大孔樹(shù)脂純化萬(wàn)壽菊花中葉黃素的工藝優(yōu)化

吳紅艷 石 巖 李秀鑫 安 琪

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

萬(wàn)壽菊具有較高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，其花、葉可入藥，有清熱化痰、補(bǔ)血通經(jīng)的功效[1]。由萬(wàn)壽菊提取分離制成的葉黃素產(chǎn)品可作為食品及飼料著色劑使用，同時(shí)在預(yù)防視網(wǎng)膜黃斑病變和艾滋病、提高人和動(dòng)物免疫力、預(yù)防心腦血管疾病、作為新型飲料等方面具有卓越的生理功能[2]。萬(wàn)壽菊葉黃素提取后常用的純化方法有柱色譜法、結(jié)晶法、高效逆流色譜法等，相比較而言，柱色譜法具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，其中，大孔樹(shù)脂被廣泛應(yīng)用于多酚、生物堿、黃酮等植物活性成分的分離純化[3-5]。李育楠[6]采用HZ816樹(shù)脂純化玉米黃粉中的葉黃素，以V無(wú)水乙醇∶V乙酸乙酯為9∶1作洗脫劑進(jìn)行洗脫，較皂化后葉黃素的純度(92.17%)提高了4.32%。目前，從萬(wàn)壽菊中制備高純度葉黃素的研究較少，且一些有關(guān)葉黃素純化方法的研究存在純度低、工藝復(fù)雜以及溶劑有毒性等問(wèn)題，影響了萬(wàn)壽菊花資源的開(kāi)發(fā)利用[7-8]。試驗(yàn)擬確定大孔樹(shù)脂純化萬(wàn)壽菊中葉黃素的工藝條件，進(jìn)一步提高葉黃素的純度，以期為后續(xù)工業(yè)化研究和開(kāi)發(fā)萬(wàn)壽菊中葉黃素類產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多力葵花油：佳格投資(中國(guó))有限公司；

Tween80、Span80、氫氧化鉀：河北市光復(fù)精細(xì)化工有限公司；

葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥90%)：上海源葉生物科技有限公司；

無(wú)水乙醇：河北市天力化工研究所；

萬(wàn)壽菊顆粒：廣州立達(dá)爾生物科技股份有限公司；

X-5、S-8、D-352、D-101、HP-20大孔樹(shù)脂：南昌市廣富藥品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

水浴恒溫振蕩器：SHA-C型，河北閱近儀器有限公司；

可見(jiàn)分光光度計(jì)：722N型，濟(jì)南易農(nóng)儀器有限公司；

電子天平：BSA124S-CW型，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

磁力攪拌器：IKAC-MAG HS-4型，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；

pH計(jì)：Sartorius譜及型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

層析柱：1.5 cm×56 cm，河北慶傅儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，湖南雅陽(yáng)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葉黃素粗制品的制備 萬(wàn)壽菊顆粒粉碎過(guò)80目篩，按m萬(wàn)壽菊粉∶V葵花籽油微乳液為1∶50 (g/mL)將萬(wàn)壽菊粉和葵花籽油微乳液混合均勻，添加1%纖維素酶。45 ℃恒溫水浴中振蕩2.0 h，用0.45 μm濾膜抽濾，收集濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得葉黃素粗提物。

1.3.2 葉黃素粗制品的皂化 按m葉黃素粗提物∶VKOH-C2H5OH溶液為5∶6 (g/mL)將葉黃素粗提物與0.15 g/mL 的KOH-C2H5OH溶液混合均勻，50 ℃下超聲皂化58 min，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到濃縮液備用。

1.3.3 大孔樹(shù)脂純化葉黃素

(1) 最佳大孔樹(shù)脂的選擇：分別選取X-5、D-352、D-101、HP-20、S-8 5種大孔樹(shù)脂，將純品葉黃素分別與不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇混合均勻，制備成不同的葉黃素—乙醇稀釋液，用葉黃素—乙醇稀釋液吸附大孔樹(shù)脂，真空抽濾，測(cè)定447 nm處吸光度值，并計(jì)算其吸附率。

