雙重實(shí)時(shí)熒光PCR法測(cè)定食品中大豆、小麥過敏原

金 萍 丁洪流 張 敏 金曉紅

(蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,江蘇 蘇州 215104)

近年來，食品過敏事件的報(bào)道處于上升趨勢(shì)[1]，這不但與社會(huì)的工業(yè)化有關(guān)，也與檢測(cè)、醫(yī)療技術(shù)的提升有密切關(guān)系。過敏原對(duì)于正常消費(fèi)者來說是一種無危害的營養(yǎng)物質(zhì)，但對(duì)于過敏患者來說是一種可能危及生命的物質(zhì)，食品過敏原的管理和檢測(cè)無疑成為食品安全的熱點(diǎn)問題之一[2]。

對(duì)食源性過敏原的檢測(cè)研究主要從兩個(gè)領(lǐng)域入手：對(duì)過敏原蛋白以及物種的特異性核酸片段[3-6]進(jìn)行檢測(cè)。基于過敏原蛋白特異性反應(yīng)的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫(ELISA)法[7-8]、試紙條法[9]和蛋白芯片法[10]等。ELISA法和試紙條法操作簡便，且方法的靈敏度高，目前已被許多國家接受成為標(biāo)準(zhǔn)方法，市場(chǎng)上也有比較成熟的商品化試劑盒產(chǎn)品。然而，該方法通常只能檢測(cè)一種過敏原，由于抗體生產(chǎn)的批間穩(wěn)定性差，常產(chǎn)生交叉反應(yīng)，容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果[11]。另外，在食品加工蛋白質(zhì)提取過程中會(huì)使蛋白質(zhì)變性，影響抗體對(duì)抗原蛋白的特異性安靜結(jié)合能力，使得該法檢測(cè)能力下降，甚至是假陰性結(jié)果[12]。蛋白質(zhì)的非免疫檢測(cè)技術(shù)還包括液相色譜(HPLC)[13]、毛細(xì)管電泳[14-15]等技術(shù)，但由于分離度不佳、無商品化標(biāo)準(zhǔn)品、靈敏度差等問題，極少被應(yīng)用于過敏原的檢測(cè)工作中。

由于DNA在各種生物樣本中的高度穩(wěn)定性，基于核酸的檢測(cè)方法更有優(yōu)勢(shì)[16-18]?；谀康幕驒z測(cè)的方法有經(jīng)典PCR法[19-20]、多重PCR法[21]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[22-23]以及基因芯片技術(shù)。然而，經(jīng)典PCR技術(shù)一個(gè)反應(yīng)體系只能檢測(cè)單一基因，檢測(cè)通量低，后期還需要電泳來區(qū)分核酸片段，對(duì)于大小相近的片段檢測(cè)容易產(chǎn)生誤差。多重PCR技術(shù)雖可同時(shí)擴(kuò)增多重靶標(biāo)，但同樣需要進(jìn)行電泳檢測(cè)?；蛐酒夹g(shù)是將多個(gè)不連續(xù)的樣品分析過程集成到一個(gè)芯片中，實(shí)現(xiàn)了高通量和微量化，但檢測(cè)儀器昂貴，且對(duì)檢測(cè)人員要求較高[24-26]。研究擬建立一種能實(shí)時(shí)同步檢測(cè)食品中大豆、小麥過敏原的TaqMan探針雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法，以期為食品監(jiān)管部門有效管理過敏原標(biāo)識(shí)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ABITaqMan Universal PCR master mix：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

引物以及TaqMan熒光探針：生工(上海)生物工程股份有限公司；

DP304基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技公司；

植物基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技公司；

無DNA酶水：QIAGEN公司；

無水乙醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

大豆、小米、紅豆、玉米、水稻、大麥：大潤發(fā)超市。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)：Sorvall ST8R型，Thermo Fisher Scientific公司；

微量核酸測(cè)定儀：Epoch型，美國伯騰公司；

實(shí)時(shí)熒光PCR儀：ABI 7500型，美國ABI公司；

金屬干式恒溫儀：MK-10型，杭州奧盛公司；

組織研磨器套裝：OSE-Y30型，天根生化科技有限公司；

恒溫水浴鍋：WNB45型，美墨爾特(上海)貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA模板制備 使用組織研磨器對(duì)大豆、小米、紅豆、玉米、水稻、大麥等樣品進(jìn)行均質(zhì)處理，分別過80目篩備用；為避免不同樣品間的交叉污染，不同的樣品的處理物品不通用。按照植物基因組DNA提取試劑盒要求進(jìn)行核酸提取，利用Epoch微量核酸測(cè)定儀測(cè)定提取DNA的純度，DNA的純度OD260 nm/OD280 nm比率在1.7 和2.0之間滿足要求；利用Qbit測(cè)定儀測(cè)定濃度，根據(jù)使用情況，對(duì)核酸樣本進(jìn)行分裝和保存。

1.3.2 特異性引物、探針的設(shè)計(jì)與合成 從Genbank數(shù)據(jù)庫中搜索獲得大豆、小麥成分的特異性核酸序列，通過軟件Meglign比對(duì)分析相近物種基因序列，選取匹配度低、差異大的序列片段，使用Primer Express 3.0以及Primer Blast等軟件工具設(shè)計(jì)獲得針對(duì)大豆、小麥成分基因的引物和不同熒光標(biāo)記的探針序列，并進(jìn)行特異性理論值的驗(yàn)證。同時(shí)，以真核生物18S rRNA作為內(nèi)參照基因確保試驗(yàn)的有效性，內(nèi)參基因引物探針設(shè)計(jì)來源于任易婕等[27]的相關(guān)研究。

