核桃餅粕、三七花復(fù)合發(fā)酵飲品制備及功效研究*

徐田，耿樹香，寧德魯，葉永麗，高麗輝

(1.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201；2.江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；3.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500 )

核桃仁具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，有著“益智果”“長壽果”的美譽[1]。目前核桃加工的主要產(chǎn)品為核桃油、核桃乳、核桃蛋白粉、核桃仁休閑食品等，核桃產(chǎn)品種類較為單一，產(chǎn)品深加工基礎(chǔ)較為薄弱。在核桃油生產(chǎn)的過程中，可獲得大量的加工副產(chǎn)物，即核桃粕。核桃粕中富含蛋白質(zhì)，還含有維生素、磷脂、胡蘿卜素、多酚類、黃酮類、三萜類、糖苷類、微量元素等多種營養(yǎng)物質(zhì)[2-4]。由于榨油工藝的要求，去殼核桃粕中蛋白含量高達(dá)35%～50%，多用于制備核桃蛋白粉及肽。因核桃蛋白含70%以上的谷蛋白，在制備過程中所用工藝酸或堿水解法存在嚴(yán)重的消旋作用，無法被人體同化，且在脫除強酸堿時對環(huán)境污染加大，該方法被淘汰。用酶解法生產(chǎn)蛋白及肽粉投資成本較大，無法產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，其產(chǎn)品附加值未得到較好發(fā)揮，不僅造成核桃資源的浪費，還限制核桃精深加工[5-11]。

為充分利用核桃加工副產(chǎn)物——餅粕，提高資源利用率以及豐富市場核桃產(chǎn)品，本研究以核桃粕為原料，結(jié)合具有多種生物功能的三七花、枸杞和紅棗進行有益菌發(fā)酵制備混合發(fā)酵飲品。一方面，由于原料中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、黃酮、總皂苷、多糖等生物活性物質(zhì)，發(fā)酵飲品具有如抗氧化、清熱解毒、降壓調(diào)脂、提高免疫力等的功能性；另一方面，實現(xiàn)了核桃副產(chǎn)物的深加工及綜合利用，開發(fā)出高附加值產(chǎn)品，具有非常重要的經(jīng)濟價值。

1 材料、工藝與方法

1.1 試驗材料

原料核桃餅粕取自2020年的‘云南漾泡’核桃純物理壓榨物，輔料為三七(Panaxnotoginseng)花、枸杞(Lyciumchincnse)、紅棗(Ziziphusjujube)采購于藥店。

試劑 四氧嘧啶(批號08865)，二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格0.25 g，批號AAN6717)，葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號20200905137)，豬油(上海楓未實業(yè)有限公司，批號20201027)，非諾貝特(200 mg/粒，批號30586)，血脂四項聯(lián)檢試劑盒(三諾生物傳感股份有限公司，批號01J0922)。

動物 健康SD大白鼠(Musmusculus)〔雄性，體重180～220 g，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2020-030]〕，健康ICR小白鼠〔雄性，體重18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0004]〕。

飼養(yǎng)條件 室溫為(25±2)℃，相對濕度60%～70%。

儀器 美國BIO-TEK Synergy 2 酶標(biāo)儀，三諾ICARE-2000生化分析儀。

1.2 制備工藝

配方 榨油后獲得的核桃餅粕60 g，三七花7 g，枸杞3 g，大棗3 g，飲用水500 g，蜂蜜5 g，乳桿菌發(fā)酵劑0.4 g，低聚果糖8 g。

具體步驟為：

(1)核桃餅粕預(yù)處理 除去發(fā)生氧化有哈喇味的餅粕，將其余餅粕打散成小塊狀，剔除可能在榨油時帶入的異物。

(2)三七花預(yù)處理 優(yōu)選新鮮緊簇、無腐爛的三七花，純凈水清洗后烘干備用。由于三七花保鮮期短，容易氧化變黑影響發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，且三七花數(shù)量大存放時散熱困難易引起腐爛，無法保證發(fā)酵所用原料的質(zhì)量，因此將三七花烘干后備用。

