響應(yīng)面結(jié)合遺傳算法優(yōu)化鷹嘴豆中抗炎活性成分的提取

牛華周, 康賀磊, 侯萬超, 劉春明, 李賽男, 張語遲, 劉 震

(長春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室1，長春 130032) (長春師范大學(xué)數(shù)學(xué)學(xué)院2，長春 130032)

鷹嘴豆(cicerarietinumL.)又名雞豆和桃豆等，是豆科鷹嘴豆屬植物鷹嘴豆的種子，在我國多個(gè)省份均有種植[1]，具有補(bǔ)中益氣、溫腎壯陽、主消渴之功效[2]。近年來，國內(nèi)外對(duì)鷹嘴豆的生物活性研究多有報(bào)道，鷹嘴豆中所含的異黃酮類成分具有抗氧化和抑制Caco-2細(xì)胞生長等作用[3]，但是對(duì)于鷹嘴豆中抗炎活性的研究報(bào)道很少。而5-脂氧合酶對(duì)于炎癥的發(fā)生存在著密不可分的關(guān)系[4]，因此利用5-脂氧合酶對(duì)鷹嘴豆中抗炎活性成分進(jìn)行初步研究，為從鷹嘴豆中分離抗炎活性成分提供一定的參考。

鷹嘴豆異黃酮提取工藝參數(shù)的優(yōu)化是非線性的擬合過程，因此利用遺傳算法較為合適。遺傳算法是一種模擬自然進(jìn)化過程的全局尋優(yōu)算法[5]，在優(yōu)化天然產(chǎn)物有效成分的提取條件中有著廣泛應(yīng)用[6]。本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取過程中的超聲時(shí)間、乙醇濃度和料液比3個(gè)因素進(jìn)行模擬推算，將響應(yīng)面優(yōu)化所得的擬合函數(shù)作為遺傳算法的適應(yīng)性函數(shù)，在程序中進(jìn)行個(gè)體評(píng)價(jià)、選擇運(yùn)算、交叉運(yùn)算以及變異運(yùn)算。運(yùn)行遺傳算法優(yōu)化利用Matlab 2018b程序和程序附帶的GAOT工具箱完成[7]。

實(shí)驗(yàn)以鷹嘴豆為研究對(duì)象，首先從單因素水平考察了提取條件對(duì)提取率的影響；其次，應(yīng)用響應(yīng)面結(jié)合遺傳算法優(yōu)化鷹嘴豆異黃酮的提取方法；利用超濾-質(zhì)譜技術(shù)對(duì)鷹嘴豆粗提中的化學(xué)成分進(jìn)行抗炎活性成分篩選。應(yīng)用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)鷹嘴豆中抗炎活性成分進(jìn)行初步鑒定。

1 材料與儀器

1.1 材料與儀器

鷹嘴豆；5-脂氧合酶；乙腈(色譜級(jí))；超濾離心管(100 ku)。

Waters 2695高效液相色譜儀，LCQ-Fleet超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀，DK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋，KQ-400DE型超聲波清洗器。

1.2 方法

1.2.1 超聲輔助提取工藝的優(yōu)化

1.2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取5.12 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品用65%乙醇溶液溶解、定容于25.0 mL容量瓶中備用。分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照文獻(xiàn)[8]方法分別加入顯色劑，顯色10 min，采用紫外-可見分光光度計(jì)在510 nm測(cè)定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，制作鷹嘴豆異黃酮濃度吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 鷹嘴豆的提取

鷹嘴豆粉碎后過100目篩，按料液比加入乙醇溶液，超聲提取，過濾后蒸干，用65%乙醇溶解，顯色，測(cè)定鷹嘴豆異黃酮含量。

1.2.1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取粉碎后的鷹嘴豆5.0 g，采用超聲法提取鷹嘴豆異黃酮，分別考察了超聲時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(35.0%、45.0%、55.0%、65.0%、75.0%、85.0%、95.0%)和料液比(1∶10.0、1∶15.0、1∶20.0、1∶25.0、1∶30.0、1∶35.0、1∶40.0 g/mL)對(duì)鷹嘴豆異黃酮提取率的影響。

