不同供磷水平對紫花苜蓿根際微生物功能多樣性的影響

邢鏻木， 李 強， 高原千惠， 李 寧

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/新疆土壤與植物生態(tài)過程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是我國常見的多年生豆科植物，有著“飼草之王”的美稱，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是中國精細(xì)飼草行業(yè)的重要資源［1］。2018年以來，國產(chǎn)苜蓿價格不斷降低，種植面積逐漸縮小［2］。發(fā)展苜蓿產(chǎn)業(yè)成為提高牧草綜合效益的當(dāng)務(wù)之急，但由于苜蓿產(chǎn)業(yè)諸多限制因素，導(dǎo)致我國苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢［3］。研究表明，抑制紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一，是我國大部分耕地缺乏能被植物有效吸收和利用的磷，因此有效且合理地添加外源磷素提高紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)，成為眾多研究者的重要關(guān)注點［4］。王園園等［5-6］研究發(fā)現(xiàn)，施用磷肥是提高土壤養(yǎng)分，促進(jìn)作物生長的重要手段，而且紫花苜蓿生長過程中需要大量磷素，磷是提高苜蓿產(chǎn)量的必需元素。張杰［7］研究表明，單施磷肥對紫花苜蓿干草總產(chǎn)量增產(chǎn)效果顯著（P＜0.05）。雖然，磷素在苜蓿中僅占0.2%～0.4%，但它是苜蓿生理代謝過程中的重要參與者，并直接影響苜蓿植物體的細(xì)胞核形成、細(xì)胞分裂和遺傳物質(zhì)合成等關(guān)鍵生化過程［8］。紫花苜蓿是如何吸收利用土壤中的磷素，Wang 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，蒺藜苜蓿SPX1、SPX3 蛋白參與調(diào)控植物磷穩(wěn)態(tài)，具體表現(xiàn)為在低磷條件下增強磷饑餓反應(yīng)，而在高磷條件下抑制這種反應(yīng)。在土壤缺磷條件下，可以促使苜蓿根系分泌分解低磷土壤中磷酸鐵中磷的物質(zhì)，提供磷元素供植物吸收利用。而根系酸性分泌物直接影響植物對低磷土壤的抗逆性［10］。

根際微生物能直接參與和影響植物的生理過程，而且可以作為土壤肥力營養(yǎng)豐缺的指標(biāo)之一［11-12］。根際微生物群落的代謝活性與生物功能多樣性指數(shù)是2 個直接表征微生物群落活性變化、解釋微生物生態(tài)系統(tǒng)特性和環(huán)境狀況的重要依據(jù)［13-14］。在自然環(huán)境下，科學(xué)施肥也可以有效調(diào)控土壤微生物對碳源的循環(huán)吸收再利用，顯著增加土壤微生物群落的生長代謝活動和功能多樣性［15］。徐接亮等［16］研究表明，油莎豆根際土壤細(xì)菌和真菌多樣性隨著施肥量的增加顯著降低；Song 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，添加外源磷肥有可能會抑制沼澤土壤中氧含量，原因可能是磷肥導(dǎo)致微生物活性降低；單佩佩［18］研究發(fā)現(xiàn)，磷肥可以顯著提高牡丹根際土壤中微生物的數(shù)量；施磷會影響土壤微生物繁衍和功能，但是對缺磷環(huán)境下土壤磷與微生物種群之間的關(guān)系缺乏清晰的認(rèn)識［19］；Cory 等［20］認(rèn)為，磷肥對微生物群落的影響是增強了呼吸系統(tǒng)對碳源的響應(yīng)。長期磷鉀配施顯著增強了根際微生物的代謝活性以及功能多樣性及優(yōu)勢度指數(shù)［21］。因此，研究磷肥對苜蓿根際微生物影響，對改善土壤肥力和根際土壤微生物代謝活性，促進(jìn)苜蓿根系養(yǎng)分吸收，提高苜蓿產(chǎn)量具有實際意義。基于此，本研究以不同供磷水平作為試驗變量，利用Biolog技術(shù)，對紫花苜蓿根際微生物功能多樣性進(jìn)行分析，闡明不同供磷水平對紫花苜蓿根際微生物代謝功能多樣性的影響，為提高苜蓿養(yǎng)分利用率和產(chǎn)量提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為“新牧一號”紫花苜蓿，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)三坪實習(xí)農(nóng)場牧草種子繁育基地提供。供試肥料為磷酸一銨（含P2O561%、含N 12%）、尿素（含N 46%）、硫酸鉀（含K2O 40%）。