(3)枸杞預(yù)處理 挑選優(yōu)質(zhì)枸杞，剔除枝葉等雜質(zhì)，用清水沖洗1～2次，瀝干水份備用。

(4)紅棗預(yù)處理 挑選優(yōu)質(zhì)無蟲蛀、大小均勻的干紅棗，清洗2次除去表面塵土，用粉碎機搗碎備用。

(5)乳桿菌發(fā)酵劑 乳桿菌發(fā)酵劑由嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、保加利亞乳桿菌(L.delbrueckiisubsp)、干酪乳桿菌(L.casei)3種乳桿菌混合得到。分別將上述3種經(jīng)復(fù)蘇且生長狀態(tài)良好的乳桿菌接種至MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下?lián)u床120 r/min培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)液于5 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集菌體，并用無菌生理鹽水分3次洗滌菌體。將嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌按重量比1︰2︰2混合得到乳桿菌發(fā)酵劑。

(6)調(diào)配 將準(zhǔn)備好的核桃粕、三七花、枸杞、紅棗原料按比例移至發(fā)酵用桶內(nèi)， 依次加入約400 g飲用水、5 g蜂蜜、0.4 g發(fā)酵乳桿菌(乳桿菌的添加量要求總的活菌數(shù)達(dá)108 CFU/mL以上)，最后將剩余飲用水(100 g)全部加入攪拌混勻。

(7)發(fā)酵處理 用保鮮膜密封桶口后蓋桶蓋，進行厭氧發(fā)酵，室溫約為26 ℃，發(fā)酵時間20 d。

(8)過濾 發(fā)酵結(jié)束后，用攪拌器或不銹鋼勺略加攪拌，然后用濾布袋進行過濾，將發(fā)酵液與發(fā)酵原料初步分離，得到粗濾液；粗濾液再經(jīng)超濾裝置進行精濾，濾膜為直徑50 nm的無機陶瓷膜，過濾壓力0.2～0.25 MPa，濾液流速100 mL/min。

(9)二次調(diào)配 精濾后的發(fā)酵液中加入按發(fā)酵液100 g重量計的8 g低聚果糖，攪拌混勻，調(diào)整發(fā)酵液的糖度和甜度。

圖1 核桃餅粕發(fā)酵飲品的制備工藝Fig.1 Preparation technology of walnut cake fermented beverage

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵飲品生物活性及抗氧化指標(biāo)檢測

活菌計數(shù)采用顯微鏡直接計數(shù)法計算單位重量菌數(shù)；基本成分測定參照食品衛(wèi)生檢驗方法系列標(biāo)準(zhǔn)(總蛋白含量測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5-2016[12])；粗脂肪含量測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.6-2016[13]；游離氨基酸測定參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.124-2013[14]，樣品不經(jīng)水解，僅取一定量樣品加入等體積5%三氯乙酸沉淀蛋白，3 000 rpm離心5 min取上清液400 μL進樣檢測，其它操作與GB標(biāo)準(zhǔn)相同；多糖含量測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.7-2016[15]。

總酚(沒食子酸當(dāng)量)含量采用Folin法測定 取一定量樣品稀釋至基本無色，記錄稀釋倍數(shù)；取稀釋后溶液0.15 mL于試管中，加入1.5 mL稀釋10倍的Folin試劑，混勻；靜置5 min后加入1.5 mL 6%(w/v)Na2CO3溶液，將試管置于75 ℃恒溫水浴箱中孵育10 min。隨后取出立即冰水浴冷卻，轉(zhuǎn)移至離心管中 5 000 rpm、4 ℃離心5 min。于725 nm波長下測定吸光值，重復(fù)測定3次。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中總酚含量。

總皂苷含量測定參考保健食品中總皂苷測定方法 吸取1 g樣品進行稀釋，取稀釋后的樣品1 mL進行層析。層析柱內(nèi)裝填3 cmAB-8大孔樹脂、1 cm中性氧化鋁、25 mL 70%乙醇淋柱，再用25 mL水洗柱，棄掉淋洗液，準(zhǔn)確加入1.0 mL樣品溶液，25 mL水淋洗柱，棄洗脫液，再用25 mL 70%乙醇洗脫總皂苷，收集該洗脫液于蒸發(fā)皿中，置于60 ℃水浴中揮干。往蒸發(fā)皿中加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，充分溶解殘渣，加入0.8 mL高氯酸，混勻后轉(zhuǎn)入試管中，60 ℃水浴10 min，取出冷卻后加入5 mL冰乙酸，混勻后560 nm比色測定。采用人參皂苷Re標(biāo)品中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中總皂苷含量。