1.2.1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間(X1)、乙醇濃度(X2)和料液比(X3)為實(shí)驗(yàn)因素，以異黃酮得率(Y)為響應(yīng)值，利用Design-Expert中的Box-Behnken組合，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

采用響應(yīng)面分析法得到的二次回歸模型如式(1)所示。

(1)

式中：Xi和Xj為自變量，b0、bi、bii和bij分別為截距、線性回歸、二次項(xiàng)的回歸、各交互項(xiàng)的回歸的系數(shù)[9]。

1.2.1.5 遺傳算法設(shè)計(jì)優(yōu)化

在MATLAB程序中，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具箱對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模。實(shí)驗(yàn)創(chuàng)建的提取因素優(yōu)化模型為3層ANN模型(輸入層、隱含層和輸出層)，輸入層作為自變量；輸出層給出因變量[10]。選擇超聲時(shí)間、乙醇濃度和料液比為自變量，鷹嘴豆異黃酮提取率為因變量，選擇輸入層3個(gè)神經(jīng)元，輸出層1個(gè)神經(jīng)元的網(wǎng)絡(luò)模型。經(jīng)過多次訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)，得到了最佳的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。采用優(yōu)化得到的擬合函數(shù)，利用遺傳算法對(duì)輸入變量(超聲時(shí)間、乙醇濃度和料液比)進(jìn)行優(yōu)化，以使鷹嘴豆異黃酮提取率最大為目標(biāo)。設(shè)置遺傳算法的搜索范圍大小為-1～1，優(yōu)化得出全局優(yōu)化解[11]。

圖1 超聲提取鷹嘴豆中異黃酮的ANN模型

1.2.2 超濾-質(zhì)譜法篩選鷹嘴豆提取物中5-脂氧合酶抑制劑

200.0 μL的反應(yīng)體系分別由100.0 μL Tris-HCl緩沖溶液、20.0 μL 300 mg/mL樣品溶液與80.0 μL不同濃度的5-脂氧合酶溶液(0、0.5、1.0和10 U/mL，pH 7.2～7.4)組成，將反應(yīng)體系渦旋振蕩，混勻后37 ℃水浴孵育30 min，利用超濾膜(100 ku)分離與酶結(jié)合的復(fù)合物和未結(jié)合的小分子，分離時(shí)采用離心機(jī)在13 000 r/min的條件下離心10 min。加入100.0 μL Tris-HCl緩沖溶液沖洗超濾膜，沖洗未結(jié)合的小分子化合物，離心10 min，重復(fù)該操作3次。再加入100.0 μL 50%甲醇水(50∶50)溶液，釋放與5-脂氧合酶結(jié)合的活性小分子，離心10 min，重復(fù)步驟3次。將甲醇洗脫液合并，分析測(cè)定各活性成分的含量?？瞻讓?duì)照組由緩沖溶液代替酶溶液，其他條件不變，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。活性成分與酶的結(jié)合能力以增強(qiáng)因子表示，計(jì)算公式為：

(2)

式中：A1為與5-脂氧合酶結(jié)合的活性小分子化合物的量；A2為未與5-脂氧合酶結(jié)合的小分子化合物初始的量[12]。

1.2.3 高效液相色譜以及質(zhì)譜檢測(cè)條件

色譜柱為SunFireTMC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，I.D.5.0 μm)，檢測(cè)器：2998二極管陣列檢測(cè)器，流動(dòng)相：水(A)和乙腈(B)，洗脫梯度：0～10 min，3%～3% B；10～40 min，3%～65% B；40～60 min，65%～100% B，檢測(cè)波長：254 nm，進(jìn)樣量：10.0 μL。