1.2 試驗區(qū)概況

試驗在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)三坪實習(xí)農(nóng)場牧草與草坪試驗站進(jìn)行，位于天山北麓，準(zhǔn)噶爾盆地南緣，地理位置為43°56′N，87°35′E，海拔580 m，屬于中溫帶大陸性氣候，年均降水量228.8 mm，干旱少雨，全年平均最高氣溫25.7 ℃，最低氣溫-15.2 ℃，晝夜溫差較大。試驗區(qū)為典型的山前沖積平原，原生境為礫質(zhì)荒漠，后開墾為農(nóng)田。

試驗地耕層（0～20 cm）土壤基本理化性質(zhì)：速效磷15.64 mg·kg-1，堿解氮22.39 mg·kg-1，速效鉀250.34 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)14.64 g·kg-1，pH為8.1。

1.3 試驗設(shè)計

采用單因素（不同供磷水平）五水平完全隨機(jī)區(qū)組試驗，5 個磷肥梯度分別為：0 kg·hm-2（P0）、75 kg·hm-2（P1）、150 kg·hm-2（P2）、300 kg·hm-2（P3）、450 kg·hm-2（P4），參考陳波浪等［22］磷肥梯度設(shè)計，5處理3 重復(fù)共15 個小區(qū)，小區(qū)面積為27 m2(4.5 m×6 m)，小區(qū)之間間隔為0.5 m。各小區(qū)采取完全隨機(jī)區(qū)組排列。

2021 年5 月3 日播種，選取顆粒飽滿顏色純正的種子進(jìn)行播種，播種量為3 kg·hm-2，行距為20 cm，試驗小區(qū)灌溉采用滴灌方式進(jìn)行，水源為地下井水。每個小區(qū)施肥量按照120 kg·hm-2尿素+60 kg·hm-2硫酸鉀+磷肥施用，其中磷肥和鉀肥作為底肥施用，氮肥作為追肥。各小區(qū)除磷肥水平不同外，澆水、除草、間苗均采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 土壤采集與處理

在紫花苜蓿盛花期(7 月25 日)使用五點取樣法取樣，挖出植株后，去除植株根部區(qū)域0～2 cm 外圍土，取緊貼于植株根表土樣。將收集土樣裝入無菌自封袋，做好標(biāo)記，立即帶回實驗室，研磨后過1 mm篩，-80 ℃冰箱保存。

1.5 根際微生物代謝特性測定

應(yīng)用Biolog-eco 微平板法對根際微生物代謝特征進(jìn)行分析，根際土壤樣品準(zhǔn)備與測定方法參考崔佩佩等的［21,23-24］方法，Biolog-eco 生態(tài)板使用美國Biolog 公司的ECO MicroPlate，使用多功能酶標(biāo)儀在590 nm讀數(shù)。

平均顏色變化率（AWCD）被研究者用來描述微生物群落代謝活性強度，計算公式如下：

式中：Ci為所測定的31 個碳源孔的吸光值；R為對照孔的吸光值；Ci-R＜0的數(shù)值全部記為0。

微生物代謝功能多樣性綜合指數(shù)包括：Shannon-Wiener 指數(shù)、Richness 指數(shù)、Pielou 指數(shù)、Simpson指數(shù)。

Shannon-Wiener 指數(shù)（H）是研究物種種群分布程度時應(yīng)用最廣泛的指標(biāo)，值越大代表微生物群落功能多樣性越高，計算公式為：

式中：Pi為第i孔吸光值(Ci)與對照孔吸光值(R)之差與整個平板吸光值總和的比值，即Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)。

