超聲波輔助提取紫玉蘭葉多酚工藝及其抗氧化活性研究

陳建福

(漳州職業(yè)技術(shù)學院 應(yīng)用化工學院，福建 漳州 363000)

紫玉蘭(MagnolialiliifloraDesr.)又名辛夷、木蘭，為中國特有的喬木類園林植物，在我國的福建、湖北、云南、廣東、廣西等省(自治區(qū))均有種植[1].紫玉蘭花朵呈紫色，花朵曬干后就是一味藥材“辛夷”，是我國古籍中記載的一種傳統(tǒng)中藥，可用于風寒鼻塞、頭痛等癥[2]，此外，紫玉蘭還含有多酚、萜類、木質(zhì)素、色素、精油等多種天然有效成分[3-4]，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域中.多酚是植物體內(nèi)重要的代謝物，植物的根、葉、皮以及生殖器官中大都含有多酚，多酚具有多種有益于人體的功效，如降低患腫瘤的風險、有效抑制自由基氧化反應(yīng)、抑制炎癥發(fā)作、抵抗病毒侵襲等[5]，植物多酚提取已成為天然產(chǎn)物化學研究的熱點[6].目前，植物多酚的提取主要有傳統(tǒng)提取方式如索氏萃取、熱水浸提及回流提取等，以及現(xiàn)代提取方式如超臨界、超聲輔助、微波輔助等[7].與傳統(tǒng)提取方式能耗大、耗時長、提取率低等相比，超聲輔助提取是利用超聲波的空穴、機械、振動等效應(yīng)，擊穿和破壞細胞壁,使植物組織形成裂縫并在內(nèi)部產(chǎn)熱，以實現(xiàn)多酚的有效提取并保持多酚生物活性的一種提取方法[8].

目前已有一些植物葉多酚超聲輔助提取的報道[9]，但還沒有針對紫玉蘭葉中多酚提取的研究.目前，紫玉蘭葉大都任其自由落葉且被作為垃圾清理，造成資源的浪費，若能對葉片中的活性成分進行合理開發(fā)，便可以大大提高紫玉蘭的經(jīng)濟價值和應(yīng)用價值.本文以紫玉蘭葉為原料，先通過考察4個單因素對紫玉蘭葉多酚提取率的影響，再由單因素試驗結(jié)果進行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，最終得出紫玉蘭葉多酚的最佳提取條件，并對紫玉蘭葉的抗氧化活性進行探討，為紫玉蘭葉多酚的提取與應(yīng)用提供參考.

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

紫玉蘭葉，采收于漳州市馬鞍山，選擇鮮嫩、大小均勻的紫玉蘭葉，用水沖洗干凈，烘干后用多功能粉碎機將紫玉蘭葉碎裂成粉末狀，過60目的篩網(wǎng)后，置于密封袋中備用.鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、沒食子酸等均為市售分析純.

1.2 試驗方法

1.2.1 紫玉蘭葉多酚標準曲線 多酚含量采用福林-酚法測定[10].取7個10 mL比色管，分別加入0.5 mL福林-酚試劑，繼續(xù)分別加入系列體積0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液，搖勻，靜置1 min，用移液器移取1.5 mL 20%碳酸鈉溶液加入比色管中，定容至10 mL并搖勻后于75 ℃水下恒溫10 min，取出在765 nm波長下比色，根據(jù)測定數(shù)據(jù)作出標準曲線，得回歸方程：y=0.100 5x+0.042 7，R2=0.999 3.

1.2.2 紫玉蘭葉多酚的提取及含量的測定 將一定質(zhì)量m(g)的紫玉蘭葉粉末倒入100 mL圓底燒瓶中，加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液及適量沸石，超聲波清洗器(KQ-100TDE型，昆山市超聲儀器有限公司)提前設(shè)置一定溫度和時間，待到達目標溫度后，將圓底燒瓶放入超聲波清洗器中進行浸提一定時間.待超聲結(jié)束后將圓底燒瓶取下，靜置冷卻，濃縮，定容至體積V(mL)，按1.2.1方法進行取樣，用紫外可見分光光度計(UV-200型，上海美普達儀器有限公司)測試提取液中多酚質(zhì)量濃度c(mg/L)并計算多酚提取率Y(mg/g).

1.2.3 單因素試驗 稱取紫玉蘭葉粉末1 g，加入25 mL體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，預(yù)先將超聲波清洗器溫度分別設(shè)置為55、60、65、70、75 ℃，達到目標溫度后進行超聲處理30 min，得紫玉蘭葉多酚粗提液，做3次重復(fù)，分別計算提取率.