(2) 靜態(tài)吸附劑的選擇：將純品葉黃素分別與不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇混合均勻，制備成不同的葉黃素—乙醇稀釋液，在不同溫度、吸附時(shí)間、pH下進(jìn)行吸附，真空抽濾，測(cè)定447 nm處吸光度值，并計(jì)算其吸附率。

(3) 上樣濃度對(duì)靜態(tài)吸附的影響：將純品葉黃素分別與不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇混合均勻，制備成不同的葉黃素—乙醇稀釋液，將稀釋液配制成不同濃度的上樣液，采用大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附，真空抽濾，測(cè)定447 nm處吸光度值，并計(jì)算其吸附率。

(4) 靜態(tài)解析劑的選擇：用超純水對(duì)已吸附葉黃素的HP-20大孔樹(shù)脂進(jìn)行清洗，清洗液置于100 mL錐形瓶中，分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，制備成不同的葉黃素—乙醇稀釋液，不同溫度、解析時(shí)間、pH下進(jìn)行解析，真空抽濾，測(cè)定447 nm處吸光度值，并計(jì)算其解析率。

(5) HP-20型大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)條件優(yōu)化：分別考察上樣質(zhì)量濃度(流速0.4 mL/min，pH 6.0)和上樣流速(pH 6.0，質(zhì)量濃度0.01 mg/mL)對(duì)動(dòng)態(tài)吸附吸附率的影響。

1.3.4 吸附率、解析率的計(jì)算 分別按式(1)、式(2)計(jì)算吸附率和解析率。

(1)

(2)

式中：

Q吸——吸附率，%；

Q解——解析率，%；

Aa——葉黃素稀釋液的吸光度值；

Ab——大孔樹(shù)脂吸附葉黃素后濾液的吸光度值；

Ac——大孔樹(shù)脂解析葉黃素后濾液的吸光度值。

1.3.5 高效液相色譜檢測(cè)純化后葉黃素純度 準(zhǔn)確稱量1 mg葉黃素，將其完全溶解至10 mL甲醇中，稀釋制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙酸乙酯，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量1 μL，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)447 nm。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin和Excel軟件進(jìn)行圖表繪制，通過(guò)SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳大孔樹(shù)脂的選擇

由圖1可知，大孔樹(shù)脂種類對(duì)色素的純化效果存在差異，吸附率從高到低依次為大孔樹(shù)脂HP-20>D-101>X-5>S-8>D-352。HP-20、D-101、S-8 3種大孔樹(shù)脂均屬于非極性，根據(jù)相似相溶的原理，如果樹(shù)脂的極性接近吸附顆粒的極性，則其吸附能力會(huì)更好。S-8和D-352是極性樹(shù)脂，葉黃素是脂溶性色素，幾乎不溶于水所以其吸附率較低。大孔樹(shù)脂HP-20的解析率最高，是因?yàn)樵摌?shù)脂具有表面積大和孔徑大的特點(diǎn)，更有助于色素的吸附和解析。故選取大孔樹(shù)脂HP-20對(duì)萬(wàn)壽菊中的葉黃素進(jìn)行純化。

圖1 大孔樹(shù)脂對(duì)葉黃素吸附率和解析率的影響

2.2 靜態(tài)吸附劑的選擇

由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)<80%時(shí)，吸附率與乙醇體積分?jǐn)?shù)呈正比，是因?yàn)橐掖际勾罂讟?shù)脂發(fā)揮作用，使其得到了充分的溶脹，因此其吸附能力增強(qiáng)即吸附率高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)>80%時(shí)，吸附率呈下降趨勢(shì)，可能是由于大孔樹(shù)脂的吸附達(dá)到了飽和，故選擇體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液作為吸附劑。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葉黃素吸附率的影響

2.3 上樣質(zhì)量濃度對(duì)靜態(tài)吸附的影響

由圖3可知，隨著上部樣品質(zhì)量濃度的增加，吸附量先增大后減小。當(dāng)上樣質(zhì)量濃度>0.01 mg/mL時(shí)，吸附速率趨于下降。上樣質(zhì)量濃度太高，雜質(zhì)含量增加，葉黃素與大孔樹(shù)脂之間的接觸面積減少，可能會(huì)影響大孔樹(shù)脂對(duì)葉黃素的吸附[9]。因此，選擇0.01 mg/mL的樣品質(zhì)量濃度作為最佳吸附條件。

