兩種方法純化臨床分離阿薩希毛孢子菌莢膜多糖GXM

肖英倫 鄧光遠(yuǎn) 張軒 羅燕芬 張偉錚

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣州 510006；2.廣州市干部健康管理中心 廣州市第十一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣州 510530)

阿薩希毛孢子菌(Trichosporonasahii，T.asahii)是一種重要的酵母樣真菌，廣泛存在于自然環(huán)境和定植于人體的部分組織器官中。醫(yī)學(xué)上，其是播散性毛孢子菌的主要致病菌，主要引起免疫功能低下人群的機(jī)會(huì)性深部真菌感染，死亡率達(dá)30%～80%[1]。T.asahii可產(chǎn)生一系列的毒力因子，主要包括莢膜多糖、生物膜形成以及細(xì)胞外酶的分泌等。莢膜多糖包括兩種主要類型的多糖，即葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖(GXM)和半乳糖木糖甘露聚糖(GalxM)以及少量的甘露糖蛋白(MP)。GXM是阿薩希毛孢子菌細(xì)胞壁的重要成分，也是一種分泌多糖[2]，其在抗宿主免疫反應(yīng)中起到重要作用，因此對GXM的純化和研究是非常必要的。

目前,多糖的分離純化方法很多，如離子交換柱層析法、透析法、溶劑萃取法[3]等。本次研究將先使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)[4]特異性沉淀臨床分離的阿薩希毛孢子菌分泌的GXM，使用透析法和萃取法兩種方法對GXM進(jìn)行純化，硫酸-苯酚法[5]測定GXM濃度。具體步驟詳敘如下。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株 阿薩希毛孢子菌株由廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部病原微生物室保存提供。

試劑與材料 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、酵母氮基礎(chǔ)基(YNB)、一次性細(xì)菌過濾器購自生工生物工程(上海)股份有限公司。苯酚、濃硫酸、無水乙醇、氯仿、異丙醇、葡萄糖均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

菌株復(fù)蘇及培養(yǎng) 從-80℃冰箱中取出阿薩希毛孢子菌菌株，室溫復(fù)蘇后，接種至SDA平板，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。鑒定為阿薩希毛孢子菌后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。預(yù)先配置好200 mL的SDA液體培養(yǎng)基，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落接種至該培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)過程確保無菌操作。置于30 ℃搖床，以220 r/min搖菌培養(yǎng)4～5 d。

莢膜多糖的分離 搖菌培養(yǎng)第3天，取少量菌液接種至SDA平板，實(shí)驗(yàn)過程確保無菌操作。培養(yǎng)48 h，觀察平板上菌落形態(tài)并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，確保是單一菌種阿薩希毛孢子菌，在搖菌培養(yǎng)前不受其他菌的污染。

搖菌培養(yǎng)4～5 d后，以5 000 r/min，離心20 min，收集上清液，棄去菌體沉淀。用注射器吸取上清液，讓上清液通過0.22 μm無菌濾膜以完全除去菌體，并收集于干凈的玻璃瓶中，此為混合多糖溶液。于混合多糖溶液中緩慢加入3倍體積的無水乙醇，可以觀察到溶液由澄清逐漸出現(xiàn)白色渾濁，充分搖勻后置于4℃過夜，使多糖溶液充分沉淀。次日，可見玻璃瓶壁上黏附著白色物質(zhì)，為盡可能收集多糖沉淀，故充分搖勻使多糖沉淀懸浮于液體中，分裝于50 mL離心管以7 830 r/min，離心10 min，棄去上清液，收集多糖沉淀。風(fēng)干。加3.6 mL滅菌水溶解沉淀。

苯酚硫酸法測混合多糖濃度 首先配置濃度為10 mg/mL的葡萄糖溶液和60%的苯酚溶液，準(zhǔn)備9個(gè)玻璃管，每個(gè)玻璃管加入1 mL的超純水和50 μL的60%苯酚溶液，按照表1的實(shí)驗(yàn)方案加入10 mg/mL葡萄糖溶液和待測樣品。因?yàn)榧尤霛饬蛩岷蠓磻?yīng)過程中會(huì)釋放大量熱量，故在加入濃硫酸之前混勻玻璃管內(nèi)各物質(zhì)，置于碎冰中以降溫。迅速往各玻璃管加入濃硫酸2.5 mL(注意是豎直垂懸于管口直接迅速加入玻璃管中，不能沿管壁加入)。反應(yīng)20 min后加至96孔板，每孔200 μL，每管設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。使用酶標(biāo)儀測量它們在450 nm波長下的光密度值。求各組光密度值的平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣品的光密度值取平均值后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式計(jì)算混合多糖濃度。

