油氣微生物分子勘探技術(shù)與初步應(yīng)用

許科偉，鄭旭瑩，顧 磊，郭嘉琪，湯玉平

中國石化 石油勘探開發(fā)研究院 無錫石油地質(zhì)研究所，江蘇 無錫 214126

油氣微生物勘探技術(shù)(MPOG，Microbial Prospection for Oil and Gases)是一項(xiàng)通過采集近地表土壤或海底表層沉積物樣品，利用地質(zhì)微生物學(xué)檢測樣品中專屬微生物的豐度和群落組成特征來預(yù)測下伏油氣藏的存在、分布和性質(zhì)的烴檢測技術(shù)，具有成本低、周期短等特點(diǎn)[1-2]。

微生物勘探技術(shù)的關(guān)鍵是烴類微生物數(shù)量和組成分布規(guī)律異常。過去幾十年中, 微生物勘探技術(shù)的精度隨著實(shí)踐運(yùn)用已得到很大提高。然而，已有的絕大多數(shù)微生物勘探技術(shù)大都是基于非原位(Invitro)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)分析，不能準(zhǔn)確而全面反映漫長地質(zhì)歷史過程中油氣資源微生物的原位動態(tài)變化規(guī)律。隨著先進(jìn)的高通量測序、分子生物學(xué)技術(shù)及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，原位(Insitu)分析地質(zhì)生態(tài)系統(tǒng)的微生物群落演替規(guī)律，從微生物群落整體的角度描述特定油氣指示微生物的變化，從單一油氣微生物的指示研究走向綜合系統(tǒng)的地質(zhì)微生物研究，將是未來微生物勘探技術(shù)的重要發(fā)展方向[3]。近幾年，國內(nèi)外油氣化探公司和研究機(jī)構(gòu)采用分子生物學(xué)方法，在各大含油氣盆地開展了大量的分子微生物勘探工作，涉及沙漠、荒漠、森林、海域等眾多不同地貌，涵蓋了常規(guī)和非常規(guī)油氣資源[4-11]。以荷蘭生物鑒定公司(Biodentify)為例，針對北美頁巖油氣，基于分子指紋結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)，其甜點(diǎn)預(yù)測成功率高于85%(圖1)[12]。在可預(yù)見的未來，分子檢測新技術(shù)極可能根本改變微生物勘探技術(shù)的傳統(tǒng)方法，更加注重原位，更加強(qiáng)調(diào)應(yīng)用，更加真實(shí)反映油氣藏長期形成過程中對微生物的馴化作用。在分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展的背景下，有助于大幅提高油氣勘探成功率，具有重要的應(yīng)用前景和現(xiàn)實(shí)意義。

圖1 北美Haynesville地區(qū)(a)和Eagle Ford地區(qū)(b)頁巖油氣甜點(diǎn)預(yù)測準(zhǔn)確率[12]

本研究將以鄂爾多斯盆地杭錦旗地區(qū)微生物勘探應(yīng)用為例，介紹工業(yè)級土壤核酸(DNA)提取、高通量測序、穩(wěn)定性同位素探針等油氣微生物分子檢測新技術(shù)研發(fā)及其應(yīng)用。與傳統(tǒng)方法相比，油氣微生物數(shù)量和組成分布規(guī)律異常的識別精度大幅提升，有利富集區(qū)的預(yù)測效果顯著。

1 油氣微生物分子勘探技術(shù)研究

油氣微生物分子勘探技術(shù)包括4個環(huán)節(jié)：(1)油氣田土壤樣品采集；(2)土壤DNA提取與分析，篩選敏感性油氣微生物種屬；(3)基于已知含油氣區(qū)和鉆井結(jié)果，通過機(jī)器學(xué)習(xí)建立判別模型；(4)針對預(yù)測區(qū)，繪制油氣微生物異常分布圖，開展有利區(qū)帶優(yōu)選，目標(biāo)評價(jià)和甜點(diǎn)區(qū)預(yù)測等(圖2)。本文將對土壤DNA提取和油氣指示微生物檢測部分作重點(diǎn)闡述。

