AAV 介導(dǎo)的TNFR 關(guān)節(jié)內(nèi)基因治療對(duì)血友病性關(guān)節(jié)病預(yù)防和治療的實(shí)驗(yàn)研究

林振洋，王冶凡，張飛旭2，周新月，宗曉瑩，吳俠,3，華寶來4,5，肖嘯,3，孫君江,3

（1.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 200237；2.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200237；3.國家生物器反應(yīng)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；4.徐州醫(yī)科大學(xué)揚(yáng)州臨床學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225001；5.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院血液科，江蘇 揚(yáng)州 225001）

血友?。℉emophilia）是一種先天性凝血因子缺乏病，主要包括Ⅷ因子缺乏所導(dǎo)致的血友病A 型和Ⅸ因子缺乏所導(dǎo)致的血友病B 型。血友病的主要癥狀表現(xiàn)為全身不同組織和器官自發(fā)性出血和創(chuàng)傷性出血，而關(guān)節(jié)部位的自發(fā)性出血占出血事件的70%～80%[1]。關(guān)節(jié)內(nèi)反復(fù)出血將導(dǎo)致血液積累，引起鐵沉積、巨噬細(xì)胞增多和炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加，最終引發(fā)滑膜炎癥、軟骨退化以及骨重建等病變[2]，導(dǎo)致血友病性關(guān)節(jié)?。℉emophilicArthropathy，HA）的形成。目前對(duì)于血友病性關(guān)節(jié)病的治療，主要是預(yù)防性地使用重組凝血因子蛋白，減少出血概率，但是凝血因子替代療法價(jià)格昂貴、應(yīng)用有限，而且患者體內(nèi)容易產(chǎn)生針對(duì)凝血因子的抑制物；而對(duì)于已患有HA 的患者，只能通過外科手術(shù)對(duì)關(guān)節(jié)進(jìn)行置換，但具有發(fā)生嚴(yán)重出血的風(fēng)險(xiǎn)[1,3]。

在關(guān)節(jié)炎的發(fā)展過程中，白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNFα）、白介素-6（IL-6）等炎性細(xì)胞因子起到了關(guān)鍵性的作用[4]。Manetti 等[5]的研究結(jié)果顯示，HA 患者血液中的TNFα 水平與HA 的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且在HA 患者的膝關(guān)節(jié)滑膜液中的TNFα 的 含 量 要 顯 著 高 于 骨 關(guān) 節(jié) 炎（Osteoarthritis，OA）患者。可溶性腫瘤壞死因子受體（SolubleTumor NecrosisFactorReceptor，sTNFR）是一種天然存在的可以結(jié)合TNFα 的受體蛋白[6]。sTNFR 重組蛋白以及表達(dá)sTNFR 的基因治療藥物一直被應(yīng)用于各種關(guān)節(jié)炎的治療[7-13]，如sTNFR 的商品化藥物依那西普（Etanercept）已經(jīng)上市并用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[14]。在我們完成的一項(xiàng)臨床轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)，血友病性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，關(guān)節(jié)出血引起關(guān)節(jié)內(nèi)TNFα 水平升高，而使用抗TNFα 的治療方法可減輕血友病性關(guān)節(jié)病癥狀；在臨床研究中，HA 患者的關(guān)節(jié)內(nèi)TNFα的水平較外周循環(huán)中顯著增高，向HA 患者的關(guān)節(jié)內(nèi)單次注射sTNFR 重組蛋白后，關(guān)節(jié)內(nèi)TNFα 水平隨之下降，滑膜炎癥得到減緩[15]。然而在該研究中僅單次給藥sTNFR 重組蛋白，無法實(shí)現(xiàn)長期治療。因此，希望通過向關(guān)節(jié)內(nèi)局部注射重組腺相關(guān)病毒（RecombinantAdeno-AssociatedVirus，rAAV），以基因治療（GeneTherapy）的方式實(shí)現(xiàn)單次注射后關(guān)節(jié)內(nèi)長期、局部表達(dá)sTNFR，從而達(dá)到治療HA 的效果。

本文將表達(dá)TNFR 的質(zhì)粒(pAAV-TNFR:Fc)包裝為rAAV5-TNFR:Fc 載體，注射到B 型血友病小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)，在關(guān)節(jié)內(nèi)出血42d 后，提取小鼠關(guān)節(jié)組織的RNA，利用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR) 方法檢測(cè)TNFα、IL-1β、IL-6 和IL-10 的mRNA 表達(dá)水平，同時(shí)取關(guān)節(jié)組織用于病理切片，對(duì)病理切片進(jìn)行不同指標(biāo)的組織化學(xué)染色，并根據(jù)相應(yīng)方法對(duì)各病理變化進(jìn)行定量研究。結(jié)果表明TNFR 可以在關(guān)節(jié)內(nèi)持續(xù)表達(dá)，滑膜炎癥以及炎性細(xì)胞浸潤和血管新生的病變的程度顯著減輕，探究了關(guān)節(jié)內(nèi)的局部基因治療對(duì)血友病性關(guān)節(jié)病的預(yù)防和治療作用的理論可行性，并奠定了初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