Richness 指數(shù)（S）是指微平板中被利用碳源的總數(shù)，即微平板中每孔(Ci-R)＞0.25的孔數(shù)。

Pielou 指數(shù)（E）是指微生物利用微平板中所有碳源的水平，值越大微生物對碳源利用率越高，計算公式為：

Simpson 指數(shù)（Ds）對富集種群敏感，是對微生物群落多樣性方面的集中評估，值越大微生物群落多樣性越高，計算公式為：

以上計算方法參考張鵬等［25-27］的方法。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用WPS Excel 對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理匯總，用SPSS 25.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA 單因素方差分析和PCA 分析，對各組測定數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著水平的多重比較，用Origin 2018進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿根際微生物代謝活性及功能多樣性分析

根據(jù)平均顏色變化率（AWCD 值）計算公式，計算不同供磷水平下紫花苜蓿根際微生物在不同培養(yǎng)時間段的AWCD值（圖1），隨著培養(yǎng)時間的增加，微平板中微生物代謝活性逐漸增強，符合微生物生長變化規(guī)律。在培養(yǎng)周期內(nèi)，AWCD 值呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，在培養(yǎng)前48 h，微生物增長速率緩慢，沒有完全適應(yīng)Biolog-eco生態(tài)板中碳源環(huán)境，AWCD值增長曲線平緩。通過計算，在培養(yǎng)72 h，各磷肥處理的AWCD 值曲線斜率最大，微生物進(jìn)入指數(shù)增長期，微生物活性最高。在培養(yǎng)120 h后，微生物對碳源的利用率曲線逐漸趨于平緩。選取微生物增長最快的48～72 h 時間段，對微生物碳源利用多樣性指數(shù)進(jìn)行分析。

圖1 不同磷肥水平處理對根際土壤微生物活性的影響Fig.1 Effect of different phosphorus fertilizer level treatments on rhizosphere soil microbial activity

根據(jù)Biolog-eco 微平板連續(xù)培養(yǎng)72 h 各碳源孔的光密度值（用來表示對碳源利用程度），計算72 h的根際微生物代謝功能多樣性指數(shù)，不同供磷水平下苜蓿根際微生物群落多樣性指數(shù)變化規(guī)律不同（表1），Richness指數(shù)在P3磷肥水平時達(dá)到最大值，P3 與P1 磷肥水平對比有顯著性差異（P＜0.05）；Simpson指數(shù)在P3磷肥水平時達(dá)到最大值，P3與P4磷肥水平對比有顯著性差異（P＜0.05）；Pielou 指數(shù)在P1磷肥水平時達(dá)到最大值，比P0、P2、P3和P4分別提高20%、14.6%、18.3%和12.5%；Shannon-Wiener指數(shù)在各處理間無明顯差異。

表1 紫花苜蓿根際微生物群落72 h多樣性指數(shù)Tab.1 72 h diversity index of Medicago sativa rhizosphere microbial community

2.2 紫花苜蓿根際微生物利用碳源能力的分析

如圖2所示，在培養(yǎng)72 h不同供磷水平下，紫花苜蓿根際微生物對多聚物類碳源的有效利用P3 與P4 之間有顯著性差異（P＜0.05）；與P0、P1、P2 和P4相比，氨基酸類碳源的利用率在P3 時分別增加了27.9%、30.8%、55.0%和69.6%；微生物對酚酸類碳源在P0 時利用率最高，利用程度由高到低排列為：P0＞P3＞P2＞P4＞P1；不同磷肥處理下微生物對胺類碳源的利用率沒有顯著性差異（P＜0.05），不同磷肥處理下微生物對羧酸類碳源的利用表現(xiàn)為P3、P4處理間有顯著性差異（P＜0.05）；對碳水化合物類碳源利用有顯著性差異（P＜0.05），利用程度由高到低排列為：P3＞P0＞P2＞P1＞P4。

圖2 不同磷肥水平紫花苜蓿根際微生物對6類碳源利用程度Fig.2 Utilization of six carbon sources by M.sativa rhizosphere microorganisms at different P fertilizer levels