圖3 上樣質(zhì)量濃度對(duì)葉黃素靜態(tài)吸附率的影響

2.4 靜態(tài)吸附單因素試驗(yàn)

2.4.1 溫度對(duì)靜態(tài)吸附率的影響 由圖4可知，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，HP-20型大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附率最高，當(dāng)溫度>30 ℃時(shí)，吸附率呈下降趨勢(shì)。溫度越高，葉黃素的穩(wěn)定性越差，其稀釋液更容易揮發(fā)，故吸附率降低[10]。因此，選取靜態(tài)吸附溫度為30 ℃。

80%乙醇，pH 5.0，吸附時(shí)間2 h

2.4.2 吸附時(shí)間對(duì)靜態(tài)吸附率的影響 由圖5可知，隨著吸附時(shí)間的增加，靜態(tài)吸附速率先增大后趨于穩(wěn)定。當(dāng)吸附時(shí)間>3 h時(shí)，吸附速率無(wú)明顯變化，HP-20大孔樹(shù)脂已處于吸附飽和狀態(tài)。因此，選擇靜態(tài)吸附時(shí)間為3 h。

80%乙醇，pH 5.0，溫度30 ℃

2.4.3 pH對(duì)靜態(tài)吸附率的影響 由圖6可知，當(dāng)稀釋液的pH為3.0～6.0時(shí)，葉黃素的吸附率呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)稀釋液的pH>6.0時(shí)，吸附率下降。這可能是由于弱酸條件下，葉黃素易與大孔樹(shù)脂發(fā)生氫鍵作用，使其更容易吸附在大孔樹(shù)脂上[13]，因此選取pH為6。

80%乙醇，溫度30 ℃，吸附時(shí)間2 h

2.5 靜態(tài)吸附正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇溫度、吸附時(shí)間和pH為試驗(yàn)因素，以大孔樹(shù)脂吸附率為考察指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化靜態(tài)吸附工藝條件，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 靜態(tài)吸附正交試驗(yàn)因素水平表

由表2可知，各因素對(duì)大孔樹(shù)脂吸附率的影響順序?yàn)闇囟?吸附時(shí)間>pH，最佳試驗(yàn)組合為A2B1C3，即溫度30 ℃，吸附時(shí)間2.0 h，pH 7.0，測(cè)得平均吸附率為(96.35±0.032)%(n=3)。

表2 靜態(tài)吸附正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.6 靜態(tài)解析劑的選擇

由圖7可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，HP-20型大孔樹(shù)脂對(duì)葉黃素的解析率增加，是由于乙醇溶液可以使大孔樹(shù)脂得到充分溶脹，同時(shí)葉黃素在乙醇中溶解度較高，使葉黃素和大孔樹(shù)脂之間的作用力減小，將其葉黃素從大孔樹(shù)脂中洗脫出來(lái)溶解于乙醇溶液中。由于無(wú)水乙醇的解析率最高，因此選取其作為大孔樹(shù)脂的解析溶劑。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)靜態(tài)解析率的影響

2.7 靜態(tài)解析單因素試驗(yàn)

2.7.1 溫度對(duì)靜態(tài)解析率的影響 由圖8可知，隨著溫度的升高，解析率先增加后降低。當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，葉黃素的解析率最高。當(dāng)溫度>40 ℃時(shí)，解析率呈下降趨勢(shì)。因此選取40 ℃作為最佳解析溫度。

pH 5.0，解析時(shí)間2 h

2.7.2 pH對(duì)靜態(tài)解析率的影響 由圖9可知，當(dāng)pH為3.0～5.0時(shí)，解析率隨之增加，當(dāng)pH>5.0時(shí)，解析率趨于平穩(wěn)，對(duì)葉黃素的解析率無(wú)顯著性影響。為了節(jié)約實(shí)際用量，選取pH 5.0作為最佳解析條件。