本文所用pAAV-CB 骨架質(zhì)粒（含CB 啟動(dòng)子的AAV 載體）由本實(shí)驗(yàn)室保存，pUC57-TNFR:Fc 質(zhì)粒（表達(dá)TNFR-Fc 目的蛋白的pUC57 載體）由深圳華大基因合成。Trans5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小量回收試劑盒和膠回收試劑盒購自O(shè)mega 公司；質(zhì)粒大量抽提試劑盒購自Macherey-Nagel 公司；限制性內(nèi)切酶以及T4 連接酶購自ThermoFisher 公司；用于配制LB 培養(yǎng)基的酵母提取物和胰蛋白胨均購自O(shè)xoid 公司。

人滑膜成纖維細(xì)胞（Human Fibroblast-Like Synoviocyte，HFLS）購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，細(xì)胞編號(hào)BNCC338586；檸檬酸鐵（分析純）購自上海麥克林生化科技有限公司；DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）高 糖 培 養(yǎng) 基、胎 牛 血 清（FBS）和 胰 蛋 白 酶-EDTA（Ethylene Diamine TetraaceticAcid）（φ =0.25%）購自ThermoFisher 公司；抗TNFR1 抗體（ab90121）購自Abcam 公司；抗TNFα抗體（BAF410）購 自R＆D Sysyem 公 司；抗GAPDH（Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase，甘油醛-3-磷 酸 脫 氫 酶） 抗 體（ARG10112 ） 購 自Arigo Biolaboratories 公司；抗F4/80抗體（28463-1-AP）和抗血管性血友病因子（vonWillebrandFactor，vWF）抗體（11778-1-AP）購自Proteintech 公司。

B 型血友病小鼠（凝血因子Ⅸ表達(dá)基因敲除）購自百奧賽圖江蘇基因生物技術(shù)有限公司；多聚甲醛固定液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液購自北京雷根生物技術(shù)有限公 司；RIPA（Radio Immunoprecipitation Assay）裂 解液、SDS-PAGE（SodiumDodecylSulfate-Polyacrylamide GelElectrophoresis）凝膠快速配制試劑盒、Western 封閉液、蘇木素伊紅（H＆E）染色試劑盒、檸檬酸鈉-EDTA 抗原修復(fù)液、內(nèi)源性過氧化物酶強(qiáng)力封閉液和DAB（Diaminobenzidine）辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；普魯士藍(lán)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；1-溴-3-氯丙烷（分析純）、二甲苯（分析純）、 φ=75%乙醇（分析純）、異丙醇（分析純）和無水乙醇（分析純）購自上海優(yōu)試化工有限公司；HistoMount 封片劑和TRIzol 購自ThermoFisher；反轉(zhuǎn)錄PrimeScriptMix 購自Takara公司；qPCRSYBRMix 購自南京諾唯贊生物。

1.2 測(cè)試與表征

生化培養(yǎng)箱（SHP-250）購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（BB150）購自美國ThermoFisher 公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（5424R）購自德國Eppendorf 公司；PCR 儀（T100）購自美國Bio-Rad 公司；高通量水平電泳槽（HE-220）、數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（EPS600）、轉(zhuǎn)移電泳槽（VE-586）、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（2500）和全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（5200）購自上海天能科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（qTOWER3G）購自德國AnalytikJena 公司，微量進(jìn)樣器（10μL）購自美國Hamilton 公司，病理切片機(jī)（RM2016）購自德國Leica 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 質(zhì) 粒 構(gòu) 建 在NCBI （ National Center for BiotechnologyInformation）網(wǎng)站得到的人TNFR1 胞外區(qū)序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化后，附上小鼠IgG1-Fc 片段，再在該段基因前加入Kozak 序列，得到最終的目的基因TNFR:Fc 序列。將該目的基因序列提交深圳華大基因科技有限公司合成pUC57-TNFR:Fc 質(zhì)粒。以pUC57-TNFR:Fc 為 模 板，PCR 擴(kuò) 增TNFR:Fc基因。利用限制酶BshTⅠ和SacⅠ分別對(duì)PCR 產(chǎn)物和pAAV-CB 進(jìn)行雙酶切，經(jīng)核酸凝膠電泳純化后，將骨架片段和目的基因片段進(jìn)行膠回收后，用T4 連接酶對(duì)兩個(gè)片段進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Trans5α，提取質(zhì)粒使用SmaⅠ酶切鑒定，通過鑒定用于病毒生產(chǎn)，即pAAV-CB-TNFR:Fc。

