu)主要受季節(jié)影響，北半球的夏季溫度較高，優(yōu)勢菌屬的豐富度要比冬季的優(yōu)勢菌屬要高，微生物的結(jié)構(gòu)也存在差異。冬季低溫會(huì)對(duì)微生物的數(shù)量和群落構(gòu)成產(chǎn)生影響，延長系統(tǒng)的啟動(dòng)時(shí)間、限制垃圾滲濾液污水處理效率等。認(rèn)識(shí)垃圾滲濾液處理工藝中的微生物和水質(zhì)去除的關(guān)系是了解水處理本質(zhì)的關(guān)鍵，這將有助于水處理過程的設(shè)計(jì)和工藝優(yōu)化。

為了解不同季節(jié)溫度下垃圾滲濾液處理池中的微生物結(jié)構(gòu)組成和對(duì)水質(zhì)去除的影響，本試驗(yàn)分別在夏季和冬季從柳州某垃圾滲濾液污水處理廠生物反應(yīng)池中采樣，通過理化測定分析水質(zhì)處理效果和高通量測序測定微生物的組成，探究不同季節(jié)生物池中的群落結(jié)構(gòu)對(duì)垃圾滲濾液處理結(jié)果的影響，為以后的垃圾滲濾液處理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集測定方法

從柳州某垃圾滲濾液污水處理廠中收集生物樣品，該垃圾滲濾液污水處理廠工藝流程如圖1所示，污水處理廠采用硝化反硝化處理工藝，污水處理量約為600 t/d，生物反應(yīng)池由2 級(jí)A/O+MBR 相結(jié)合，預(yù)處理后通過I級(jí)反硝化池后進(jìn)入硝化池，之后再進(jìn)入Ⅱ級(jí)硝化池和反硝化池。本次樣品采集時(shí)間為9 月和12 月，由于硝化和反硝化池中的大量回流導(dǎo)致在物種組成和結(jié)構(gòu)上并無太大差異，所以將I級(jí)硝化池和反硝化池歸為I級(jí)反應(yīng)池，Ⅱ級(jí)硝化池和反硝化池歸為Ⅱ級(jí)反應(yīng)池。采樣點(diǎn)為I級(jí)反應(yīng)池和Ⅱ級(jí)反應(yīng)池2 個(gè)串聯(lián)系統(tǒng)，每個(gè)反應(yīng)池取1 000 mL 的泥水混合樣。每次取I級(jí)硝化反硝化池和Ⅱ級(jí)硝化反硝化池各2 個(gè)樣品，每個(gè)季節(jié)取4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)。其中夏季取樣16 個(gè)，冬季16個(gè)，總共32 個(gè)樣品，取樣后對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行測試。采樣信息如表1所示。

圖1 垃圾滲濾液污水處理工藝圖

表1 采樣信息

水質(zhì)指標(biāo)參數(shù)化學(xué)需氧量（COD）通過重鉻酸鉀法測定（GB 11914—89），氨氮（NH—N）測定使用納氏試劑比色法（HJ 535—2009），硝酸鹽氮（NO—N）通過酚二磺酸分光光度法測定（GB/T 7480—1987），亞硝酸鹽氮（NO—N）通過分光光度法測定（GB/T 7493—1987）。

1.2 樣品的預(yù)處理及提取DNA

將采集的泥水混合樣取100 mL 進(jìn)行離心，得到沉淀的污泥，用Powersoil 土壤DNA 提取試劑盒來提取污泥中的總DNA。所提取的DNA 溶液，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度。取適量DNA溶液，使用Nanodrop 檢測DNA 濃度。用通用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′），806R（5′-GGACTACHⅤGGGTWTCTAAT-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃延伸10 min，30個(gè)循環(huán)，完成后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度，將各樣品進(jìn)行等濃度混樣?；鞓赢a(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并切膠回收產(chǎn)物。最后通過Illumina Hiseq 2500測序平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌16SrDNA 高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Qiime將測序得到的序列在97%相似度水平下進(jìn)行聚類和注釋，并分別在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成與OTU 信息。樣本微生物多樣性指數(shù)算法參考計(jì)算Chao 指數(shù)和Shannon 指數(shù)，通過比對(duì)夏季和冬季2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的多樣性，計(jì)算差異性并作圖。利用R 語言Prcomp 函數(shù)對(duì)門水平和屬水平進(jìn)行樣本主成分分析（principal component analysis，PCA）和作圖。對(duì)不同季節(jié)反應(yīng)池中微生物群落進(jìn)化分支進(jìn)行LEfSe 分析，線性判別分析（LDA）閾值設(shè)為2。分別對(duì)門水平和屬水平豐度大于1%的物種繪制物種組成圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同季節(jié)的進(jìn)水水質(zhì)及污染物去除效果分析