稱取紫玉蘭葉粉末1 g，加入25 mL體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，預(yù)先將溫度設(shè)置為65 ℃的超聲波清洗器中，分別超聲10、20、30、40、50 min，得紫玉蘭葉多酚粗提液，做3次重復(fù)，分別計算提取率.

稱取紫玉蘭葉粉末1 g，分別加入25 mL體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，預(yù)先將溫度設(shè)置為65 ℃的超聲波清洗器中，超聲處理30 min，得紫玉蘭葉多酚粗提液，做3次重復(fù)，分別計算提取率.

稱取紫玉蘭葉粉末1 g，分別加入15、20、25、30、35 mL 70%的乙醇溶液，預(yù)先將溫度設(shè)置為65 ℃的超聲波清洗器中，超聲處理30 min，得紫玉蘭葉多酚粗提液，做3次重復(fù)，分別計算提取率.

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 通過分析上述單一因素的試驗結(jié)果，確定影響紫玉蘭葉多酚提取率4因素的最佳取值影響范圍，以紫玉蘭葉多酚提取率為試驗設(shè)計的響應(yīng)值，進行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，對提取條件進一步優(yōu)化.最后進行3組驗證性試驗，確定最佳工藝條件.

1.2.5 紫玉蘭葉多酚的抗氧化活性測定

1) DPPH?的清除能力.在一系列比色管中分別加入不同質(zhì)量濃度的紫玉蘭葉多酚溶液2 mL，繼續(xù)加入0.2 mmol/L的DPPH溶液(或無水乙醇)2 mL，混合并避光反應(yīng)30 min，分別在517 nm處測得吸光度Ai(或Aj)；以2 mL蒸餾水替代紫玉蘭葉多酚與DPPH溶液混合，測得吸光度A0，同時以維生素C替代紫玉蘭多酚為對照進行測定，DPPH?的清除率(R，%)由下式計算：

2) ?OH的清除率能力.在一系列比色管中分別加入不同質(zhì)量濃度的紫玉蘭葉多酚溶液2 mL，繼續(xù)加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL、9 mmol/L FeSO4溶液1 mL和0.01% H2O2溶液1 mL(或蒸餾水)，混合均勻后避光反應(yīng)60 min，定容，后在510 nm處測定吸光度Ai(或Aj)；以2 mL蒸餾水替代紫玉蘭葉多酚，測得吸光度A0，同時以維生素C替代紫玉蘭葉多酚為對照進行測定，?OH的清除率(Q，%)由下式計算：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲溫度對提取率的影響 如圖1所示，不同的超聲溫度對紫玉蘭葉多酚提取率的影響較大.當超聲溫度在65 ℃時達到最大值,這是因為溶劑和紫玉蘭葉顆粒分子的平均動能會隨著體系溫度的升高而增加，增強了多酚類物質(zhì)分子的擴散作用，有利于多酚物質(zhì)的提取[11].但超聲溫度過高會破壞多酚物質(zhì)中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差的物質(zhì)，對多酚提取不利.因此最佳的超聲溫度為65 ℃.

2.1.2 超聲時間對提取率的影響 如圖2所示，不同的超聲時間對紫玉蘭葉多酚提取率的影響較大.當超聲時間在30 min時達到最大值,這是因為一定的超聲處理時間，可以促進紫玉蘭葉多酚物質(zhì)逐漸被浸提出來，并溶解于溶劑中，達到一定時間時，多酚基本完全浸出，所以紫玉蘭葉多酚的提取率明顯增加.然而，若超聲處理時間過長，提取液中的多酚物質(zhì)與氧氣經(jīng)過長時間的接觸，會與氧氣發(fā)生反應(yīng)而減少[12].因此最佳超聲時間為30 min.

圖1 超聲溫度對提取率的影響 圖2 超聲時間對提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction yield

2.1.3 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響 如圖3所示，不同的乙醇體積分數(shù)對紫玉蘭葉多酚提取率的影響較大.當乙醇體積分數(shù)為70%時達到最大值,這是因為乙醇體積分數(shù)升高，會使得乙醇水溶液的極性減弱，更容易破壞植物體內(nèi)的氫鍵和疏水作用力，使得多酚提取率增加[13]，但當乙醇體積分數(shù)超過70%時，紫玉蘭葉中大量會與多酚物質(zhì)發(fā)生競爭溶出的雜質(zhì)被提取出來，導致多酚溶出減少，提取率下降.因此最佳的乙醇體積分數(shù)為70%.

2.1.4 液料比對提取率的影響 如圖4所示，不同的液料比對紫玉蘭葉多酚提取率的影響較大.液料比在25 mL/g時達到最大值,這是因為液料比大有利于多酚物質(zhì)和溶劑充分接觸，溶出的多酚物質(zhì)增多，但液料比過大，會導致濃縮等操作過程中多酚物質(zhì)的損失[14].因此最佳的液料比為25 mL/g.