利用六通閥聯(lián)接質(zhì)譜與液相色譜二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，選擇大氣壓化學(xué)電離離子源(APCI)為質(zhì)譜離子源，掃描范圍為150～4 000；采用正離子分析模式；離子阱壓力為3.10 × 107Pa；鞘氣輔助氣為高純度N2。液相色譜參數(shù)同上述高效液相色譜參數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用Design-Expert軟件中Box-Behnken組合對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)；采用Matlab軟件優(yōu)化超聲提取鷹嘴豆中異黃酮工藝參數(shù)；Design-Expert8.0.6軟件設(shè)計(jì)組合實(shí)驗(yàn)以及繪制響應(yīng)面圖形，利用Origin進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

超聲提取鷹嘴豆異黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。超聲時(shí)間在0～1.5 h內(nèi)鷹嘴豆異黃酮提取率逐漸增加，超時(shí)時(shí)間大于1.5 h后提取率逐漸降低。提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，鷹嘴豆異黃酮提取率達(dá)到最大值。由于超聲破壞了鷹嘴豆的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致鷹嘴豆細(xì)胞內(nèi)異黃酮大量溶出，因此超聲時(shí)間越長，異黃酮的溶出率越高，隨提取時(shí)間的繼續(xù)增加，鷹嘴豆細(xì)胞組織中大量細(xì)胞破裂，其他雜質(zhì)的溶出，影響鷹嘴豆異黃酮的溶出率[13]，因此最佳超聲時(shí)間為1.5 h。

鷹嘴豆異黃酮的提取率在乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%～70%時(shí)，隨著乙醇濃度的增加逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度大于80%時(shí)，提取率逐漸降低。該現(xiàn)象可能由于乙醇濃度增加，異黃酮的溶解度逐漸降低引起的。異黃酮一般易溶于高濃度有機(jī)溶劑，但異黃酮苷一般易溶于低濃度乙醇等有機(jī)溶劑。異黃酮苷在超聲提取條件下不易分解，因此在乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%～75%時(shí)，提取率逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加時(shí)，將不利于鷹嘴豆中大量的異黃酮苷的溶出，因此提取率會(huì)降低[14]，因此最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)的為75%。

鷹嘴豆異黃酮提取率在料液比1∶10.0至1∶25.0 g/mL之間呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，是因?yàn)殡S著料液比的增加，鷹嘴豆和溶劑之間的濃度差增加，加速異黃酮的溶出。當(dāng)料液比大于1∶25.0時(shí)，乙醇體積過多時(shí)也可能造成其他物質(zhì)的滲出，影響異黃酮的溶出[15]。因此最佳料液比為1∶25.0 g/mL。

圖2 超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、和料液比對(duì)異黃酮提取率的影響

2.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

鷹嘴豆異黃酮的提取條件選取超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比3個(gè)因素，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)原理，利用Design-Expert程序，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。利用響應(yīng)面優(yōu)化鷹嘴豆異黃酮的最佳提取條件，并擬合出相應(yīng)的函數(shù)，結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。利用響應(yīng)面擬合得到的函數(shù)為：

Y=0.74+0.04A+0.05B+0.02C+0.04AB-0.03BC-0.06A2-0.10B2-0.14C2

(3)

所選用的二次多項(xiàng)模型P<0.05，R2=0.92，說明該模型二次方程顯著，本方法可靠，對(duì)模擬分析三因素三水平實(shí)驗(yàn)條件是可行的。并且f>0.05為模型項(xiàng)顯著。