化學(xué)需氧量（COD）和氮含量是評(píng)估垃圾滲濾液的2 個(gè)重要指標(biāo)，也是垃圾滲濾液需要去除的2 個(gè)重要污染物，圖2 是I/Ⅱ級(jí)反應(yīng)池中2 個(gè)季節(jié)的COD、NH—N、NO—N 和NO—N 的進(jìn)水質(zhì)量濃度對(duì)比。I級(jí)反應(yīng)池COD 的進(jìn)水質(zhì)量濃度范圍是12 480～12 590 mg/L，夏季進(jìn)水質(zhì)量濃度低于冬季，Ⅱ級(jí)反應(yīng)池COD 的進(jìn)水質(zhì)量濃度范圍是1 309～1 320 mg/L。NH—N 的2 個(gè)季節(jié)進(jìn)水差異較大，夏季進(jìn)水質(zhì)量濃度要高于冬季進(jìn)水質(zhì)量濃度，I級(jí)進(jìn)水質(zhì)量濃度范圍是1 311～2 120 mg/L，Ⅱ級(jí)進(jìn)水質(zhì)量濃度范圍是39～126 mg/L，2個(gè)季節(jié)進(jìn)水具有顯著差異。NO—N和NO—N在2個(gè)季節(jié)的進(jìn)水差異較小，I級(jí)反應(yīng)池NO—N進(jìn)水質(zhì)量濃度夏季低于冬季，而NO—N冬季進(jìn)水質(zhì)量濃度要略低于夏季。從I級(jí)反應(yīng)池對(duì)這幾個(gè)進(jìn)水指標(biāo)的去除效果上看，COD、NH—N、NO—N冬季的去除率要大于夏季的去除率，NO—N夏季的去除率大于冬季。

圖2 （網(wǎng)絡(luò)版彩圖）反應(yīng)池進(jìn)水水質(zhì)及污染物去除效果（**表示p ＜0.01）

圖2 （續(xù)）

2.2 反應(yīng)池中細(xì)菌群落的α多樣性分析

對(duì)冬夏兩季收集的生物樣品進(jìn)行高通量測序，所測的樣品中含有的多樣性指數(shù)如圖3所示。Chao指數(shù)是用來估計(jì)群落中含OTU 數(shù)目的指數(shù)，常用來估計(jì)物種總數(shù)，表示樣品的物種豐富度。在夏季和冬季2個(gè)季節(jié)中，2個(gè)反應(yīng)池中夏季的Chao指數(shù)高于冬季，并且具有顯著性差異（＜0.05），說明夏季的物種豐富度高于冬季的物種豐富度，并且溫度影響了反應(yīng)池中的菌群豐富度（圖3（a））。Shannon指數(shù)是用來估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)之一，數(shù)值越大，說明群落多樣性越高。在不同取樣時(shí)間的樣品中，2 個(gè)反應(yīng)池中夏季的Shannon 指數(shù)要高于冬季，所以夏季的群落多樣性高于冬季，這說明了溫度是影響群落多樣性的重要因素。

圖3 （網(wǎng)絡(luò)版彩圖）反應(yīng)池中夏季和冬季的物種多樣性和群落豐富度（**表示p ＜0.01）

2.3 垃圾滲濾液處理反應(yīng)池中細(xì)菌群落差異分析

PCA是基于原始的物種組成矩陣所做的排序分析，通過主成分分析方法對(duì)2個(gè)反應(yīng)池中不同取樣時(shí)間門水平和屬水平進(jìn)行差異分析。圖4是門水平和屬水平上不同季節(jié)不同樣品之間微生物群落的PCA圖。圖4顯示微生物在門水平和屬水平上以季節(jié)聚類到一起，說明季節(jié)是影響物種組成的重要因素，2個(gè)反應(yīng)池中的物種差異性小，溫度對(duì)微生物群落的差異性起到更大作用。在門水平上，PCA結(jié)果顯示PC1和PC2占菌門的47.7%和11.2%的解釋量，此時(shí)整體的菌門主要是按季節(jié)分布的，但在冬季的2個(gè)樣品偏向夏季，這說明在門水平上還是具有一定的組成相似性。在屬水平上，PCA結(jié)果顯示2個(gè)季節(jié)的樣品距離更遠(yuǎn)，說明屬水平的差異性更大。