2.2 紫玉蘭葉多酚提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面因素及水平 根據(jù)超聲溫度、超聲時間、乙醇體積分數(shù)和液料比4個單因素的試驗結(jié)果，確定影響紫玉蘭葉多酚提取率的因素取值范圍如表1所示.以紫玉蘭葉中多酚的提取率為響應(yīng)值，設(shè)計Box-Behnken試驗，共確定29個試驗，其中5個中心點試驗和24個析因試驗，結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3.

圖3 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響 圖4 液料比對提取率的影響 Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction yield Fig.4 Effect of liquid-to-material ratio on the extraction yield

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計Tab.1 Design of Box-Behnken experiment

對表2中的數(shù)據(jù)進行擬合，得到超聲波輔助提取紫玉蘭葉多酚提取率Y與各考察變量的二次多項回歸模型方程：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及測定Tab.2 Design and results of response surface methodology

表3 方差分析Tab.3 Results of analysis of variance

Y=44.28+0.22A+1.79B+1.10C-1.37D+0.40AB+0.40AC-2.02AD+

0.85BC-0.34BD-0.25CD-1.79A2-2.52B2-2.92C2-2.04D2.

由表3可知，失擬項P=0.088 8>0.05，說明失擬項差異不顯著.回歸模型的F=11.37，P=0.000 1<0.01，表明模型顯著性極高.同時，該方程相關(guān)系數(shù)R2=0.919 2，說明此回歸模型可用來分析91.92%的紫玉蘭葉中多酚提取率的變化，且擬合狀況良好，可以用來對紫玉蘭葉中多酚提取率進行分析、預(yù)測.通過顯著性檢驗可知，一次項B、C、D，二次項A2、B2、C2、D2，交互項AD的P值都小于0.01，說明這幾項對紫玉蘭葉多酚提取率影響極顯著，其余各項對紫玉蘭葉多酚提取率影響不顯著，因此，試驗因素并不是通過簡單的線性關(guān)系影響紫玉蘭葉中多酚的提取率.F值越大，該因素對多酚提取的影響越顯著，因此通過表3中F值大小比較，可判斷出影響紫玉蘭葉多酚提取的順序為：超聲時間(B)>液料比(D)>乙醇體積分數(shù)(C)>超聲溫度(A).

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析 由圖5所示，當超聲溫度一定時，紫玉蘭葉多酚提取率先升高后降低；同理，當超聲時間一定時，超聲溫度的影響趨勢亦是如此，提取率先升高后降低，從響應(yīng)面的陡峭和等高線的形狀中，可知二者的交互作用不顯著.

(a) 超聲溫度與超聲時間的響應(yīng)面圖 (b) 超聲溫度與超聲時間的等高線圖圖5 超聲溫度與超聲時間的交互作用Fig.5 Interaction between ultrasonic temperature and time

由圖6所示，當超聲溫度為一定時，紫玉蘭葉多酚提取率先升高后降低；同理，當乙醇體積分數(shù)一定時，超聲溫度的影響趨勢亦是如此，提取率先升高后降低，從響應(yīng)面的陡峭和等高線的形狀中，可知二者的交互作用不顯著.

(a) 超聲溫度與乙醇體積分數(shù)的響應(yīng)面圖 (b) 超聲溫度與乙醇體積分數(shù)的等高線圖圖6 超聲溫度與乙醇體積分數(shù)的交互作用Fig.6 Interaction between ultrasonic temperature and ethanol concentration

由圖7所示，當超聲溫度為一定時，紫玉蘭葉多酚提取率先升高后降低；同理，當液料比一定時，超聲溫度的影響趨勢亦是如此，提取率先升高后降低，從響應(yīng)面的陡峭和等高線的形狀中，可知二者的交互作用極顯著.

由圖8所示，當超聲時間為一定時，紫玉蘭葉多酚提取率先升高后降低；同理，當乙醇體積分數(shù)一定時，超聲時間的影響趨勢亦是如此，提取率先升高后降低，從響應(yīng)面的陡峭和等高線的形狀中，可知二者的交互作用不顯著.

由圖9所示，當超聲時間為一定時，紫玉蘭葉多酚提取率先升高后降低；同理，當液料比一定時，超聲時間的影響趨勢亦是如此，提取率先升高后降低，從響應(yīng)面的陡峭和等高線的形狀中，可知二者的交互作用不顯著.

由圖10所示，當乙醇體積分數(shù)為一定值時，紫玉蘭葉多酚提取率先升高后降低；同理，當液料比一定時，乙醇體積分數(shù)的影響趨勢亦是如此，提取率先升高后降低，從響應(yīng)面的陡峭和等高線的形狀中，可知二者的交互作用不顯著.