圖2 油氣微生物分子勘探工作流程

1.1 工業(yè)級DNA提取技術(shù)研究

從土壤中提取DNA是成功表征油氣指示微生物群落多樣性的先決條件。不同的DNA提取方法之間的提取效率、提取質(zhì)量和提取數(shù)量存在差異，而DNA提取的完整性和偏差對后續(xù)微生物豐度和群落多樣性分析有一定程度的影響。因此，建立規(guī)范的DNA提取指標(biāo)體系是微生物群落多樣性分析的關(guān)鍵。

本研究采集理化性質(zhì)具有明顯差異的3種土壤(0～60 cm 剖面)，并將部分土壤風(fēng)干處理，共計(jì)6份土壤進(jìn)行DNA提取。主要土壤類型包括：新鮮草原土壤(PS-F)、風(fēng)干草原土壤(PS-D)、新鮮荒漠土壤(BS-F)、風(fēng)干荒漠土壤(BS-D)、新鮮沼澤土壤(FS-F)和風(fēng)干沼澤土壤(FS-D)。風(fēng)干土壤是取出每種土壤的新鮮樣品一部分后放在室內(nèi)，自然風(fēng)干后的土壤模擬杭錦旗地區(qū)自然環(huán)境。稱取6份土壤，每份土壤干重約0.5 g，如表1所示的方法來提取土壤總DNA，并將其溶于200 μL的TE緩沖液(由Tris和EDTA配制而成)。方法Ⅱ和方法Ⅳ的純化手段采用TAKARA公司生產(chǎn)的DV807A型號試劑盒，純化方法按照說明書所示，方法Ⅴ和方法Ⅵ按照各自的產(chǎn)品說明書所示。

表1 土壤微生物總DNA提取方法

采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)來分析6種提取方法下的土壤微生物總DNA的提取結(jié)果。土壤微生物基因組DNA凝膠電泳的條帶越亮，表明其DNA數(shù)量越多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GF法、GF-P法、KS-2法獲得的土壤微生物DNA量相對較多，而其他方法提取得到的總DNA數(shù)量較低，甚至部分樣品中無任何條帶；GF法、GF-P法、KS-2法提取土壤微生物DNA較好，且針對草原土壤而言這3種方法中GF法最好，KS-2法次之，GF-P法最差；增加純化步驟的GF-P法提取的DNA條帶弱于GF法，說明純化步驟會減少DNA的量。

總結(jié)近20個含油氣區(qū)塊的微生物勘探工程經(jīng)驗(yàn)，土壤DNA采用商用試劑盒純化后，通常會導(dǎo)致DNA總量降低30%～77%，但純化后的DNA有效降低了土壤有機(jī)質(zhì)等雜質(zhì)對實(shí)時(shí)熒光定量PCR的抑制效應(yīng)，能夠更加真實(shí)地反映土壤微生物的數(shù)量；土壤DNA提取的各種方法中，GF方法[13]手工提取土壤微生物DNA，并且純化DNA后，獲得的定量效果最佳；地形地貌復(fù)雜條件下的工程勘探實(shí)踐中，土壤樣品性質(zhì)差別較大，需要對理化性質(zhì)具有顯著差異的樣品進(jìn)行預(yù)處理或預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合DNA純化與稀釋策略，采用統(tǒng)一的規(guī)范化方法降低有機(jī)質(zhì)對勘探微生物定量的影響。此外，通常情況下DNA提取試劑盒僅能對單個樣品進(jìn)行逐個提取，針對大樣本量工程，使用高通量移液工作站和商用多孔板DNA抽提試劑盒可大幅提高樣品檢測的可重復(fù)性和可對比性(圖3)[12]。

圖3 商用多孔板DNA抽提試劑盒抽提土壤DNA前后對比[12]