表1 苯酚硫酸法測混合多糖濃度實(shí)驗(yàn)方案

CTAB沉淀GXM 根據(jù)上述計(jì)算的混合多糖的含量，配置0.3%的CTAB溶液和2 mol/L的NaCl溶液，CTAB的用量應(yīng)為多糖含量的3倍，如1 mg多糖溶液應(yīng)加入3 mg的CTAB(即1 mL的 0.3%CTAB)。為了提高效率，使GXM盡可能地被沉淀下來，CTAB的用量應(yīng)高于理論計(jì)算值。CTAB在低溫的時(shí)候溶解度很低，因此實(shí)驗(yàn)過程中盡量控制在室溫，避免低溫時(shí)CTAB溶解度減低，形成沉淀影響其與GXM的結(jié)合，降低提取效率。于上訴獲得的3.6 mL混合多糖溶液中加入0.4 mL 2 mol/L的NaCl溶液，該步驟的目的使溶液里NaCl的最終濃度為0.2 mol/L。在低離子環(huán)境中，CTAB可以特異性結(jié)合GXM。于混合多糖溶液中緩慢加入0.3%的CTAB溶液，隨著溶液中離子濃度的逐漸降低，GXM-CTAB復(fù)合物逐漸形成，可觀察到溶液由澄清透明到出現(xiàn)白色渾濁。為確保GXM沉淀完全，室溫靜置過夜，使GXM-CTAB復(fù)合物完全沉淀下來。次日，7 000 r/min離心10 min使GXM-CTAB復(fù)合物沉淀于底部，于上清液滴加0.3%的CTAB溶液，觀察上清液是否保持澄清不變渾濁，若保持澄清則為沉淀完全。棄去上清液，收集沉淀。沉淀用10%乙醇洗一遍，離心，棄去上清液，風(fēng)干沉淀。加1 mol/L的NaCl溶液5 mL溶解沉淀，可過夜溶解，此為 CTAB-GXM-NaCl溶液。

CIA純化GXM(萃取法) 首先配制25 mL比例為24∶1的氯仿∶異戊醇混合液(chlorofom: isoamyl alcohol,24∶1 v/v;CIA)。以4 mL CIA液加入20 mL CTAB-GXM-NACL中，混勻后以4 000 r/min離心10 min，混合液分為3層，澄清水相層位于上端，渾濁有機(jī)層位于下端，兩層相交的界面包含少量不能溶解物質(zhì)。將每10 mL水相層液體轉(zhuǎn)移至50 mL的離心管中(避免吸取交界面不能溶解物質(zhì))，先后加入滅菌用水10 mL和異丙醇30 mL，-30 ℃過夜使GXM完全沉淀。4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，棄上清收集沉淀，24 h風(fēng)干后以5 mL無菌1xPBS 4 ℃過夜溶解沉淀。以前述的苯酚硫酸法測定GXM濃度后存于-30 ℃?zhèn)溆谩?/p>

GXM緩沖液的交換(透析法) 前期實(shí)驗(yàn)同上述實(shí)驗(yàn)步驟，加2 mol/L的NaCl溶液3 mL溶解沉淀，可過夜溶解，得到CTAB-GXM-NaCl溶液。剪一段10 kD的透析袋，置于水中煮沸以軟化并除去雜質(zhì)，扎緊透析袋的一端，將CTAB-GXM-NaCl溶液加至透析袋中，扎緊另一端，置于1 mol/L NaCl 中，4 ℃透析1 d。在高離子環(huán)境中，CTAB與GXM分離，CTAB為小分子物質(zhì)，可穿過透析袋而GXM為大分子物質(zhì)留在了透析袋中。通過這一原理實(shí)現(xiàn)GXM與CTAB的分離。1 d后，將透析液換成蒸餾水，透析1周，期間每天換液，直至溶液澄清透亮。該步驟的目的是逐漸降低NaCl的含量，將GXM的溶劑徹底轉(zhuǎn)換成蒸餾水。最后用1×PBS透析1 d，將GXM溶劑置換成1×PBS。苯酚硫酸法測定GXM濃度，其余存于-30 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié) 果

2.1 多糖含量的測定

通過苯酚硫酸法測量不同含量的葡萄糖在450 nm波長下的光密度值(OD)，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)(X)，以糖含量為縱坐標(biāo)(Y)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。糖含量的計(jì)算方程為：Y=2.1808X-0.1017(R2=0.9983,P<0.05)。測得待測樣品3管(混合多糖樣品20 μL、40 μL、80 μL)的OD 450值的平均值分別為0.186、0.377、0.632，代入計(jì)算方程再換算，其濃度分別為15.20 mg/mL、17.99 mg/mL、15.95 mg/mL，取平均值算得多糖溶液濃度大約為16.38 mg/mL，而我們提取得到的多糖溶液體積為3.6 mL，表明我們從200 mL 培養(yǎng)上清中獲得了混合多糖約59 mg。

圖1 糖含量(Y)與OD450值(X)標(biāo)準(zhǔn)曲線(苯酚硫酸法)