1.3.2 重組腺病毒的生產(chǎn)、擴(kuò)增和純化 本文所用的rAAV5-TNFR:Fc 的包裝、擴(kuò)增和純化由上海泰兒圖生物科技公司完成。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 本文所用細(xì)胞為HFLS，便于研究體外rAAV5 對(duì)滑膜細(xì)胞的感染效果。將HFLS 鋪于6 孔板中，添加含 φ=10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)匯合度達(dá)到孔面積的70%～80%，按每個(gè)細(xì)胞1×106vg 的感染復(fù)數(shù)（MultiplicityofInfection，MOI）添加rAAV5-TNFR:Fc，培養(yǎng)72h 收取上清后，向細(xì)胞中加入RIPA 裂解液，轉(zhuǎn)移至1.5mLEP(Eppendorf)管中，于4℃，12000r/min 下離心10min，收取細(xì)胞裂解液的上清。細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液上清經(jīng)定量和變性后用于蛋白免疫印跡。

1.3.4 蛋 白 免 疫 印 跡(WesternBlot) 分 別 配 制φ =10%和 φ=15%聚丙烯酰胺凝膠用于TNFR:Fc 和TNFα 蛋白的電泳。上樣于凝膠后，分別于80V 和120V電泳1h，取經(jīng)電泳的凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜2h，封閉液封閉2h，一抗孵育12h，二抗孵育2h，于化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察?？贵w的使用濃度（抗體原液與抗體稀釋液的體積比）分別為：抗TNFR1 抗體，1/2000；抗TNFα 抗體，1/100；抗GAPDH 抗體，1/4000。用ImageJ 軟件對(duì)免疫印跡所得結(jié)果圖中的條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本文所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6～8 周齡的B 型血友病小鼠。對(duì)小鼠右膝關(guān)節(jié)進(jìn)行穿刺處理，引起關(guān)節(jié)出血，積累的血液將引起血友病性關(guān)節(jié)病（HA）。主要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)的小鼠分組包括預(yù)防治療組和延后治療組，如圖1 所示。

圖1 主要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)的小鼠分組Fig.1 Groupsofmiceformajoranimalexperiments

取一批小鼠作為預(yù)防治療組（n=3），對(duì)其右膝關(guān)節(jié)注射10μLrAAV5-TNFR:Fc，劑量為每個(gè)關(guān)節(jié)1×1011vg，給藥14d 后再對(duì)小鼠的右膝關(guān)節(jié)進(jìn)行穿刺處理誘導(dǎo)出血。同時(shí)取另一批小鼠設(shè)為相應(yīng)的PBS（PhosphateBufferedSaline）組（n=3），對(duì)其右膝關(guān)節(jié)注射10μLPBS，注射和穿刺處理時(shí)間點(diǎn)與給藥組均相同。穿刺處理42d 后（給藥56d 后）處死小鼠，取右膝關(guān)節(jié)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另外，取一批小鼠作為延后治療組（n=3），對(duì)其右膝關(guān)節(jié)進(jìn)行穿刺處理誘導(dǎo)出血，出血14d 后再向右膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射10μLrAAV5-TNFR:Fc，劑量為每個(gè)關(guān)節(jié)1×1011vg。同時(shí)取另一批小鼠設(shè)為相應(yīng)的PBS 組（n=3），對(duì)其右膝關(guān)節(jié)注射10 μLPBS，穿刺處理和注射時(shí)間點(diǎn)與給藥組均相同。穿刺處理42d 后（給藥28d 后）處死小鼠，取右膝關(guān)節(jié)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

兩個(gè)治療組的小鼠從關(guān)節(jié)穿刺到小鼠被處死的時(shí)間間隔均為42d。此外，設(shè)NC（NegativeControl）組小鼠除不接受給藥和穿刺處理之外，其余添加均相同。

1.3.6 提取RNA 取小鼠的右膝關(guān)節(jié)，經(jīng)研磨和勻漿處理后，用TRIzol 試劑提取關(guān)節(jié)中的RNA。

1.3.7 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR) 將提取所得的各樣本的RNA 進(jìn)行定量后，用PrimeScriptMix 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA、雙蒸水和SYBRMix 混合成擴(kuò)增體系，用于qPCR 測(cè)定TNFR 或細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)變化，檢測(cè)各指標(biāo)時(shí)均設(shè)3 個(gè)副孔。

1.3.8 免疫組化染色 取小鼠的右膝關(guān)節(jié)，經(jīng)固定、脫鈣、包埋等系列處理后用于病理切片。使用切片進(jìn)行后續(xù)的H＆E 染色、抗F4/80 染色以及抗vWF 染色。本文中所展示的染色結(jié)果均為各組內(nèi)的代表性結(jié)果，針對(duì)H＆E 染色結(jié)果的滑膜炎評(píng)分參照文獻(xiàn)[16]中所述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，對(duì)F4/80 染色結(jié)果的巨噬細(xì)胞浸潤評(píng)分和對(duì)vWF 染色結(jié)果的新生血管計(jì)數(shù)參照文獻(xiàn)[17]中所述方法進(jìn)行，對(duì)每組（n=3）切片的評(píng)分均為3 名人員獨(dú)立評(píng)分后得出的均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 出血后小鼠關(guān)節(jié)中TNFα mRNA 水平變化