1.2 油氣指示微生物檢測技術(shù)

分子生態(tài)學(xué)方法不需要培養(yǎng)微生物，通過系統(tǒng)發(fā)育以及功能基因探針的方法來直接分析土壤樣品中的油氣微生物。隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，特別是近年來剛剛興起的宏基因組學(xué)，加速了對油氣微生物的認(rèn)識，大量的基于核酸、脂肪酸等的分子生態(tài)學(xué)方法被應(yīng)用于各種油氣微生物的解析中，包括熒光原位雜交、變性梯度凝膠電泳、生物芯片、磷脂脂肪酸分析、穩(wěn)定性同位素探針技術(shù)等[7,15]。目前使用較多的是針對油氣功能基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，包括甲烷氧化功能基因(pmoA、mmoX和mxaF)[16-18]、丙烷單加氧酶α亞基基因(prmA)[5]和丁烷單加氧酶基因(butM)[6]，均取得了較好的應(yīng)用效果，本文在此不再贅述。

本研究將油氣藏形成視為一種長期的、動態(tài)的地質(zhì)生態(tài)系統(tǒng)過程，圍繞油氣藏形成過程中烴類微滲漏的基本原理，以油氣資源形成過程對特征微生物群落的原位馴化規(guī)律為主線，通過實(shí)驗(yàn)室微宇宙培養(yǎng)，以穩(wěn)定同位素探針技術(shù)示蹤土壤活性氣態(tài)烴氧化微生物DNA，采用高通量測序深度分析13C-DNA中的16S rRNA基因，探索油氣藏上方氣態(tài)烴氧化過程的微生物驅(qū)動者；在油氣區(qū)進(jìn)行網(wǎng)格均勻采樣，利用高通量測序技術(shù)原位提取土壤中的微生物群落組成信息，通過與DNA-SIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果和油氣參比樣品數(shù)據(jù)相比較，從異位培養(yǎng)和原位檢測兩方面明確專屬油氣微生物類群，并基于指示類群在不同來源樣品中的相對豐度，通過數(shù)理統(tǒng)計(jì)和地質(zhì)統(tǒng)計(jì)分析，預(yù)測油氣藏分布(圖4)。

圖4 基于高通量測序和穩(wěn)定同位素探針的油氣指示微生物檢測技術(shù)框架

采集杭錦旗氣田典型土壤樣品，采用適當(dāng)濃度的13C標(biāo)記甲烷好氧培養(yǎng)土壤，同時(shí)設(shè)置12C對照培養(yǎng)試驗(yàn)；每24～72 h定期監(jiān)測培養(yǎng)瓶內(nèi)底物濃度，當(dāng)甲烷即將消耗完全時(shí)，采用合成空氣(20%的O2，80%的N2)沖刷培養(yǎng)瓶使之保持好氧狀況，并重新注入新鮮底物維持培養(yǎng)瓶內(nèi)氣體碳源的目標(biāo)濃度。確保整個培養(yǎng)過程土壤保持60%最大持水量，平衡土壤水分，選擇恰當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間破壞性采集土壤樣品(每克土壤中烴類氧化微生物同化0.2 mmol13C標(biāo)記烴類即可獲得足夠量的13C-DNA并通過超高速密度梯度離心得到分離)。