溫度30 ℃，解析時(shí)間2 h

2.7.3 解析時(shí)間對(duì)靜態(tài)解析率的影響 由圖10可知，隨著解析時(shí)間的增加，解析率呈先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)解析時(shí)間為1～3 h時(shí)，解析率基本不變，其中2 h時(shí)的解析率最高，當(dāng)解析時(shí)間>3 h后解析率出現(xiàn)了急劇下降，是因?yàn)榻馕鰰r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，葉黃素的穩(wěn)定性變差，且無(wú)水乙醇揮發(fā)，影響解析結(jié)果。因此選取2 h為最佳解析時(shí)間。

pH 5.0，溫度30 ℃

2.8 靜態(tài)解析正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇溫度、解析時(shí)間和pH為試驗(yàn)因素，以大孔樹(shù)脂解析率為考察指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化靜態(tài)解析工藝條件，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表3，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 靜態(tài)解析正交試驗(yàn)因素水平表

由表4可知，各因素對(duì)大孔樹(shù)脂吸附葉黃素解析率的影響依次為溫度>解析時(shí)間>pH，最佳工藝組合為A2B1C3，即溫度40 ℃，解析時(shí)間1.0 h，pH 7.0，測(cè)得平均解析率為(72.23±0.064)%(n=3)。

表4 靜態(tài)解析正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.9 HP-20型大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附條件優(yōu)化

2.9.1 上樣質(zhì)量濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響 由圖11可知，葉黃素的吸附量隨樣品溶液質(zhì)量濃度的增加而先增加后減少。當(dāng)上部樣品質(zhì)量濃度>0.01 mg/mL時(shí)，會(huì)發(fā)生部分溶質(zhì)泄漏，導(dǎo)致葉黃素的損失和浪費(fèi)[11]。因此，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL時(shí)，葉黃素的動(dòng)態(tài)吸附效果最好。

圖11 上樣質(zhì)量濃度對(duì)葉黃素動(dòng)態(tài)吸附率的影響

2.9.2 上樣流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響 由圖12可知，葉黃素的吸光度值隨樣品溶液上樣流速的增加而增加。當(dāng)上樣流速>0.4 mL/min時(shí)，吸光度值突然升高，說(shuō)明葉黃素并未被大孔樹(shù)脂完全吸附便已流出[12]。因此，當(dāng)上樣流速為0.4 mL/min時(shí)，葉黃素的動(dòng)態(tài)吸附效果最好。

圖12 上樣流速對(duì)葉黃素動(dòng)態(tài)吸附的影響

2.10 純化樣品與葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比

由圖13可知，試驗(yàn)所純化的葉黃素與純品葉黃素的出峰時(shí)間基本一致，差距較小，出現(xiàn)偏差是因?yàn)闃悠窛饪s液中不能完全去除雜質(zhì)，但是經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂吸附等一系列的提純操作可以得到純度為61.72%的萬(wàn)壽菊葉黃素純度，基本達(dá)到提純目的。

圖13 上樣質(zhì)量濃度對(duì)葉黃素動(dòng)態(tài)吸附率的影響

3 結(jié)論

采用大孔樹(shù)脂將葉黃素粗品進(jìn)行純化，通過(guò)吸附率以及解析率對(duì)其靜態(tài)和動(dòng)態(tài)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：靜態(tài)試驗(yàn)中，HP-20型大孔樹(shù)脂對(duì)葉黃素的吸附與解析效果最好，選取體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇作為吸附劑，最佳靜態(tài)吸附質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL，選取無(wú)水乙醇作為解析劑。大孔樹(shù)脂對(duì)葉黃素的最佳吸附工藝條件為溫度30 ℃，吸附時(shí)間2.0 h，pH 7.0；最佳解析工藝條件為溫度40 ℃，解析時(shí)間1.0 h，pH 7.0。動(dòng)態(tài)試驗(yàn)中，樣品溶液的最佳吸附質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL，最佳樣品流速為0.4 mL/min。通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定其純度可達(dá)61.72%。后續(xù)需進(jìn)一步分離純化以提高葉黃素純度。