2.3 紫花苜蓿根際微生物利用碳源能力的主成分分析

根據(jù)主成分分析的原理，從不同磷肥處理的31個碳源中提取了特征值＞1 的9 個主要成分（表2），這9 個主要成分累計貢獻(xiàn)率為91.15%。其中，累計貢獻(xiàn)率最大的主成分為第一主成分，貢獻(xiàn)率達(dá)27.05%，第二主成分次之，其累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到18.00%，前2 個主成分基本可以解釋大部分的變異來源，第三到第九主成分貢獻(xiàn)率較小。可見，各供磷水平下，微生物對碳源的利用程度不同，主要的變異來源為前2 個主成分。所以，本研究利用前2個主成分來解釋紫花苜蓿根際微生物群落利用碳源功能的差異性。由表3 可知，第一主成分PC1 載荷因子在0.5 以上的有16 種基質(zhì)碳源，其中載荷因子在0.6以上的有10種基質(zhì)碳源，羧酸類1種，多聚物類2種，碳水化合物類3種，氨基酸類4種，其中α-環(huán)式糊精載荷因子最大，為0.807；第二主成分PC2的載荷因子在0.5 以上的有8 種，其中羧酸類2 種，多聚物類1種，氨基酸類2種，碳水化合物類2種，胺類1 種，其中肝糖載荷因子最大，為0.765。不同供磷水平下微生物對碳源利用特性的PCA圖譜如圖3所示，在PC1軸上，P0、P1、P2在正負(fù)方向均有分布，得分主體主要分布在負(fù)方向，P3主要分布在坐標(biāo)軸的正方向，得分區(qū)主要在2.72～7.66 之間；P4 分布在坐標(biāo)軸的負(fù)方向，得分區(qū)在-1.65～-4.11 之間。在PC2 軸上，P2、P4 均分布在負(fù)方向，得分區(qū)間分別是-0.96～-2.6、-0.29～-2.41；P0、P1、P3 在正負(fù)方向均有分布，得分主體主要在正方向。從分布象限來看，P4、P2主要分布在第三象限，P0主要分布在第二象限，P1 分布在第一、第二象限，P3 分布在第一、第四象限。以上結(jié)論表明，磷肥水平的高低，能顯著影響微生物對碳源的利用率。

圖3 不同供磷水平根際微生物碳源利用特征PCA圖譜Fig.3 PCA mapping of carbon utilization characteristics of rhizosphere microorganisms at different levels of phosphorus supply

表2 主成分初始特征值及累計貢獻(xiàn)率Tab.2 Initial eigenvalues and cumulative contribution of principal components

表3 主成分分析下PC1、PC2與分類碳源的相關(guān)系數(shù)Tab.3 Correlation coefficients of PC1,PC2 and categorical carbon sources under principal component analysis

3 討論

本研究通過大田試驗的方法，設(shè)置5 個磷肥梯度，研究了紫花苜蓿根際微生物的功能多樣性，結(jié)果表明：Biolog微生態(tài)板的AWCD值在168 h的培養(yǎng)期間，各個磷肥水平的生長曲線與常規(guī)微生物的生長曲線基本一致。AWCD 值解釋了同一種碳源環(huán)境中不同種群微生物對碳源利用能力相互影響的關(guān)系［28］。AWCD 值與微生物群落密度和微生物活性呈正相關(guān)關(guān)系［29］。有研究指出，外源磷的添加對微生物群落的代謝活動有催化作用，微生物在缺磷環(huán)境中，代謝活性會顯著降低［30］，與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明，在P3供磷水平下的AWCD值顯著高于其他磷肥處理的AWCD值，說明在高磷環(huán)境中，會有效提高紫花苜蓿根際微生物對碳源的利用率，而P4處理各時間段AWCD值均小于P3處理，說明磷肥濃度達(dá)到一定值時，對根際微生物群落代謝活性有抑制作用，研究者還發(fā)現(xiàn)，植物在受到不同脅迫時，體內(nèi)會合成專一的應(yīng)對外在脅迫的分泌物，經(jīng)過生理生化過程，來調(diào)節(jié)自身的養(yǎng)分均衡［31］。根際微生物代謝活動與植物根際分泌物有密不可分的聯(lián)系，當(dāng)磷肥濃度不同時，植物會分泌不同化學(xué)物質(zhì)來響應(yīng)土壤環(huán)境的變化，從而影響根際微生物的代謝活動。