提取13CH4標(biāo)記后及對照土壤樣本的總DNA, 然后進(jìn)行超高速密度梯度離心，每個樣品獲得大約14個不同浮力密度的DNA，對不同浮力密度DNA進(jìn)行純化并去除氯化銫介質(zhì)后，以微生物16S rRNA基因通用引物515F/907R擴(kuò)增所有的分層DNA樣品，產(chǎn)物等摩爾混合后進(jìn)行MiSeq高通量測序分析。然后，對獲得的DNA序列數(shù)據(jù)進(jìn)行微生物分類，進(jìn)一步分析其中甲烷氧化菌的比例及種類，在16S rRNA基因水平上深度解析油氣指示微生物。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示：致密氣區(qū)樣品中，13C標(biāo)記的甲烷氧化菌主要分布在重層的第4,5,6這3層，分別占總微生物的38.73%，32.41%及20.26%。對應(yīng)的12C-甲烷處理對照的這三層，甲烷氧化菌的比例則小于1%，這說明13C標(biāo)記的重層第4,5,6三層中的甲烷氧化菌種類是甲烷氧化的主要貢獻(xiàn)者，是油氣微生物解析的重點(diǎn)研究對象。3個重層DNA高通量測序檢測到了8種甲烷氧化菌，根據(jù)13C甲烷處理和12C甲烷對照處理中比例的差別，其中占絕對優(yōu)勢的為TypeⅡ型，即α-變形菌綱的甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)中的Methylocystis，在3個重層樣本中占總微生物的比例為24.24%，占標(biāo)記甲烷氧化菌的比例3層平均為78.73%；其次為TypeⅠ型，即γ-變形菌綱的甲基球菌科(Methylo-coccaceae)甲烷氧化菌中的Methylosarcina，占所有甲烷氧化菌的16.45%?？梢源_定Methylocystis和Methylosarcina同化了大量源于12CH4的穩(wěn)定性同位素用于生長及DNA的合成，是指示性最強(qiáng)的兩類甲烷氧化菌。

圖5 鄂爾多斯盆地杭錦旗氣田上方土壤DNA-SIP各分層樣品(2-12層)中甲烷氧化菌(MOB)的百分比

通過上述思路，綜合穩(wěn)定性同位素探針和高通量測序技術(shù)，分析特異土壤樣品中油氣指示微生物的進(jìn)化分類地位和相對豐度變化規(guī)律，以及油氣指示微生物與非油氣指示微生物的相互關(guān)系，初步建立了典型含油氣區(qū)油氣指示微生物菌種類型數(shù)據(jù)庫(表2)。數(shù)據(jù)庫中包含高頻油指示菌(AMNR族)：節(jié)桿菌(Arthrobacter)、分枝桿菌(Mycobacterium)、諾卡氏菌(Nocardia)、紅螺菌(Rhodospirillum)，以及高頻氣指示菌：甲基球菌(Methylococcus)、甲基桿菌(Methylobacterium)、甲基孢囊菌(Methylocystis)。

表2 典型含油氣區(qū)主要油氣指示微生物菌種

數(shù)據(jù)庫中不同地區(qū)在油品類型相同、地貌條件相近的情況下，微生物豐度有一定差異，考慮到自然環(huán)境的復(fù)雜性，不排除受到其他因素的影響，這也有待進(jìn)一步的探究。但微生物種類未出現(xiàn)較大差異，因此，可以認(rèn)為以油氣微生物主導(dǎo)的整體微生物群落演替規(guī)律為輔助判斷依據(jù)，提升了微生物勘探技術(shù)的準(zhǔn)確性與可操作性。

實(shí)際勘探應(yīng)用中，由于高通量測序所得數(shù)據(jù)包含近百種指示菌種及其相對豐度，如此海量的數(shù)據(jù)如何處理是關(guān)鍵。有效做法是選取具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)量的油氣藏上方以及背景區(qū)樣品，通過排序、聚類分析對不同來源樣品的微生物指紋數(shù)據(jù)集進(jìn)行降維后，獲取不同油氣屬性樣品的無量綱油氣信息特征值，建立典型油氣藏異常模式，繪制預(yù)測區(qū)微生物異常圖。下文以杭錦旗地區(qū)微生物分子勘探為例進(jìn)行說明。

2 杭錦旗地區(qū)微生物分子勘探初步應(yīng)用

2.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于杭錦旗區(qū)塊，杭錦旗探區(qū)包括杭錦旗區(qū)塊和杭南區(qū)塊，位于鄂爾多斯盆地北部，構(gòu)造位置處于伊盟隆起和伊陜斜坡兩大構(gòu)造單元銜接部位，面積1 400 km2(圖6)。