黃酮含量測定 精確吸取1.0 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中，加1 mL 5%NaNO2溶液搖勻，放置5 min，再準(zhǔn)確加入10%Al(NO3)3溶液1 mL搖勻，放置6 min，然后加入5 mL 4%NaOH溶液，最后用30%甲醇稀釋到刻度，于溫水浴中加熱10 min，取出，同時作試劑空白，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，于510 nm波長處測定吸光度A，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣液中黃酮含量。

FRAP、DPPH、ABTS 3個指標(biāo)均按照上海碧云天公司對應(yīng)檢測試劑盒的操作方法進行測定。

1.3.2 調(diào)節(jié)血糖試驗

(1)復(fù)制四氧嘧啶性糖尿病小鼠模型 90只(30±2)g ICR雄性小鼠，稱重編號。動物禁食6 h，小鼠尾靜脈注射四氧嘧啶60 mg/kg，正常對照組注射生理鹽水，72 h后斷尾取血用葡萄糖氧化酶法測血糖，血糖值大于11.1 mmol/L的動物視為糖尿病動物。

(2)分組及給藥 將動物按體重和血糖值均衡原則分成6組，每組12只，分為正常組、模型組、發(fā)酵飲品(JS5X 20、40、80 mL/kg)、二甲雙胍(0.25 g/kg)組。正常組和模型組給予40 mL/kg溶媒，其余各組分別給予相應(yīng)受試樣品，每天灌胃給藥1次(JS5X 80 mL/kg組按40 mL/kg每天灌胃給藥2次)，共給藥4周。每周觀測體重、飲水/食量，給藥4周測口服葡萄糖耐量(OGTT)。

1.3.3 調(diào)節(jié)血脂試驗

發(fā)酵飲品對高脂血癥大鼠血清總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)的影響。

健康雄性SD大鼠96只，按體重均衡原則隨機分為6組，即正常組、模型對照組、陽性藥對照組(非諾貝特20 mg/kg)，發(fā)酵飲品(JS5X 6.25、12.5、25 mL/kg)組，每組16只。除正常組外，其余各組大鼠每天(上午9:00)灌胃一次高脂乳劑(10 mL/kg)復(fù)制高脂血癥模型。高脂乳劑配方(100 mL)：油相、豬油各20 g；膽固醇10 g；甲硫氧嘧啶 1 g，吐溫-80為7 mL；水相、蔗糖各20 g；膽酸鈉2 g；純水適量。水相加入油相中混勻，蒸餾水定容至100 mL。

正常組和模型對照組灌胃給予0.5%CMC-Na(10 mL/kg)，陽性藥對照組灌胃給予非諾貝特20 mg/kg，發(fā)酵飲品分別灌胃給予JS5X 6.25、12.5、25 mL/kg，每天(17:00)灌胃1次，共30 d。第30 d禁食12 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉動物，腹主動脈取血，分離血清，用血脂四項聯(lián)檢試劑盒測定大鼠血清CHO、TG、LDL、HDL水平。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用student’st檢驗對實驗數(shù)據(jù)進行分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃餅粕發(fā)酵所得飲品感官及理化評價

經(jīng)上述發(fā)酵工藝所得飲品色澤紅棕色，透光率90%，具有核桃三七花風(fēng)味，產(chǎn)品酸甜適中。對制備得到的發(fā)酵飲品中基本成分及功能因子含量進行檢測，其理化及功能指標(biāo)見表1。不同發(fā)酵劑復(fù)合、發(fā)酵劑種類及工藝均會影響發(fā)酵飲品的活性組分含量以及抗氧化效果，采用上述發(fā)酵劑復(fù)合、發(fā)酵劑種類及工藝所得飲品最佳，所以采用該產(chǎn)品做調(diào)節(jié)血脂試驗。

表1 發(fā)酵飲品生物活性成分及抗氧化力Tab.1 Bioactive ingredients and antioxidant power of mixed fermented beverage

2.2 發(fā)酵飲品對糖尿病小鼠血糖的影響

灌胃給予糖負(fù)荷后，模型組血糖水平顯著升高，和正常組相比，差異顯著(P<0.01)。陽性對照藥二甲雙胍給藥4周能明顯降低糖尿病動物OGTT 0、30、120 min血糖及血糖曲線下面積，和模型組相比，有顯著差異(P<0.01)。發(fā)酵飲品40 mL/kg給藥4周可以降低給糖后120 min血糖水平(和模型組相比，差異顯著，P<0.05)，發(fā)酵飲品80 mL/kg給藥4周明顯降低糖尿病動物30 min血糖及血糖曲線下面積(和模型組相比，差異顯著P<0.05)(表2)。

