一株咖啡滅字脊虎天牛幼蟲蟲生真菌鑒定、培養(yǎng)及致病力研究*

劉全俊，易璟，吳國星，高熹，賈奔，唐萍，何明川，石昆靄，曾舒泉，李金梁，秦小萍

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學，云南 昆明 650201；3.昆明富民進出口公司，云南 昆明 650201)

咖啡滅字脊虎天牛(XylotrechusquadripesChevrolat)又稱鉆心蟲、柴蟲，是咖啡樹(Coffeaspp.)的主要害蟲之一，廣泛分布于世界咖啡種植區(qū)。在我國，危害咖啡的天牛主要有咖啡滅字脊虎天牛、咖啡虎天牛(X.grayii)、咖啡旋皮天牛(Acaloleptacervinus)、咖啡胖天牛(Plocaederusobesus)等[1]，在云南以咖啡滅字脊虎天牛危害最為嚴重。該蟲主要危害3 a生以上咖啡樹，被害后枝葉枯萎，樹枝極易從被害處折斷，并造成整株死亡，給咖啡生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟損失[2]。人工清除蟲傷枝[3-4]、種植蔭蔽樹[5-6]、利用性信息素誘捕成蟲[7-8]等是咖啡滅字脊虎天牛防控的主要手段，但咖啡受害范圍廣及施藥時勞動力成本高兩種因素限制，對其防控效果并不明顯。化學農(nóng)藥主要對卵和剛孵化的幼蟲有效果，但對正在產(chǎn)卵的雌成蟲和在樹干內(nèi)為害的幼蟲及蛹基本上無效或效果較差[2,4]，并且農(nóng)藥的不規(guī)范使用，易導致抗藥性以及造成環(huán)境污染等問題[9-10]。生物防治是一種經(jīng)濟、安全、環(huán)保的防治方法。有研究報道，多種寄生蜂對咖啡滅字脊虎天牛有控制作用[11-15]，一些鳥類[4]和昆蟲[16]會捕食咖啡滅字脊虎天牛，但由于其蛀干隱蔽危害的特性，防治效果也不理想。因此，亟需尋求對咖啡滅字脊虎天牛有效、對環(huán)境友好的防治方法。真菌殺蟲劑具有不污染環(huán)境、并能有效地在林間宿存和流行的特點，所以利用真菌防治咖啡滅字脊虎天牛具有較好的應用前景。

蟲生真菌(entomogenous fungi)具有廣譜性、物種多樣性、易于大規(guī)模生產(chǎn)、不易產(chǎn)生抗性以及對人類和其他非目標生物相對安全等優(yōu)點[17]，在生物防治領域有著舉足輕重的作用。同時獨特的傳播方式促使其在害蟲防治中具有優(yōu)良的應用前景。目前，全球已報道的蟲生真菌多達100多個屬，1 000多個種，在我國已報道的約 400多種，其中寄生昆蟲的真菌215種[18]，研究較為深入的種類主要有白僵菌(Beauveriabassiana)、綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)、蠟蚧輪枝菌(Verticilliumlecanii)、玫煙色蟲草(Cordycepsfumosoroseus)、座殼孢(Aschersoniamontagne)等[19-20]。隨著對蟲生真菌的深入研究，其篩選、量產(chǎn)培養(yǎng)及制劑制備等技術都有了很好地發(fā)展。

盡管已報道的蟲生真菌及其制劑有很多，但對咖啡滅字脊虎天牛有防效的蟲生真菌鮮有報道，長久以來人們一直致力于尋找對咖啡滅字脊虎天牛有效的蟲生真菌。本文從野外自然感病死亡的咖啡滅字脊虎天牛幼蟲僵蟲上分離到1株對咖啡滅字脊虎天牛幼蟲具有高致病力的菌株，并初步研究該菌株的分類歸屬、生物學特性以及致病性。以期在豐富現(xiàn)有昆蟲病原真菌資源庫的同時，也為該蟲生真菌在后期咖啡滅字脊虎天牛幼蟲的防控應用中奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試試蟲

從云南省普洱市思茅區(qū)南島河(22°32′50″N，100°45′06″E，海拔約1001 m)咖啡(Coffea)種植園，將受害植株枝干帶回，解剖受害枝干，取出咖啡滅字脊虎天牛幼蟲，以咖啡木屑為飼料，飼養(yǎng)在26 ℃，相對濕度為80%的無光照培養(yǎng)箱。多次采集受害咖啡樹干，每次解剖被害木段共收集咖啡滅字脊虎天牛幼蟲約200頭。