對(duì)B 型血友病小鼠右膝關(guān)節(jié)進(jìn)行穿刺處理，28d 后取其膝關(guān)節(jié)提取RNA，用qPCR 測(cè)定TNFα的mRNA 水平變化，見圖2。結(jié)果顯示，經(jīng)穿刺處理后，出血關(guān)節(jié)中TNFα 在mRNA 水平為其對(duì)照組的1.36倍（p＜0.05）。同時(shí)，取小鼠膝關(guān)節(jié)用于WesternBlot檢測(cè)TNFα 蛋白水平變化，圖2(b)示出了其中代表性結(jié)果。使用ImageJ 軟件對(duì)TNFα 的條帶進(jìn)行灰度值分析，出血關(guān)節(jié)內(nèi)TNFα 的含量為NC 組中的2.53 倍（p＜0.05），說明穿刺處理28d 后，出血關(guān)節(jié)中的TNFα表達(dá)上升。

圖2 B型血友病小鼠右膝關(guān)節(jié)進(jìn)行穿刺處理28d 后右膝關(guān)節(jié)TNFα 表達(dá)水平的變化Fig.2 ExpressionlevelchangeofTNFαinrightkneejointsofHemophiliaBmice28dafterthepuncture

類似地，Haxaire 等[18]對(duì)A 型血友病小鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行穿刺處理，28d 后經(jīng)穿刺的膝關(guān)節(jié)中TNFα 的mRNA 水平相對(duì)于其對(duì)照關(guān)節(jié)也呈升高趨勢(shì)（3.6 倍，p＜0.05）。而且在本課題組近年的兩項(xiàng)研究中，在小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)生出血后[15,19]，短期內(nèi)以及長期內(nèi)關(guān)節(jié)中TNFα 的含量均顯著上升。Ovlisen 等[20]的研究結(jié)果顯示，對(duì)A 型血友病小鼠膝關(guān)節(jié)穿刺處理后的第3d，經(jīng)穿刺的膝關(guān)節(jié)內(nèi)TNFα 的含量與對(duì)照無明顯差異，而IL-1β 和IL-6 的含量均顯著上升（p＜0.0001）。

2.2 質(zhì)粒構(gòu)建和載體體外表達(dá)驗(yàn)證

根據(jù)小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)出血后其中TNFα 表達(dá)上升的結(jié)果，本文構(gòu)建了表達(dá)sTNFR 蛋白的AAV 表達(dá)載體。在得到AAV 表達(dá)載體之前，首先需要用分子克隆的方法獲得表達(dá)sTNFR 蛋白的質(zhì)粒，在本文中即將目的基因序列插入兩段ITR（Inverted Terminal Repeat）序列的CB 啟動(dòng)子表達(dá)盒中，ITR 序列為質(zhì)粒DNA 在體內(nèi)由單鏈轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈所必需的元件。而本文所用目的基因片段是人TNFR1 的胞外區(qū)序列加小鼠IgG1 的Fc 序列，相對(duì)于TNFR2，TNFR1 對(duì)TNFα 的親和力更強(qiáng)[21]，而IgG 的添加使得表達(dá)的TNFR 能以二聚體形式更加穩(wěn)定地存在，從而延長了在體內(nèi)的半衰期[11]。已經(jīng)上市的Etanercept 就是人TNFR 與人IgG 的融合蛋白的二聚體[14]。

從質(zhì)粒的SacⅠ單酶切和SacⅠ、BshTⅠ雙酶切結(jié)果可以看出，其總大小在5000～7500bp 之間（應(yīng)為6300bp），目的基因大小在1000～2000bp 之間（應(yīng)為1300bp），說明目的基因已經(jīng)插入了預(yù)期的位點(diǎn)。為鑒定質(zhì)粒ITR 片段留存情況，使用SmaⅠ酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行單酶切后，可以得到3 個(gè)片段，且在原質(zhì)粒大小處（6300bp）無條帶（圖3(a)）?？梢娔康幕蛞驯豢寺〉捷d體骨架上的預(yù)期位點(diǎn)，且ITR 片段沒有丟失。包裝質(zhì)粒時(shí)采用了AAV5 的血清型，其優(yōu)勢(shì)在于AAV5 在嚙齒類動(dòng)物的炎癥關(guān)節(jié)中的目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比AAV2 更高[22]，且AAV5 在多種常見的天然血清型中擁有極低的中和抗體陽性率[23]，因此使用AAV5 更利于療法擴(kuò)展至臨床應(yīng)用。