圖6 鄂爾多斯盆地杭錦旗地區(qū)新召研究區(qū)構(gòu)造位置

杭錦旗探區(qū)內(nèi)發(fā)育三眼井?dāng)嗔选跆m吉林廟斷裂和泊爾江—海子斷裂3條區(qū)域性大斷裂。杭錦旗地區(qū)斷裂以南發(fā)育類似大牛地氣田、蘇里格氣田大型巖性圈閉，氣層多層疊合，勘探潛力巨大。在盆地內(nèi)部氣藏的發(fā)育主要受儲集砂體的控制，儲層物性條件是天然氣富集的主控因素。杭錦旗地區(qū)處于盆地北緣，物性不再是控制氣層分布與高產(chǎn)富集的唯一因素，烴源條件、源儲配置、局部構(gòu)造、保存條件等對氣、水分布也有重要影響，造成了天然氣富集規(guī)律和氣藏特征的相對復(fù)雜性。

新召地區(qū)屬典型的溫帶大陸性氣候，年日照時(shí)數(shù)3 300 h，日照百分率71%～73%，年平均氣溫6.5 ℃，平均水溫15.8 ℃，年平均降雨量200～250 mm，無霜期135～140 d，冬季少雪，夏季少雨，氣候干燥，晝夜溫差大。地貌主要為草地，少量沙漠、梭梭林、鹽淖和基巖出露區(qū)(圖7)，除基巖樣品外，地表土壤樣品均以砂土為主，少量亞砂土，物理化學(xué)環(huán)境參數(shù)見表3。

圖7 鄂爾多斯盆地杭錦旗地區(qū)研究區(qū)地形地貌

表3 鄂爾多斯盆地杭錦旗新召地區(qū)土壤物理化學(xué)環(huán)境參數(shù)范圍

2.2 數(shù)據(jù)處理與預(yù)測模型建立

新召地區(qū)微生物識別度高，微生物群落高豐度段為甲烷代謝生物，地表甲烷代謝類生物與背景地區(qū)區(qū)分度很高，表明經(jīng)過長期地下油氣滲漏使得新召地區(qū)的甲烷代謝類生物較為繁盛。因此，本研究基于甲烷氧化菌高通量數(shù)據(jù)，利用分類回歸樹算法(Classification and Regression Trees，簡稱CART算法)，將油氣微生物群落與地球化學(xué)指標(biāo)組成多元數(shù)據(jù)集，對微生物群落的排序、聚類分析對不同來源樣品的指紋數(shù)據(jù)的降維方式，根據(jù)油氣指示微生物豐度建立決策樹，獲取微生物綜合指紋判別模型。

按照上述思路，建立相應(yīng)的物理模型，新召由于受控于“源巖—儲層—封堵—構(gòu)造”成藏條件，屬于源內(nèi)致密巖性成藏帶。因此，源內(nèi)上采集的樣品點(diǎn)所得的指紋種類和豐度明顯要高于源上的點(diǎn)，且含有大量的甲烷氧化類的微生物，表明致密氣藏上方的指紋與背景區(qū)有明顯差異，建立的微生物指標(biāo)模型可以應(yīng)用。

2.3 地質(zhì)綜合研究

綜合異常評價(jià)是從綜合異常的指標(biāo)組合特征、異常模式與分布規(guī)律來分析，與地質(zhì)、構(gòu)造、油氣屬性、地化成因指標(biāo)等進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并用量的概念評價(jià)了異常的級別。采用濃度法和子區(qū)穩(wěn)健值濾波法等算法可將背景和異常分離，通過求取背景值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算出異常下限，在平面上圈出異常，進(jìn)而將有效指標(biāo)組合為綜合異常指標(biāo)。