1.2 供試菌株

于2020年10月，在云南省普洱市思茅區(qū)南島河咖啡種植地，收集到自然感染死亡的咖啡天牛幼蟲僵蟲蟲體，將其帶回實驗室，分離、純化出1株對咖啡滅字脊虎天牛幼蟲有較好活性的蟲生真菌，編號Bd01，分離頻率50%?，F(xiàn)保存于中國科學院微生物研究所，保藏號CGMCC No.23078。

1.3 供試培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基及其營養(yǎng)成分見表1。

表1 不同供試培養(yǎng)基及其營養(yǎng)成分Tab.1 Different test media and their nutrient composition

1.4 試驗儀器

電熱式壓力蒸汽滅菌器(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)、無菌操作臺、培養(yǎng)箱、PCR儀(Biometra GmbH ，Germany)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司)等。

1.5 Bd01菌株對咖啡滅字脊虎天牛幼蟲的毒力測試

在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后的Bd01菌株，用0.1%吐溫-80溶液將其配成5種濃度分別為1×104、1×105、1×106、1×107和1×108孢子/mL的孢子懸浮液，分別選取20頭健康、大小一致的供試咖啡滅字脊虎天牛的幼蟲，浸入以上濃度梯度的孢子懸浮液中30 s后，接入指形管(1.2 cm×5 cm)，以脫脂棉封口，置于26 ℃，濕度(RH)為80%的無光照培養(yǎng)箱，0.1%吐溫-80溶液為對照，逐日定時(2021年6月3—12日)記錄幼蟲死亡情況。

1.6 Bd01菌株形態(tài)觀察

參照祝文博等[21]方法并加以修改，將菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，每天觀察1次菌落背面和正面顏色、質(zhì)地、邊緣等并拍照，待菌株培養(yǎng)至產(chǎn)孢成熟后，在光學顯微鏡下觀察分生孢子梗、孢子的形態(tài)特征并拍照。

1.7 Bd01菌株分子鑒定

參照Biospin真菌基因組試劑盒方法提取DNA，以ITS1和ITS4為引物，將獲取的DNA先進行PCR擴增，再將擴增后的產(chǎn)物進行凝膠電泳，并在紫外光下觀察目的條帶長度。最后委托北京擎科生物公司對PCR擴增產(chǎn)物進行雙向測序，所得序列在NCBI上進行BLAST對比分析。

1.8 環(huán)境條件對Bd01菌株營養(yǎng)生長及致病力的影響

1.8.1 不同培養(yǎng)基對Bd01菌株營養(yǎng)生長和產(chǎn)孢的影響

供試培養(yǎng)基選用PDA、PPDA、SDAY、SMAY、Czapek，首先將PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d的成熟孢子接種在各供試培養(yǎng)基的中心，于26 ℃，RH=80%的無光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d定時(2021年6月28日—2021年7月7日)測量菌落直徑，共觀測10 d。培養(yǎng)14 d后測定產(chǎn)孢量。用直徑為5 mm的打孔器取菌落(距離培養(yǎng)皿中心相同位置)3塊于2 mL含0.1%吐溫-80的無菌水中，充分振蕩，用血球計數(shù)板測定孢子數(shù)，計算產(chǎn)孢量，每個處理取3皿，共9塊，以選出最適生長培養(yǎng)基。

1.8.2 溫度對Bd01菌株營養(yǎng)生長和致病力的影響

不同溫度下菌株營養(yǎng)生長 參照丁俊男[22]實驗方法略作修改，接菌方法同1.8.1，將菌株接種于最適生長培養(yǎng)基上，分別培養(yǎng)在20、24、26、28 和30 ℃，RH=80%的無光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d，每2 d測定菌落直徑并記錄，每個處理3次重復。

不同溫度下菌株致病力 選取20頭形態(tài)大小一致健康的咖啡滅字脊虎天牛幼蟲，浸入濃度為1×108個孢子/mL的孢子懸浮液中30 s后，接入指形管(1.2 cm×5 cm)，每個處理3次重復。分別放入以上溫度、濕度的培養(yǎng)箱，逐日定時觀察記載幼蟲死亡情況，統(tǒng)計死亡率，感染率及LT50。

1.8.3 相對濕度對Bd01菌株營養(yǎng)生長和致病力的影響

不同相對濕度下菌株營養(yǎng)生長 實驗參照王寶輝[23]方法并略作修改。接種方法同1.8.1。將菌株接種于最適生長培養(yǎng)基上，分別置于相對濕度為100%、85%、75%和65%，溫度為26 ℃的無光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)l0 d，每2 d測量菌落直徑并記錄，每個處理3次重復。