為驗(yàn)證病毒載體對(duì)表達(dá)目的蛋白的能力，用包裝所得的rAAV-TNFR:Fc 感染HFLS，MOI 為每個(gè)細(xì)胞1×106vg，收取細(xì)胞的培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液上清，用于WesternBlot 實(shí)驗(yàn)。被感染細(xì)胞的細(xì)胞裂解液上清樣本在膜上有明顯條帶，其上清樣本中也能觀察到微弱條帶（圖3(b)），但在未感染的細(xì)胞的樣本中未見表達(dá)，說明該病毒能夠感染HFLS 并使其穩(wěn)定表達(dá)TNFR:Fc，表達(dá)的TNFR:Fc 部分分泌到上清中。

圖3 質(zhì)粒酶切后電泳結(jié)果及rAAV5-TNFR:Fc 感染HFLS 后TNFR 表達(dá)的WesternBlot 結(jié)果Fig.3 ElectrophoresisofdigestedplasmidandWesternBlotofTNFRinHFLSinfectedwithrAAV5-TNFR:Fc

2.3 載體的小鼠體內(nèi)表達(dá)能力驗(yàn)證

在完成載體的體外表達(dá)能力驗(yàn)證之后，為進(jìn)一步驗(yàn)證載體的體內(nèi)表達(dá)能力，向小鼠的右膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射1×1011vg 的rAAV5-TNFR:Fc，給藥28d 后取其膝關(guān)節(jié)提取RNA 用于qPCR 檢測(cè)TNFR 的表達(dá)，其給藥組的TNFRmRNA 水平相比于對(duì)照組上升至551.23 倍（p＜0.01，圖4(a)）。同時(shí)取小鼠膝關(guān)節(jié)提取蛋白進(jìn)行Westernblot 檢測(cè)TNFR 的表達(dá)。相比于對(duì)照組，能觀察到給藥組樣本在膜上有TNFR 的明顯條帶（圖4(b)）。上述結(jié)果說明rAAV5-TNFR:Fc 在小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)能夠持續(xù)地表達(dá)TNFR:Fc。

圖4 向B 型血友病小鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射rAAV5-TNFR:Fc28d 后右膝關(guān)節(jié)組織內(nèi)的TNFR 的表達(dá)水平變化Fig.4 ExpressionlevelchangeofTNFRinrightkneejointsafterHemophiliaBmicewereintra-articularlyinjectedwithrAAV5-TNFR:Fc intorightkneejointsafter28d

類似地，Zhang 等[12]在小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射1.6×1011vg劑量的rAAV-TNFR1，關(guān)節(jié)內(nèi)的sTNFR 在28d 時(shí)達(dá)到峰值，60d 時(shí)關(guān)節(jié)內(nèi)仍能檢測(cè)到可觀水平的sTNFR。Khoury 等[10]在小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射1.5×109vg的rAAV5-TNFR:Fc，91d 后仍能檢測(cè)到一定水平的TNFR。Zhou 等[9]向大鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射3×1010vg的rAAV2-TNFR:Fc，35d 后，在血漿、給藥關(guān)節(jié)和對(duì)側(cè)關(guān)節(jié)中仍能檢測(cè)到顯著的sTNFR 表達(dá)?？梢婈P(guān)節(jié)內(nèi)注射的rAAV-TNFR 介導(dǎo)的關(guān)節(jié)內(nèi)TNFR 的局部表達(dá)具有良好的可持續(xù)性。

2.4 關(guān)節(jié)內(nèi)注射AAV-TNFR:Fc 對(duì)出血后關(guān)節(jié)內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響

在預(yù)防治療組中，與NC 組相比，PBS 組的各細(xì)胞因子mRNA 水平均不同程度地顯著上升（圖5(a)）。與PBS 組相比，給藥組中TNFα 與IL-1β 的mRNA水平顯著下降，IL-6 與IL-10 的mRNA 水平則沒有明顯改變；而與NC 組相比，給藥組中TNFα 和IL-1β的mRNA 水平已無顯著差異，說明藥物顯著降低了炎癥進(jìn)程中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中TNFα 和IL-1β 的表達(dá)，二者恢復(fù)到正常水平，但對(duì)IL-6 和IL-10mRNA水平的表達(dá)沒有影響。

在延后治療組中，與NC 組相比，PBS 組的各細(xì)胞因子mRNA 水平同樣均不同程度地顯著上升（圖5(b)）；與PBS 組相比，在給藥組中，僅IL-1β 的mRNA 水平顯著下降，TNFα、IL-6 和IL-10 的mRNA水平無明顯差異；然而給藥組和NC 組間TNFα 的mRNA 水平已無顯著差異，給藥組中TNFα 的mRNA表達(dá)與NC 組的水平相近。