(a) 超聲溫度與液料比的響應(yīng)面圖 (b) 超聲溫度與液料比的等高線圖圖7 超聲溫度與液料比的交互作用Fig.7 Interaction between ultrasonic temperature and liquid-to-material ratio

(a) 超聲時間與乙醇體積分數(shù)的響應(yīng)面圖 (b) 超聲時間與乙醇體積分數(shù)的等高線圖圖8 超聲時間與乙醇體積分數(shù)的交互作用Fig.8 Interaction between ultrasound time and ethanol concentration

(a) 超聲時間與液料比的響應(yīng)面圖 (b) 超聲溫度與液料比的等高線圖圖9 超聲時間與液料比的交互作用Fig.9 Interaction between ultrasonic time and liquid-to-material ratio

(a) 乙醇體積分數(shù)與液料比的響應(yīng)面圖 (b) 乙醇體積分數(shù)與液料比的等高線圖圖10 乙醇體積分數(shù)與液料比的交互作用Fig.10 Interaction between ethanol concentration and liquid-to-material ratio

2.3 最佳工藝條件的確定與驗證

根據(jù)Design-Expert 8.0.6b軟件計算得到最佳的參數(shù)為超聲溫度67.62 ℃、超聲時間34.96 min、乙醇體積分數(shù)73.23%和液料比21.72 mL/g，其理論上的紫玉蘭葉多酚提取率為45.41 mg/g.考慮到實驗室實際條件，將條件取整為超聲溫度68 ℃、超聲時間35 min、乙醇體積分數(shù)73%、液料比22 mL/g.進行3組驗證性試驗，計算平均值得出紫玉蘭葉多酚提取率為44.76 mg/g，與理論上的提取率相對誤差只有1.43%，證明了該模型可應(yīng)用于紫玉蘭葉多酚的提取.

2.4 紫玉蘭葉多酚的抗氧化活性分析

2.4.1 多酚對DPPH?的作用效果 通過考察紫玉蘭葉多酚對DPPH?的作用效果來確定其抗氧化能力，如圖11所示.從圖11中可知，紫玉蘭葉多酚對DPPH?的作用效果隨著紫玉蘭葉多酚質(zhì)量濃度的增加而增大，而當質(zhì)量濃度大于120 mg/L時，對DPPH?的清除率增加不再明顯.紫玉蘭葉多酚對DPPH?清除率的半抑制濃度(IC50)為57.65 mg/L，當紫玉蘭葉多酚質(zhì)量濃度為100 mg/L時，對DPPH?的清除率達到77.25%，為維生素C清除率的94.28%，說明紫玉蘭葉多酚能較好地對DPPH?進行清除，具有一定的抗氧化活性.

2.4.2 多酚對?OH的清除作用 通過考察紫玉蘭葉多酚對?OH的作用效果來確定其抗氧化能力，如圖12所示.從圖12中可知，紫玉蘭葉多酚對?OH的作用效果隨著紫玉蘭葉多酚質(zhì)量濃度的增加而增大，而當質(zhì)量濃度大于300 mg/L時，對?OH的清除率增加不再明顯.紫玉蘭葉多酚對?OH清除率的IC50為114.26 mg/L，當紫玉蘭葉多酚質(zhì)量濃度為250 mg/L時，對?OH的清除率達到80.53%，為維生素C清除率的93.28%，說明紫玉蘭葉多酚能較好地對?OH進行清除，具有一定的抗氧化活性.

圖11 多酚對DPPH?的清除作用 圖12 多酚對?OH的清除作用Fig.11 Scavenging effect of polyphenols on DPPH? Fig.12 Scavenging effect of polyphenols on ?OH

3 結(jié)論

以紫玉蘭葉為原料，考察了4個單因素對紫玉蘭葉多酚提取率的影響，再由單因素試驗結(jié)果進行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，最終得出紫玉蘭葉多酚的最佳提取條件為：超聲溫度為68 ℃、超聲時間為35 min、乙醇體積分數(shù)為73%、液料比為22 mL/g.在此工藝下得到的紫玉蘭葉多酚提取率為44.76 mg/g，與理論上的提取率45.41 mg/g之間的相對誤差只有1.43%，說明了該回歸模型合理，能較可靠地預(yù)測紫玉蘭葉多酚的提取率.紫玉蘭葉多酚對DPPH?和?OH均具有一定的清除能力，其IC50分別為57.65 mg/L和114.26 mg/L，該研究為紫玉蘭葉多酚及其資源的開發(fā)與利用提供了方向.