不同相對濕度下菌株致病力 處理方法同1.8.2。分別放入以上濕度、溫度的培養(yǎng)箱，逐日定時觀察記載幼蟲死亡情況，統(tǒng)計死亡率，感染率及LT50。

1.8.4 紫外光照對Bd01菌株營養(yǎng)生長及致病力的影響

不同紫外光照時長下菌株的營養(yǎng)生長 參照盧振起等[24]的方法并略作修改，菌株接種方法同1.8.1。菌株接種于最適生長培養(yǎng)基上。在超凈工作臺內(nèi)距30 W紫外線燈管20 cm處，分別照射5、10、15、30、60 min以正常培養(yǎng)為對照，放入培養(yǎng)箱中(26 ℃，相對濕度為80%，無光照)培養(yǎng)10 d，每2 d測量菌落直徑并記錄，每個處理3次重復。

不同紫外光照射時長下菌株的致病力 參照王興民等[25]方法略作修改，配置濃度為1×108孢子/mL的孢子懸浮液，取5份相同含量的孢子懸浮液，放在超凈工作臺內(nèi)距30 W紫外線燈20 cm下，分別照射5、10、15、30、60 min。處理方法同1.8.2，孢子懸浮液未經(jīng)紫外光照射處理組為對照。置于26 ℃，相對濕度為80%的無光照培養(yǎng)箱，逐日定時觀察記載幼蟲死亡情況，統(tǒng)計死亡率，感染率及LT50。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

菌落直徑(cm)=(菌落橫徑+菌落縱徑)/2

采用Excel 進行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，采用Duncan新復極差法進行差異顯著性分析，采用Probit概率分析法計算LC50和LT50值。

2 結果與分析

2.1 Bd01菌株毒力測試

Bd01菌株對咖啡滅字脊虎天牛幼蟲毒力如表2所示?？Х葴缱旨够⑻炫Ｓ紫x接菌10 d后，不同濃度孢子懸浮液對咖啡滅字脊虎天牛幼蟲致死率差異顯著，當濃度為1×104孢子/mL時，校正死亡率為17.28%；當濃度為1×108孢子/mL時，校正死亡率達94.91%。通過劑量回歸方程算出Bd01菌株的LC50為4.56×105孢子/mL。

表2 Bd01菌株對咖啡滅字脊虎天牛幼蟲的LC50Tab.2 The LC50 of Bd01 strain against the larvae of Xylotrechus quadripes Chevr

2.2 形態(tài)觀察

菌株Bd01在PDA培養(yǎng)基上菌絲質(zhì)地絨狀，呈放射性生長，培養(yǎng)早期為白色，背面為米白色，成熟菌落為棕色。分生孢子梗長短不一，大約7.5～13.5 μm×1.5～2.5 μm，產(chǎn)孢細胞基部膨大，產(chǎn)孢端細，孢子橢圓形或圓形，大約1.5～2.0 μm×3.0～3.5 μm。

圖1 菌株Bd01在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)注：A.培養(yǎng)5 d后菌株上表面，B.培養(yǎng)14 d后菌株上表面， C.菌株Bd01的分生孢子，D.菌株Bd01的分生孢子梗Fig.1 The morphology of strain Bd01 on PDA medium

2.3 分子鑒定

將Bd01菌株校對后的序列(登錄號MZ831846)提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行比對，分析結果表明Bd01菌株與Cordycepsjavanica(登錄號NR 111172.1)的相似性達100%，下載同源性高的序列，構建進化樹。如圖2所示，Bd01菌株與Cordycepsjavanica相聚一支，可以確認Bd01菌株為爪哇蟲草(Cordycepsjavanica)。

圖2 菌株Bd01的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain Bd01

2.4 不同環(huán)境條件對Bd01菌株營養(yǎng)生長和致病力的影響

2.4.1 不同培養(yǎng)基對Bd01生長和產(chǎn)孢量的影響

不同培養(yǎng)基對菌株Bd01菌落生長如圖3所示，培養(yǎng)初期 Czapek菌落直徑顯著小于其他4種培養(yǎng)基，第8 d后PPDA培養(yǎng)基的直徑迅速生長，培養(yǎng)10 d后，菌落直徑最大為5.23 cm，顯著大于其他培養(yǎng)基生長情況。

如圖4所示，5種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后，Czapek培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最大為8.02×107孢子/mL，其次是PPDA培養(yǎng)基產(chǎn)孢量為7.73×107孢子/mL，兩種培養(yǎng)基產(chǎn)孢量無顯著差異，從培養(yǎng)結果來看，PPDA培養(yǎng)的菌株菌落緊密、厚實，具有良好的營養(yǎng)條件，產(chǎn)孢量較大，所以認為PPDA培養(yǎng)基最適合Bd01菌株的生長。