圖4 （網(wǎng)絡(luò)版彩圖）基于PCA不同季節(jié)細(xì)菌微生物群落差異性

圖4 （續(xù)）

對(duì)不同季節(jié)和不同處理階段反應(yīng)池中優(yōu)勢微生物進(jìn)化分支的LEfSe分析見圖5，從菌群結(jié)構(gòu)上看，反應(yīng)器在豐度上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌群，LDA 設(shè)為2，LEfSe 分析結(jié)果顯示各階段中的biomarker 分別為夏季I級(jí)反應(yīng)池1個(gè)，夏季Ⅱ級(jí)反應(yīng)池11個(gè)，冬季I級(jí)反應(yīng)池2個(gè)，冬季Ⅱ級(jí)反應(yīng)池20個(gè)。主要的差異物種主要體現(xiàn)在Ⅱ級(jí)反應(yīng)池中，冬季的顯著差異物種要大于夏季。

圖5 （網(wǎng)絡(luò)版彩圖）不同季節(jié)反應(yīng)池中微生物群落進(jìn)化分支LEfSe分析

2.4 不同季節(jié)硝化反硝化池中細(xì)菌群落的組成和多樣性

在不同季節(jié)對(duì)I級(jí)和Ⅱ級(jí)反應(yīng)池進(jìn)行取樣，在屬水平上對(duì)反應(yīng)池中的微生物多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示夏季和冬季部分優(yōu)勢物種豐富度具有明顯差異，I級(jí)和Ⅱ級(jí)反應(yīng)池的微生物相對(duì)差異性較?。▓D6）。屬水平的主要優(yōu)勢屬為陶厄氏菌屬（）、甲烷食甲基菌屬（）、懶小桿屬（）、甲烷八疊球菌屬（）和厭氧繩菌屬（）等。是夏季和冬季最優(yōu)勢的菌屬，在夏季的豐富度為37.79%～48.54%，冬季的豐富度為84.52%～88.37%，2個(gè)季節(jié)的豐富度具有明顯差異。作為一類具有反硝化能力的革蘭氏陰性細(xì)菌，可將NO中的氮元素通過一系列中間產(chǎn)物（NO、NO、NO）還原為N，對(duì)氮元素的去除具有重要的作用。在夏季和冬季不同時(shí)間點(diǎn)的豐富度分別為9.06%～29.87%和0.81%～1.86%。而常存在于脫氮系統(tǒng)中，是一種具有反硝化功能的細(xì)菌，夏季的豐富度要大于冬季。在厭氧消化的產(chǎn)甲烷化作用和對(duì)氮元素的去除中發(fā)揮著重要的作用，其在夏季和冬季的豐富度分別為0.42%～1.94%和0.25%～0.93%。

圖6 （網(wǎng)絡(luò)版彩圖）不同季節(jié)反應(yīng)池中屬水平生物組成

3 討論

3.1 不同季節(jié)下反應(yīng)池對(duì)垃圾滲濾液的去除

2 個(gè)硝化反硝化池對(duì)水質(zhì)中COD、NH—N、NO—N 和NO—N 的去除中，NH—N 夏季和冬季的去除率分別為98.0%和99.4%，說明反應(yīng)池能夠高效地去除NH—N，這與反應(yīng)器中豐富的變形菌門有關(guān)（圖6）。COD夏季和冬季去除率為92.6%和93.7%。NO—N 的去除率略低，夏季和冬季為79.7%和77.8%；NO—N的去除最差，夏季和冬季為60.0% 和68.5%，結(jié) 合NH—N、NO—N 和NO—N 的去除，滲濾液中的總氮的去除率也達(dá)到了夏季的92.6%和冬季的93.5%，這些結(jié)果表明滲濾液中的污染物得到有效去除。在夏季和冬季中，反應(yīng)池對(duì)滲濾液中的COD、NH—N、TN 的去除效果并無太大區(qū)別，雖進(jìn)水中如NH—N 的量具有差異性（夏季為2 011 mg/L，冬季為1 548 mg/L），但是最終的處理效果相近（為98.0%和99.4%），這表明溫度的變化對(duì)COD 和氮的去除結(jié)果影響較小。

3.2 不同季節(jié)下反應(yīng)池中的群落結(jié)構(gòu)

多樣性分析結(jié)果顯示不同組分的生物樣品夏季的Chao 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均高于冬季，并且具有顯著差異（＜0.05），這說明在垃圾滲濾液處理硝化反硝化反應(yīng)池中夏季的物種豐富度和菌落多樣性要高于冬季。溫度的變化對(duì)反應(yīng)池中的微生物多樣性產(chǎn)生重要影響，高的溫度對(duì)更多的微生物生長有利，所以夏季的物種豐富度和菌落多樣性明顯要高于冬季。在對(duì)反應(yīng)池中細(xì)菌群落進(jìn)行差異分析時(shí)，PCA結(jié)果顯示夏季和冬季2個(gè)季節(jié)門水平和屬水平上是以季節(jié)為聚類的，來自2個(gè)反應(yīng)池之間的微生物聚類到了一起，說明在空間上的微生物差異性小，主要由季節(jié)溫度主導(dǎo)反應(yīng)池中細(xì)菌微生物組成和結(jié)構(gòu)。