圖5 關(guān)節(jié)內(nèi)注射rAAV5-TNFR:Fc 對(duì)B 型血友病小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)出血后細(xì)胞因子的表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of intraarticular injection of rAAV5-TNFR:Fc on cytokine expression levels in hemarthrosis joints of HemophiliaBmice

上述兩治療組關(guān)節(jié)勻漿的qPCR 結(jié)果顯示，TNFα 的mRNA 表達(dá)水平與NC 已無顯著差異，IL-1β 的mRNA 表達(dá)水平顯著下降，而IL-6 和IL-10 的mRNA 表達(dá)水平無明顯改變。

取延后治療組小鼠的右膝關(guān)節(jié)勻漿用于Western Blot 檢測(cè)TNFα 表達(dá)的變化，圖5(c)為實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。使用ImageJ 對(duì)WesternBlot 結(jié)果中TNFα 條帶進(jìn)行灰度分析，PBS 組和給藥組中TNFα的含量分別為NC 組的1.83 倍（p＜0.05）和1.14 倍，說明關(guān)節(jié)內(nèi)注射rAAV-TNFR:Fc 降低了出血42d 后關(guān)節(jié)中的TNFα含量。

盡管HA 是由多個(gè)因素共同導(dǎo)致的病變，具體的病理機(jī)制有待闡明，但關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)程中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的主要細(xì)胞因子的介導(dǎo)機(jī)制近年來已有不少系統(tǒng)性的報(bào)道，核因子-κB（NF-κB）相關(guān)通路在其中發(fā)揮了重要作用[24-25]。關(guān)節(jié)中血液的代謝產(chǎn)物含鐵血黃素在滑膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中過度積累，引發(fā)了對(duì)細(xì)胞中NF-κB 表達(dá)的刺激，由此促進(jìn)了TNFα、IL-1β、IL-6 和IFNγ 的表達(dá)，本文也檢測(cè)到了TNFα、IL-1β、IL-6 表達(dá)水平的上升。這些炎性細(xì)胞因子表達(dá)的上升又正反饋于NF-κB 通路的活性[24-25]，而且也可促進(jìn)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK，Extracellularsignalregulatedkinase）、p38、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3，STAT3）相關(guān)通路的活性，促進(jìn)具有抗炎和軟骨保護(hù)活性的IL-10 的表達(dá)[4]，因此在qPCR 的結(jié)果中，各種細(xì)胞因子的水平均顯著上升。

Haxaire 等[18]對(duì)血友病A 型小鼠的膝關(guān)節(jié)進(jìn)行單次穿刺處理后，對(duì)經(jīng)穿刺關(guān)節(jié)的軟組織中的TNFα的mRNA 水平進(jìn)行測(cè)定，在穿刺之后第3、7、14、30d，TNFα 的mRNA 水平分別為對(duì)照組的約13、5、6、4 倍，說明在單次出血造成的HA 中，TNFα 的mRNA表達(dá)量本身呈隨時(shí)間推移而下降的趨勢(shì)，在本文中該值（第42d）為1.47 倍（p＜0.05），而給藥組中該值為1.20 倍。Zhou 等[9]向由膠原誘導(dǎo)形成全身炎癥的兩組大鼠的膝關(guān)節(jié)內(nèi)分別注射rAAV 衣殼和rAAV2-TNFR:Fc，同樣顯示出rAAV-TNFR:Fc 對(duì)TNFα的拮抗效果。35d 后其rAAV 衣殼組和rAAV2-TNFR:Fc組大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)TNFα 含量分別為NC 組的約5.40倍（p＜0.01）和1.4 倍（p＜0.01），均高于本文42d 后對(duì)應(yīng)的兩組的TNFα 含量（1.83 倍和1.14 倍），推測(cè)前者的差異（5.40 倍相比1.83 倍）是由于膠原誘導(dǎo)形成的全身炎癥嚴(yán)重程度大于局部的血友病性關(guān)節(jié)炎。文獻(xiàn)[24]測(cè)得在小鼠關(guān)節(jié)出血后的第60d，IL-1β和IL-6 蛋白水平相比于出血后3h 有所降低但仍處于較高水平，而TNFα 已降至近于對(duì)照組水平，IL-10水平則明顯高于出血后3h，且顯著高于對(duì)照組。