圖3 不同培養(yǎng)基對Bd01菌株菌落生長的影響注：圖中同一時間段不同小寫字母表0.05水平顯著差異，下同。Fig.3 The effect of different media on the growth of Bd01 strain colony

圖4 不同培養(yǎng)基對Bd01菌株產(chǎn)孢的影響Fig.4 The effect of different media on the sporulation of Bd01 strain

2.4.2 溫度條件對菌株營養(yǎng)生長和致病力的影響

如圖5所示，Bd01菌株在20～30 ℃條件下均能生長，但生長情況各不相同，其中26 ℃條件下最適宜生長，10 d后菌落直徑達5.47 cm，顯著高于其他溫度條件下的菌落直徑；20 ℃條件下不利于菌株的生長，培養(yǎng)10 d后，菌落生長直徑為3.23 cm。

圖5 溫度對Bd01菌株菌落生長的影響Fig.5 The effect of temperature on colony growth

如表3所示，溫度對Bd01菌株的致病力有明顯影響，不同溫度條件下菌株對幼蟲的校正死亡率和感染率各不相同。接菌10 d后，26 ℃和28 ℃條件下的校正死亡率分別為100%和98.33%，感染率分別為96.67%和93.33%，顯著高于另外3個溫度下的致死率。26 ℃條件下LT50為5.175 d，28 ℃條件下LT50為5.496 d。從實驗結果可得，溫度26～28 ℃ 時Bd01菌株對咖啡滅字脊虎天牛幼蟲致病力最強。

表3 溫度對Bd01菌株致病力的影響(10 d)Tab.3 The influence of temperature on the pathogenicity of Bd01 strain(10 d)

2.4.3 相對濕度條件對菌株營養(yǎng)生長和致病力的影響

由圖6可知，培養(yǎng)初期不同的相對濕度條件下菌落生長直徑無明顯差異，隨著時間延長，菌落直徑呈現(xiàn)逐漸增長趨勢。培養(yǎng)10 d后，相對濕度為100%條件下菌落生長最快，菌落直徑達到5.2 cm，其次是相對濕度為85%時，菌落直徑達到4.9 cm。在相對濕度為100%和85%條件下，菌落生長直徑顯著大于其余2個相對濕度條件下菌落生長。由此可見，相對濕度85%～100%更有利于Bd01菌株的生長。

圖6 相對濕度對菌落生長的影響Fig.6 The influence of relative humidity on colony growth

由表4所示，菌株Bd01對咖啡滅字脊虎天牛幼蟲致病力隨濕度升高而增強，幼蟲接菌10 d后，在相對濕度為100%時致病力最強，校正死亡率為100%，感染率為98.33%，LT50為4.697 d。相對濕度為85%時的致病力僅次于100%處理，校正死亡率為98.25%，感染率為93.33%，LT50為4.998 d。由此可知，相對濕度在85%～100%，Bd01菌株對咖啡滅字脊虎天牛幼蟲致病力最強。

2.4.4 不同紫外光照時長對菌株營養(yǎng)生長和致病力的影響

由圖7可知，紫外光照射不同時長條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落直徑呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢，且隨著紫外光照射時間的延長，會對菌株生長產(chǎn)生影響。培養(yǎng)10 d后，紫外光照射30 min和60 min后的菌落生長直徑分別為4.3 cm和4.0 cm，顯著小于對照菌落直徑，紫外光照射5 、10、15 min后菌落生長直徑與對照無差異。因此，Bd01菌株在實驗室范圍內(nèi)紫外光照射30 min后其營養(yǎng)生長會受到一定程度的影響。

表4 相對濕度對Bd01菌株致病力的影響(10 d)Tab.4 The influence of relative humidity on the pathogenicity of Bd01 strain(10 d)

圖7 紫外光照對菌落生長的影響Fig.7 The effect of ultraviolet light on the growth of colonies

由表5可知，紫外光照射Bd01菌株不同時長后對咖啡滅字脊虎天牛幼蟲均有不同程度的致病力。接種10 d后，紫外光照射60 min后校正死亡率為87.89%，顯著低于對照組校正死亡率；紫外光照射30 min和60 min后的感染率分別為85%和81.67%，顯著低于對照組感染率，紫外光照射60 min后，LT50為6.351 d?？梢?，在實驗室范圍內(nèi)Bd01菌株被紫外光照射60 min后對咖啡滅字脊虎天牛幼蟲的致病力減弱。