表2 JS5X對四氧嘧啶性糖尿病小鼠口服糖耐量的影響Tab.2 Effect of JS5X on oral glucose tolerance in alloxan induced diabetic mice

2.3 發(fā)酵飲品對高脂血癥大鼠血清CHO、TG、LDL、HDL的影響

由表3可見，與正常組相比，模型組大鼠的血清CHO、TG、LDL、HDL水平均明顯高于正常對照組(P<0.05)，提示高脂血癥模型復(fù)制成功。與模型組相比，非諾貝特組大鼠血清CHO、LDL、HDL 均明顯降低(P<0.05)。發(fā)酵飲品(JS5X 6.25、12.5、25 mL/kg)可顯著降低高脂血癥大鼠的CHO、LDL、HDL水平(與模型組相比，P<0.01)，并有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，JS酵素(25 mL/kg)可顯著升高高脂血癥大鼠的TG水平(與模型組相比，P<0.05)。

表3 發(fā)酵飲品對高脂血癥大鼠血清CHO、TG、LDL、HDL的影響Tab.3 Effects of fermented drinks on serum CHO,TG,LDL and HDL in hyperlipidemic rats

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

云南是核桃(Juglanssigillata)主產(chǎn)大省，截至2020年底，云南省核桃栽培面積達(dá)286.87×104hm2、產(chǎn)量148×104t、產(chǎn)值412×108元。核桃產(chǎn)業(yè)已成為極具云南高原特色，在全國乃至世界有影響、有競爭力的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)[16-17]。核桃榨油后餅粕殘留率高達(dá)70%，從餅粕中提取發(fā)酵原液率可達(dá)40%，以1 t發(fā)酵飲品原液現(xiàn)有市場價格5×104元/t計算，榨取1 t核桃果，可生產(chǎn)280 kg發(fā)酵原液，效益可達(dá)1.4×104元，即每噸核桃果提取發(fā)酵飲品可增加1.4×104元效益，如對全省核桃產(chǎn)量的5%進行榨油后酵素原液提取，效益可達(dá)5.95×108元[18]。

目前，云南核桃油脂加工企業(yè)主要開發(fā)核桃油系列產(chǎn)品，而將榨油后的核桃粕特別是帶殼餅粕多作為飼料或燃料，核桃粕中大量的核桃蛋白資源不能充分利用，而隨著植物蛋白資源高新技術(shù)的研究逐步深入，不斷有新的蛋白產(chǎn)品推向市場。核桃餅粕蛋白不僅用于動物飼料和作物肥料，而且研發(fā)出了多種核桃蛋白新產(chǎn)品，如核桃植脂末、速溶蛋白粉、核桃代餐粉等，另外，也有一些核桃蛋白酸乳研制成功[19]，但未進行功效驗證。通過添加不同輔料，本研究實現(xiàn)云南核桃精深加工產(chǎn)品多樣化，從而提高經(jīng)濟附加值，突破云南核桃產(chǎn)業(yè)瓶頸問題。

3.2 結(jié)論

通過測定核桃餅粕發(fā)酵飲品中生物活性成分及抗氧化活力得最佳工藝配方，即按質(zhì)量配比，核桃粕55～70 g，三七花6～8 g，飲用水400～600 g，枸杞2～3 g，紅棗2～3 g，蜂蜜3～6 g，乳桿菌發(fā)酵劑0.2～0.4 g，低聚果糖8～10 g；乳桿菌發(fā)酵劑為嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌以1︰2︰2混合的復(fù)合菌劑；核桃粕、三七花、枸杞、紅棗、水、蜂蜜和乳桿菌發(fā)酵劑混合調(diào)配，然后在25～28 ℃發(fā)酵20 d；二次調(diào)配糖度為8%～9%。所得發(fā)酵飲品(80 mL/kg)可以改善四氧嘧啶性糖尿病小鼠口服糖耐量，對空腹血糖沒有影響。所得發(fā)酵飲品具有輔助降低高脂血癥大鼠血清總膽固醇的作用。高劑量發(fā)酵飲品具有降低高脂血癥大鼠血清甘油三酯的作用。