使用相同的方法測量了另一份后續(xù)使用傳統(tǒng)法純化的混合多糖，混合多糖樣品20 μL、40 μL、80 μL的OD 450值的平均值分別為0.173、0.383、0.607，代入計(jì)算方程再換算，其濃度分別為13.78 mg/mL、18.34 mg/mL、15.28 mg/mL，取平均值算得多糖溶液濃度大約為15.8 mg/mL，而我們提取得到的多糖溶液體積為3 mL，表明我們從200 mL 培養(yǎng)上清中獲得了混合多糖約47.4 mg。

2.2 GXM含量的測定

阿薩希毛孢子菌的混合多糖經(jīng)CTAB特異性沉淀GXM后，采用CIA萃取法分離GXM-CTAB復(fù)合物，然后加入異丙醇沉淀析出GXM，加入2 mL無菌1×PBS溶解，最終獲得GXM溶液2 mL。通過苯酚硫酸法測量GXM樣品20 μL、40 μL、80 μL的光密度值，換算得到GXM的濃度分別為5.03 mg/mL、4.22 mg/mL、3.42 mg/mL，取平均值算得GXM溶液濃度大約為4.22 mg/mL，即獲得約8.4 mg的GXM。GXM獲得率(GXM/GXM和GalXM混合多糖)約為14.2%(8.4/59)。

阿薩希毛孢子菌的混合多糖經(jīng)CTAB特異性沉淀GXM，加3 mL濃度為2 mol/L的NaCl溶液溶解后，通過透析法將GXM溶液的溶劑置換成1×PBS。最終獲得GXM溶液5 mL。通過苯酚硫酸法測量GXM樣品20 μL、40 μL、80 μL的光密度值，換算得到GXM的濃度分別為0.69 mg/mL，1.27 mg/mL，2.00 mg/mL，取平均值算得GXM溶液濃度大約為1.32 mg/mL，即獲得約6.6 mg的GXM。GXM獲得率約為13.9%(6.6/47.4)。

3 討 論

GXM僅存在于新生隱球菌的莢膜和毛孢子菌的細(xì)胞壁中[6]。早在2003年，Cherniak等[7]就對新生隱球菌中的GXM進(jìn)行分離純化，國內(nèi)有李平等[8]和賴銳等[5]使用不同方法獲取新生隱球菌的GXM，但關(guān)于阿薩希毛孢子菌GXM的純化尚未有報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)采用醇沉法[9]收集混合多糖及CTAB沉淀法特異性收集GXM，通過透析法和機(jī)溶劑萃取法進(jìn)行純化。透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，達(dá)到分離的方法。常用于多糖的純化,以分離出無機(jī)鹽、單糖、雙糖等雜質(zhì)。溶劑萃取法是在兩種互不相溶或微溶的溶劑中,目標(biāo)化合物在其中的溶解度或分配系數(shù)不同,而從一種溶劑內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種溶劑中,將絕大部分的化合物提取出來[10]。

實(shí)驗(yàn)中通過透析法從200 mL增菌液中獲得了約6.6 mg的GXM，阿薩希毛孢子菌GXM的獲得率(GXM/GXM和GalXM混合多糖)為13.9%(6.6/47.4)。通過萃取法從200 mL增菌液中獲得了約8.4 mg的GXM，阿薩希毛孢子菌GXM的獲得率為14.2%(8.4/59)。兩種方法相比較，二者效率相近，但透析法用時(shí)2周，步驟繁瑣，而萃取法過程簡便、耗時(shí)短。但本次實(shí)驗(yàn)與新生隱球菌GXM獲得率相比[5，8]低，推斷可能是由于GXM在兩種真菌中含量不同所導(dǎo)致[11]。

新生隱球菌莢膜中的GXM成分可以調(diào)節(jié)人單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，干擾抗原提呈細(xì)胞和白細(xì)胞的募集，抑制吞噬作用[12]。阿薩希毛孢子菌 GXM與新生隱球菌GXM有相似的結(jié)構(gòu)和抗原決定簇[2，11]，我們推測T.asahii可能會(huì)通過GXM抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬，抑制免疫反應(yīng)，逃避宿主免疫殺傷，從而在機(jī)體建立潛伏感染。因此，深入研究GXM可以為阿薩希毛孢子菌的致病機(jī)理研究提供更加可靠的理論依據(jù)，而本研究中兩種純化方法學(xué)的建立為此提供基礎(chǔ)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將對THP-1細(xì)胞分化成的巨噬細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使用所純化的GXM對其進(jìn)行刺激，探索GXM臨床感染中對人外周血單核巨噬細(xì)胞的影響，驗(yàn)證其GXM對人外周血單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)ATP能力及其凋亡的影響，篩選GXM抑制劑，為臨床治療阿薩希毛孢子菌病尋求新方法。