新召東優(yōu)于新召西，三眼井?dāng)嗔涯喜績?yōu)于北部，有利區(qū)位于三眼井南部，異常范圍與下覆砂體展布區(qū)域匹配，顯示了砂體內(nèi)烴源的長期供給作用(圖8)。從整體上看，綜合異常分布在新召東錦30和鄰獨(dú)貴加汗錦31井區(qū)。2個異常區(qū)獨(dú)立分布，但各自區(qū)帶內(nèi)異常連續(xù)性好。這是與新召近源成藏的模式有關(guān)，下覆氣藏這種分布特征決定了頂端異常分布模式。微生物異常的分布體現(xiàn)了新召主力層位的運(yùn)聚與油氣豐度，結(jié)合杭錦旗新召主力層位現(xiàn)今烴類運(yùn)聚模式分析，新召地區(qū)上古生界煤層厚度最高可達(dá)30 m，現(xiàn)今成熟度Ro超過1.2%，生氣潛力較大，生烴強(qiáng)度達(dá)到500～3 500 m3/m2。三眼井?dāng)嗔涯喜繛榻磧?yōu)勢聚集部位。盒1—盒3段砂泥比逐漸減小，非均質(zhì)性較強(qiáng)，發(fā)育低孔低滲儲層的巖性油氣藏，新召東部分布有小斷裂，可以溝通上下儲層，烴類主要為由西向東以及由西南向東北方向運(yùn)移。

圖8 鄂爾多斯盆地杭錦旗新召地區(qū)油氣微生物異常平面分布

根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，一級異常(紅色區(qū)域)、二級異常(綠色區(qū)域)、不確定區(qū)(黃色區(qū)域)和背景區(qū)(白色)樣品數(shù)分別占總體樣品數(shù)的17.3%，31.8%，26.3%，24.6%(圖8)。從異常分布與鉆井油氣顯示結(jié)果對比來看(表4)，研究區(qū)內(nèi)工業(yè)油流井和油氣層井上方均存在化探指紋烴異常，符合率達(dá)到70%以上，表明異常分布對工業(yè)油氣藏區(qū)具有很好的響應(yīng)關(guān)系。同理，根據(jù)勘探結(jié)果，可反演出下伏油氣藏分布情況，對鉆井部署也具有重要的指導(dǎo)意義。在實(shí)際勘探中，需從石油地質(zhì)觀點(diǎn)認(rèn)識化探指紋烴勘探成果，結(jié)合地球物理、地球化學(xué)及鉆井信息進(jìn)行綜合研究。

表4 微生物異常與已知鉆井含油氣性吻合情況統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論與展望

(1)微生物分子勘探技術(shù)具有良好的勘探應(yīng)用前景。采用穩(wěn)定性同位素探針和高通量測序相結(jié)合，無需培養(yǎng)，可以準(zhǔn)確、全面地診斷出不同樣品間油氣指示微生物群落間差異，油氣識別精度顯著提升，杭錦旗致密氣的初步勘探應(yīng)用中效果良好。

(2)建立我國典型含油氣盆地油氣微生物數(shù)據(jù)庫具有重要現(xiàn)實(shí)意義。對已有微生物、地表環(huán)境、地質(zhì)和地化數(shù)據(jù)進(jìn)行深入的梳理和研究，提取特定區(qū)塊適用的指示菌種，并提出可用的采樣方案和數(shù)據(jù)環(huán)境校正方法；擴(kuò)充不同地區(qū)和不同類型油氣田的數(shù)據(jù)，為勘探應(yīng)用提供有力支撐。

(3)建議開展非常規(guī)資源的微生物分子勘探技術(shù)前瞻研究。針對頁巖油氣、煤層氣、水合物等非常規(guī)資源，開展試驗(yàn)性研究，建立相應(yīng)的甜點(diǎn)預(yù)測新方法；開展海域沉積物中厭氧烴類氧化菌分子檢測方法試驗(yàn)，為海域微生物勘探奠定基礎(chǔ)。