2.3 遺傳算法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用 Matlab R2018b軟件中的遺傳算法優(yōu)化工具箱，在響應(yīng)面所構(gòu)建的擬合函數(shù)的基礎(chǔ)上，以鷹嘴豆異黃酮提取率為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)。經(jīng)過N迭代后，適應(yīng)度函數(shù)值趨向適應(yīng)度最高的個(gè)體[16]，即鷹嘴豆異黃酮提取率的最大值。由圖3可見，當(dāng)?shù)?3次時(shí)，群體的適應(yīng)性函數(shù)變化趨勢(shì)達(dá)到最大值0.76，即鷹嘴豆異黃酮提取率最大值為0.76 mg/g，此時(shí)超聲時(shí)間(X1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X2)、和料液比(X3)水平編碼分別為0.47、0.36和-0.02，即實(shí)驗(yàn)水平分別為1.73 h、78.64%和1∶24.9 g/mL。在此條件下，提取鷹嘴豆中異黃酮的成分，所得異黃酮含量理論值為0.76 mg/g。響應(yīng)面與遺傳算法相結(jié)合對(duì)鷹嘴豆最佳提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，能較準(zhǔn)確地優(yōu)化鷹嘴豆異黃酮的最佳提取條件。

圖3 遺傳算法優(yōu)化結(jié)果

2.4 超濾-質(zhì)譜技術(shù)篩選鷹嘴豆5-脂氧合酶抑制劑

鷹嘴豆超濾實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照組以及分別與80.0 μL不同濃度的5-脂氧合酶(0.5、1.0和10.0 U/mL)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)組HPLC圖見圖4。鷹嘴豆提取物中有5個(gè)成分可以與0.5、1.0和10.0 U/mL的5-脂氧合酶結(jié)合，對(duì)5-脂氧合酶存在一定的抑制作用，具有潛在的抗炎活性[17]。各活性成分與酶的結(jié)合強(qiáng)度用結(jié)合因子為，考察5個(gè)化合物與5-脂氧合酶的結(jié)合能力。由表2可知，5個(gè)活性成分對(duì)1.0 U/mL的5-脂氧合酶活性抑制效果顯著，其中化合物5的結(jié)合強(qiáng)度最高，其次為化合物2、化合物3、化合物4和化合物1。通過超濾-質(zhì)譜技術(shù)研究鷹嘴豆與5-脂氧合酶的抑制作用，操作簡便，超濾-質(zhì)譜技術(shù)具有高通量檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，是一種快速高效的初步篩選復(fù)雜提取物中活性成分的手段，具有低成本、操作簡單等優(yōu)勢(shì)。

表2 鷹嘴豆提取物與5-脂氧合酶的結(jié)合強(qiáng)度/%

注：a為空白組實(shí)驗(yàn)，b、c、d分別為酶濃度0.5、 1.0、10.0 U/mL的實(shí)驗(yàn)組。圖4 鷹嘴豆提取物與不同濃度5-脂氧合酶結(jié)合的HPLC圖

2.5 液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)初步鑒定鷹嘴豆中化學(xué)成分

利用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)鷹嘴豆提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行初步的分離與鑒定，通過質(zhì)譜信息與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，分析鷹嘴豆中的化學(xué)成分的信息，結(jié)果如表3。利用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)鷹嘴豆提取物中活性成分進(jìn)行初步鑒定和解析，根據(jù)各化合物的保留時(shí)間、分子離子以及碎片離子等信息，鑒定5個(gè)具有抑制5-脂氧合酶活性的異黃酮類化合物分別為大豆苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、后莫紫檀素和鷹嘴豆芽素A[19-22]。

表3 LC/MS法初步鑒定鷹嘴豆提取物中的化學(xué)成分

3 結(jié)論

利用遺傳算法結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化鷹嘴豆中異黃酮的提取工藝，優(yōu)化得到最佳提取工藝為：提取時(shí)間為1.73 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)為78.64%和料液比1∶24.90，在此條件下，鷹嘴豆中異黃酮提取率為0.76 mg/g。利用超濾質(zhì)譜法篩選出鷹嘴豆中5個(gè)具有抑制5-脂氧合酶的活性成分，5-脂氧合酶活度為1.0 U/mL時(shí)，抑制酶的活性效果顯著，鷹嘴豆芽素A與5-脂氧合酶結(jié)合度最高。