2.5 關(guān)節(jié)內(nèi)注射AAV-TNFR:Fc 對(duì)出血后關(guān)節(jié)內(nèi)病變的治療效果

根據(jù)Valentino 等[24]對(duì)HA 小鼠滑膜炎模型積分定量分析的方法，對(duì)關(guān)節(jié)組織病理切片的H＆E 染色結(jié)果（圖6(a)）的滑膜炎癥病變進(jìn)行觀察和評(píng)分。從滑膜炎評(píng)分結(jié)果（圖6(b)～6(c)）看，預(yù)防治療組中，AAV 組的評(píng)分為2.67，其PBS 組的評(píng)分為5.00；延后給藥組中，AAV 組的評(píng)分為3.78，其PBS 組的評(píng)分為5.33，NC 組的評(píng)分為0.22（圖中未展示）?？梢妰山o藥組小鼠相對(duì)于對(duì)應(yīng)的PBS 組滑膜炎評(píng)分均下降，但兩給藥組與NC 組間仍存在顯著差異，說明均未恢復(fù)到正常水平。上述結(jié)果顯示，rAAV5-TNFR:Fc的關(guān)節(jié)內(nèi)局部給藥在一定程度上能夠起到抑制HA 中滑膜炎進(jìn)展的作用，盡管預(yù)防治療組的評(píng)分低于延后給藥組，且兩治療組間存在著載體表達(dá)時(shí)間的差異，但兩種治療方式均能起到顯著降低滑膜炎癥的效果。

圖6 關(guān)節(jié)內(nèi)注射rAAV5-TNFR:Fc 治療B 型血友病小鼠HA，關(guān)節(jié)組織的H＆E 染色結(jié)果以及滑膜炎評(píng)分Fig.6 H＆EstainingofjointtissueandsynovitisscoringafterHemophiliaBmicewereintraarticularinjectedwithrAAV5-TNFR:FctotreatHA

F4/80 是巨噬細(xì)胞表面的一種抗原，在本課題組之前的研究中曾針對(duì)該抗原對(duì)小鼠關(guān)節(jié)切片進(jìn)行免疫組化染色，以評(píng)估關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤程度[15]。根據(jù)Hoffman 等[17]針對(duì)巨噬細(xì)胞F4/80 蛋白的染色以及進(jìn)行巨噬細(xì)胞評(píng)分的方法，本文將巨噬細(xì)胞F4/80 作為抗原對(duì)關(guān)節(jié)病理切片進(jìn)行免疫組化染色（見圖7(a)），并對(duì)巨噬細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行觀察和評(píng)分圖7(b)～7(c)。從巨噬細(xì)胞評(píng)分的結(jié)果（圖7(b)～7(c)）看，預(yù)防給藥組中，AAV 組的評(píng)分為1.89，其PBS 組的評(píng)分為2.78；延后給藥組中，AAV 組的評(píng)分為2.22，其PBS 組的評(píng)分為3.00，NC 組的評(píng)分為0（圖中未展示），可見兩給藥組的評(píng)分相對(duì)于對(duì)應(yīng)的PBS組均下降，但兩給藥組與NC 組間仍相差較大，說明均未恢復(fù)到正常水平。該評(píng)分結(jié)果顯示，在慢性HA 中，rAAV5-TNFR:Fc 的關(guān)節(jié)內(nèi)局部給藥在一定程度上降低了HA 關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜中的巨噬細(xì)胞的浸潤程度，預(yù)防治療和延后治療兩種治療方式均能減少巨噬細(xì)胞浸潤程度以保護(hù)關(guān)節(jié)。

圖7 關(guān)節(jié)內(nèi)注射rAAV5-TNFR:Fc 治療B 型血友病小鼠HA，關(guān)節(jié)組織的針對(duì)F4/80 抗原的組化染色結(jié)果以及巨噬細(xì)胞浸潤評(píng)分Fig.7 Anti-F4/80antigenIHCofjointtissueandmacrophageinfiltrationscoringafterHemophiliaBmicewereintraarticularinjectedwith rAAV5-TNFR:FctotreatHA

vWF 是能夠介導(dǎo)血小板黏附于血管損傷部位的一種糖蛋白，還具有穩(wěn)定血液中的凝血因子Ⅷ（FⅧ）的作用，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生[27]。根據(jù)Hoffman等[17]針對(duì)vWF 蛋白的染色以及進(jìn)行血管計(jì)數(shù)的方法，本文將其作為抗原對(duì)關(guān)節(jié)病理切片進(jìn)行免疫組化染色(見圖8(a))，并對(duì)高倍鏡（40×）下的新生血管進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)，以評(píng)估病變關(guān)節(jié)內(nèi)的血管增生程度。從新生血管計(jì)數(shù)結(jié)果（圖8(b)～8(c)）看，每高倍鏡視野下，預(yù)防給藥組中，AAV 組的新生血管數(shù)為5.67，其對(duì)應(yīng)的PBS 組的新生血管數(shù)為11.11；延后給藥組中，AAV 組的新生血管數(shù)為8.78，其對(duì)應(yīng)的PBS 組的新生血管數(shù)為13.78，NC 組為2.33（圖中未展示），可見兩給藥組的每高倍鏡視野下新生血管數(shù)量相對(duì)于對(duì)應(yīng)的PBS 組均下降，但兩給藥組與NC 組間仍存在較大差距，說明仍未恢復(fù)到正常水平。上述結(jié)果顯示，rAAV5-TNFR:Fc 的關(guān)節(jié)內(nèi)局部給藥在一定程度上能夠抑制HA 關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜中的新生血管的增生程度，預(yù)防治療和延后治療兩種治療方式均能減少血管的增生程度。