微生物群落之間代謝功能多樣性的差異可以用微生物群落多樣性指數(shù)來進(jìn)行描述。武俊男［24］和Tang等［32］研究表明，土壤中營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化可以調(diào)節(jié)土壤微生物群落的組成，磷肥可以有效提高靶向細(xì)菌群落的豐富度。羅漢東［33］研究表明，隨著磷肥水平的增加，在油茶林地中土壤的微生物群落均呈先增大后減少的趨勢，施磷量為每年每株900 g時，微生物數(shù)量達(dá)到最大值；施磷量超過900 g時，微生物總量降低。廖朝選等［34］研究表明，施磷肥可以增加大豆微生物數(shù)量，0～20 cm 土層黔豆10號細(xì)菌、放線菌、真菌數(shù)量分別增加37.28%、44.34%和56.97%。在本研究中，對不同磷肥濃度下微生物群落的代謝功能多樣性試驗結(jié)果表明：Simpson 指數(shù)在P3磷肥水平時達(dá)到最大值，Richness指數(shù)在P3磷肥水平均顯著高于P1磷肥水平，Pielou指數(shù)在P1磷肥水平下達(dá)到最大值，其原因可能是磷肥濃度達(dá)到一定閾值，會破壞土壤原有的生態(tài)環(huán)境，影響其均勻度［35］。

利用主成分分析的方法描述微生物群落對不同分類碳源的利用情況，更直觀了解微生物對各碳源的利用差異。劉俊杰［36］研究表明，大豆在碳源的利用能力上更傾向于碳水化合物、氨基酸、羧酸類，對胺類利用效率比較弱。本研究主成分分析結(jié)果表明：與PC1 相關(guān)系數(shù)高的碳源為碳水化合物類（D-木糖、α-D-葡萄糖-1-磷酸、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)脂）、多聚物類（吐溫80、α-環(huán)式糊精）、羧酸類（γ-羥基丁酸）、氨基酸類（L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L-苯基丙氨酸、L-蘇氨酸）；與PC2相關(guān)系數(shù)高的碳源為碳水化合物類（i-赤蘚糖醇）、多聚物類（肝糖）、羧酸類（衣康酸）、氨基酸類（L-絲氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸），這表明苜蓿根際微生物主要利用碳源為以上4類碳源，與張萌萌等［37］研究結(jié)果相似。P0 和P1 在空間分布上離散程度高于P3、P4，與P2、P3 有顯著性差異?？傮w來看，施用磷肥處理的根際微生物對碳源的利用率均大于不施磷肥處理P0，原因可能是施用磷肥可一定程度改變土壤理化性質(zhì)，導(dǎo)致植物根系分泌物成分變化，土壤中碳源數(shù)量和種類會隨之改變，微生物可以利用的碳源也會有所變化。

4 結(jié)論

施用磷肥可以有效增加紫花苜蓿根際微生物群落的代謝活性，提高紫花苜蓿根際微生物對不同碳源的利用率，使微生物群落代謝多樣性指數(shù)顯著增加。但是磷肥濃度過高時，會抑制微生物群落的生長代謝，從而降低微生物的代謝功能活性，微生物群落的Simpson 指數(shù)下降，從而降低了對各類碳源的利用率。由此可見，土壤中磷素的濃度可以調(diào)節(jié)根際微生物代謝活性，這種調(diào)節(jié)對紫花苜蓿根際微生態(tài)中磷循環(huán)是必不可少的，因此，施用適量磷肥對紫花苜蓿根際微生物代謝有積極作用，掌握最優(yōu)施磷量（300 kg·hm-2）是促進(jìn)這種作用的最有效的方式，對于促進(jìn)紫花苜蓿根際活性以及提高紫花苜蓿對土壤中的養(yǎng)分利用至關(guān)重要，對苜蓿的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。