表5 紫外光照對Bd01菌株致病力的影響(10 d)Tab.5 The effect of ultraviolet light on the pathogenicity of Bd01 strain(10 d)

3 討論與結論

昆蟲病原真菌在害蟲防治方面受到越來越多地關注，但用于蛀干類害蟲防治的生防菌株研究較少。本研究以咖啡滅字脊虎天牛幼蟲的僵蟲蟲體上分離篩選獲得的蟲生真菌Bd01為供試菌，生測發(fā)現(xiàn)該菌株對咖啡滅字脊虎天牛幼蟲的LC50為4.56×105孢子/mL。通過形態(tài)觀察和ITS測序分析，初步確定Bd01菌株為爪哇蟲草(Cordycepsjavanica)。目前，國內(nèi)外對爪哇蟲草的報道較少，在2008年日本學者從舞毒蛾(Lymantriadispar)幼蟲蟲體上分離到爪哇蟲草菌株，測試發(fā)現(xiàn)該菌株對舞毒蛾表現(xiàn)出中等毒力[26]，Hussain等[27]采用噴霧技術測試爪哇蟲草對柑橘木虱(DiaphorinacitriKuwayama)的致病性，結果表明在107孢子/mL濃度的真菌處理下， 7 d后其幼蟲死亡率達100%。Wu等[28]研究表明爪哇蟲草防治甘薯(IpomoeabatatasL.)煙粉虱(BemisiatabaciGennadius)具有較好潛力。國內(nèi)對爪哇蟲草主要運用于防治茶小綠葉蟬(EmpoascapirisugaMatumura)、煙粉虱、柑橘木虱，并已開發(fā)出相應制劑產(chǎn)品[29-32]，但在蛀干害蟲防治、培養(yǎng)特性等方面鮮見報道。

培養(yǎng)條件對菌株的生長、產(chǎn)孢量和毒力有較大影響，是篩選優(yōu)良菌株的重要指標[33-34]。生防菌株在生產(chǎn)應用前，系統(tǒng)掌握其生物特性具有重要意義[35]。本研究發(fā)現(xiàn)爪哇蟲草Bd01在PPDA培養(yǎng)基上生長最好，產(chǎn)孢量僅次于Czapek培養(yǎng)基，說明在培養(yǎng)基中加入適量的無機鹽更有利于該菌株產(chǎn)孢，這與李會平等[36]研究結果一致。溫度對蟲生真菌的營養(yǎng)生長和致病力表現(xiàn)各不相同[37-38]。徐艷聆等[39]研究顯示14～32 ℃條件下白僵菌(Beauveriaspp.)均能生長，并在26 ℃下生長最快。本研究發(fā)現(xiàn)爪哇蟲草Bd01菌株20～30 ℃條件下均能生長，在26 ℃條件，生長最快，致病力最強。相對濕度是直接影響菌株生長的重要因素之一，本文中爪哇蟲草Bd01的生長隨相對濕度的升高而加快，相對濕度85%～100%菌絲長勢最好，致病力也最強。國志峰等[40]測試球孢白僵菌(Beauveriabassiana)BB11生物特性發(fā)現(xiàn)，當相對濕度低于55%時，菌絲基本不生長或生長很慢，隨著濕度的升高菌絲的生長逐漸加快。紫外線能抑制分生孢子的形成，是影響菌株致病力的因素之一[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，紫外光照射30 min后能明顯抑制菌株的生長，照射60 min后能顯著降低該菌株的致病力。Wu等[41]研究發(fā)現(xiàn)Cordycepsjavanica(wf GA17)在強紫外線照射下，其活力和毒力都隨著暴露時間的增加而降低，與本研究結果一致。應盛華等[42]研究表明，球孢白僵菌在生產(chǎn)實踐中加入抗壞血酸等化學保護劑可以起到防止紫外線侵害的作用。但爪哇蟲草Bd01加入化學保護劑后能否防止紫外線侵害尚待進一步研究。

爪哇蟲草Bd01菌株在防治咖啡滅字脊虎天牛方面有較大的潛力，本研究結果為爪哇蟲草Bd01的社會生產(chǎn)實踐提出更多參考依據(jù)，并豐富其生防菌資源庫。本文僅研究了爪哇蟲草Bd01菌株的生物學特性及其對咖啡滅字脊虎天牛幼蟲的室內(nèi)防效，對咖啡滅字脊虎天牛成蟲的致病性及田間應用等方面尚未涉及。在下一步研究中，應加強該菌對咖啡滅字脊虎天牛成蟲致病性、致病機理、田間應用、制劑等方面的探究。