圖8 關(guān)節(jié)內(nèi)注射rAAV5-TNFR:Fc 治療B 型血友病小鼠HA，關(guān)節(jié)組織的針對(duì)vWF 抗原的組化染色結(jié)果以及巨噬細(xì)胞浸潤評(píng)分Fig.8 Anti-vWFantigenIHCofjointtissueandmacrophageinfiltrationscoringafterHemophiliaBmicewereintraarticularinjectedwith rAAV5-TNFR:FctotreatHA

從對(duì)關(guān)節(jié)組織的滑膜炎評(píng)分、巨噬細(xì)胞浸潤評(píng)分以及新生血管計(jì)數(shù)結(jié)果可見，通過預(yù)防治療和延后治療兩種治療方式，rAAV5-TNFR:Fc 的關(guān)節(jié)內(nèi)局部給藥在一定程度均能降低關(guān)節(jié)內(nèi)的滑膜炎癥程度，并減少巨噬細(xì)胞浸潤以及血管增生的病理變化。預(yù)防治療組和延后治療組的給藥和關(guān)節(jié)穿刺的先后順序不同，為了保證從穿刺處理關(guān)節(jié)到小鼠被處死的時(shí)間間隔相同，從而造成了兩治療組目的蛋白的表達(dá)時(shí)間存在差異，這可能導(dǎo)致延后治療組在滑膜炎評(píng)分、巨噬細(xì)胞浸潤評(píng)分以及每高倍鏡視野新生血管數(shù)量均高于預(yù)防治療組，盡管如此，延后治療仍顯示出降低這些病變程度的效果。另外，推測(cè)導(dǎo)致延后治療組各評(píng)分高于預(yù)防治療組的另一個(gè)重要原因是，在發(fā)生出血之后14d 才給藥，關(guān)節(jié)積累的血液以及其引起的炎癥對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)的組織已經(jīng)造成了不可逆的破壞作用，延后的給藥無法改善關(guān)節(jié)內(nèi)組織已經(jīng)受到的損傷，而預(yù)防給藥可以最大程度地減少這種破壞，因此，與使用凝血因子藥物預(yù)防性地治療HA 類似，應(yīng)用抗炎藥物治療HA 時(shí)，也應(yīng)遵循預(yù)防優(yōu)先的原則。

此外，本文旨在探究rAAV5-TNFR:Fc 對(duì)血友病性關(guān)節(jié)病的預(yù)防和治療作用的理論可行性并奠定初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，而在臨床研究以及臨床轉(zhuǎn)化研究中，為阻止人類患者關(guān)節(jié)內(nèi)出血情況的惡化，取得更好的抗炎療效，需要將凝血因子與基因療法聯(lián)合起來，這比單獨(dú)應(yīng)用基因療法具有更好的可行性和臨床意義。其次，參考zhou 等[7]的臨床研究，本文采用的AAV-TNFR:Fc 的劑量也介于其研究結(jié)果的安全范圍內(nèi)，在該范圍內(nèi)，HA 對(duì)全身循環(huán)中細(xì)胞因子的影響水平較小[5,19]，盡管如此，TNFR:Fc 水平以及全身循環(huán)中各細(xì)胞因子的水平有待進(jìn)一步的檢測(cè)，以探究藥物的系統(tǒng)性影響。

3 結(jié)束語

在關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)生出血后，向關(guān)節(jié)內(nèi)注射的基因治療藥物rAAV5-TNFR:Fc 能使關(guān)節(jié)組織持續(xù)地局部表達(dá)TNFR:Fc，減少關(guān)節(jié)內(nèi)炎性細(xì)胞因子TNFα 的含量，從而起到抑制關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)展的作用，預(yù)防治療和延后治療兩種方式均能改善關(guān)節(jié)炎癥，減少炎性的巨噬細(xì)胞浸潤和血管增生的病理變化。然而本文僅探究了單獨(dú)表達(dá)TNFR:Fc 對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)出血后炎癥的抑制作用，并沒有配合外源性凝血因子藥物的使用，因此對(duì)關(guān)節(jié)僅能起到部分的保護(hù)作用，未能完全使病變關(guān)節(jié)恢復(fù)到正常關(guān)節(jié)水平。向關(guān)節(jié)內(nèi)注射rAAV5-TNFR:Fc 用于血友病性關(guān)節(jié)病的研究值得進(jìn)一步深入，推測(cè)這一療法同樣適用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及骨性關(guān)節(jié)炎的治療。