對(duì)物種組成進(jìn)行差異性分析，結(jié)果顯示差異的物種較少，其主要的差異物種主要體現(xiàn)在Ⅱ級(jí)反應(yīng)池中，冬季的顯著差異物種要大于夏季。在物種組成上，I級(jí)和Ⅱ級(jí)反應(yīng)池在物種豐富度上并無太大差異，這是硝化和反硝化池中的大量回流導(dǎo)致的結(jié)果。反應(yīng)池中的微生物在門水平的組成主要由變形菌門（）、擬桿菌門（）、疣微菌門（）、綠彎菌門（）、綠菌門（）、OD1 菌門和廣古菌門（）所主導(dǎo)，不同菌門分布呈現(xiàn)明顯的季節(jié)特征。根據(jù)之前的研究發(fā)現(xiàn)，是污水處理廠中最主要的微生物群，這對(duì)于高氮含量的垃圾滲濾液來說，該菌門在碳氮去除方面發(fā)揮著重要的作用。包含優(yōu)勢的屬和，具有反硝化能力，它們的存在說明在反應(yīng)池中起到重要的反硝化作用；是一種能夠產(chǎn)生甲烷的微生物，可將甲烷氧化并釋放出中間體，這些中間體可以作為共生細(xì)菌呼吸的電子供體。2個(gè)反應(yīng)池的在冬季的豐富度均高于夏季，并且差異顯著，說明該菌可以在溫度較低的時(shí)候發(fā)揮積極的作用，這也是冬季的氮去除率高于夏季的原因（圖2、圖3）。是除外豐富度最高的菌門，是環(huán)境中常見的水解-酸化細(xì)菌，可利用長鏈揮發(fā)性脂肪酸（例如丙酸和丁酸）作為底物，降解垃圾滲濾液中的許多大分子物質(zhì)，例如碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，并且將可溶性糖轉(zhuǎn)化為單糖和短鏈脂肪酸。在夏季的豐富度要高于冬季的豐富度，這對(duì)垃圾滲濾液中的大分子物質(zhì)的去除具有重要作用。相對(duì)于其他污水處理廠，是硝化反硝化池中比較特殊的優(yōu)勢菌門，且在反應(yīng)池中的豐富度較高，是2 個(gè)季節(jié)相差最大的一個(gè)菌類。據(jù)研究表明該菌類存在于低溫環(huán)境中，NO—N對(duì)Ⅴer豐富度有顯著影響，該菌與纖維素的厭氧降解有關(guān)且能夠降解有機(jī)物，這對(duì)冬季的垃圾滲濾液處理起重要作用。和是普遍存在于水處理系統(tǒng)中的2 個(gè)優(yōu)勢菌門，其夏季的豐富度要顯著高于冬季。該菌的作用是在缺氧條件下將EPS基質(zhì)中腐爛的細(xì)菌細(xì)胞物質(zhì)和細(xì)胞外肽分解成更簡單的有機(jī)物，例如乳酸和乙醇，其他物種可以利用它們進(jìn)行新陳代謝，在此過程中產(chǎn)生NO—N 可作為厭氧氨氧化過程電子受體。此外，還能夠降解芳香族化合物（例如腐殖質(zhì)），這可能在難處理的有機(jī)物中起關(guān)鍵作用。和的優(yōu)勢屬分別為和，其中具有降解碳水化合物的功能，而是具有反硝化功能的一類細(xì)菌。是2 個(gè)季節(jié)反應(yīng)池中豐富度最高的古菌，其主要以為主，在厭氧硝化時(shí)的產(chǎn)甲烷化作用和氮元素的去除中發(fā)揮著重要的作用。結(jié)合水質(zhì)的去除和物種差異情況分析，表明垃圾滲濾液的處理效果和主要功能菌種相關(guān)，與物種豐富度相關(guān)不大。

4 結(jié)論

1）不同季節(jié)垃圾滲濾液的NH—N、COD、NO—N、NO—N 均能得到良好去除，其中NH—N 在夏季和冬季的去除率達(dá)到了98.0%和99.4%，COD 在夏季和冬季的去除率也達(dá)到了92.6%和93.7%，NO—N 和NO—N 去除效果較差，反應(yīng)池在夏季對(duì)污染物的去除率要低于冬季。

2）溫度的變化影響反應(yīng)池中的物種豐富度，I級(jí)和Ⅱ級(jí)反應(yīng)池中微生物的差異性小，夏季的物種豐富度和菌落多樣性要高于冬季。

3）夏季和冬季反應(yīng)池中主要以、、、和為主，物種豐富度對(duì)不同季節(jié)的微生物對(duì)水質(zhì)的去除效果相關(guān)不大，主要和優(yōu)勢的功能菌屬有關(guān)。