1.3.3 多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè) 采用25 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系，反應(yīng)液中包含13 μLTaqMan PCR master mix、1 μL上游引物(10 μmol/L)、1 μL下游引物(10 μmol/L)、1 μL熒光標(biāo)記探針(10 μmol/L)以及3 μL模板DNA(40 ng/mL)。

反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，試驗(yàn)于ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行。

1.3.4 特異性檢測(cè) 按照DNA提取試劑盒說明書上的步驟分別提取大豆、小米、紅豆、玉米、水稻、大麥以及花生等樣品的核酸，核酸質(zhì)量濃度控制在50 ng/μL左右，為確保試驗(yàn)過程的有效性，多重體系中添加了真核生物18S rRNA作為內(nèi)參基因。按照1.3.3中體系要求進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增完成后根據(jù)每個(gè)體系中模板DNA的擴(kuò)增曲線和臨界循環(huán)值(Ct值)來確定所設(shè)計(jì)的多重?zé)晒怏w系的特異性。

表1 試驗(yàn)引物探針序列?

1.3.5 體系靈敏度檢測(cè) 按照1.3.1方法提取純大豆及小麥DNA，用不含DNA酶的無菌蒸餾水稀釋核酸樣本，核酸質(zhì)量濃度為10.000～0.001 ng/μL。按照1.3.3中檢測(cè)體系和反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行測(cè)試，確定該多重體系對(duì)于大豆及小麥DNA的核酸水平最低檢測(cè)限。

為了進(jìn)一步檢測(cè)TaqMan探針多重?zé)晒釶CR檢測(cè)系統(tǒng)的抗干擾能力，擬制備不同質(zhì)量比的混合樣進(jìn)行測(cè)定。首先，將均質(zhì)粉碎后的小米、紅豆、玉米、水稻以及花生這幾種常見谷物按照質(zhì)量比1∶1∶1∶1∶1混合，作為檢測(cè)的干擾樣品。然后，根據(jù)表2和表3所示比例，分別將大豆和小麥與干擾樣品進(jìn)行混合，作為檢測(cè)用模擬混合樣品。采用TaqMan探針的多重實(shí)時(shí)熒光PCR法測(cè)定混合樣品檢測(cè)體系的檢出限。

表2 大豆模擬DNA混合樣品

表3 小麥模擬DNA混合樣品

1.3.6 市售食品樣品中大豆、小麥過敏原檢測(cè) 進(jìn)一步測(cè)試所建體系對(duì)加工樣品的檢測(cè)能力，對(duì)10種常見市售谷物食品(表4)進(jìn)行大豆、小麥過敏原檢測(cè)。

表4 市售加工食品信息表

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗(yàn)

由圖1可知，建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)18S rRNA內(nèi)參基因均有明顯的擴(kuò)增信號(hào)。內(nèi)參照基因的有效擴(kuò)增，說明所建方法的反應(yīng)過程運(yùn)行正常。

圖1 7個(gè)測(cè)試樣品18S rRNA擴(kuò)增結(jié)果

大豆過敏原成分檢測(cè)體系采用FAM熒光標(biāo)記，小麥過敏原成分采用HEX熒光標(biāo)記，由圖2(a)可知，在FAM熒光通道上，建立的方法僅對(duì)大豆樣本有明顯的擴(kuò)增反應(yīng)，其他樣本如小米、紅豆、玉米等均未檢測(cè)到熒光信號(hào)。由圖2(b)可知，在HEX熒光通道上，建立的方法僅對(duì)小麥樣品有明顯的擴(kuò)增信號(hào)，其他樣品均未檢測(cè)到熒光信號(hào)。

圖2 特異性檢測(cè)結(jié)果

綜上，所建立的方法可特異性檢測(cè)出大豆和小麥過敏原。

2.2 靈敏度試驗(yàn)

大豆和小麥過敏原DNA模板質(zhì)量濃度分別為10.000，1.000，0.100，0.010，0.005，0.001 ng/μL。

由圖3(a)可知，大豆過敏原DNA質(zhì)量濃度為0.01 ng/μL 時(shí)，Ct值為29.1<35.0，且擴(kuò)增曲線呈典型“S”型，說明該反應(yīng)體系檢測(cè)大豆過敏原的最低限度為0.01 ng/μL DNA濃度。由圖3(b)可知，在0.01 ng/μL DNA模板濃度下，小麥過敏原Ct值為29.4<35.0，擴(kuò)增曲線呈典型“S”型，說明該反應(yīng)體系檢測(cè)小麥過敏原的最低限度為0.01 ng/μL DNA濃度。因此，在保證特異性的前提下，TaqMan探針多熒光PCR系統(tǒng)對(duì)大豆和小麥中過敏原DNA的最低核酸水平檢測(cè)限均為0.03 ng。

圖3 靈敏度檢測(cè)

2.3 抗干擾試驗(yàn)

根據(jù)1.3.3的體系條件對(duì)表2及表3中模擬樣本A～J進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，樣品核酸濃度選定在40 ng/mL左右，檢測(cè)結(jié)果見表5。從表5可以看出，10.00%～0.01%的大豆和小麥模擬樣品均獲得成功擴(kuò)增，Ct值分別為33.23，32.58，均<35.0。結(jié)果說明，所建立的混合檢測(cè)檢測(cè)體系均能對(duì)混樣給出正確判斷，抗干擾性號(hào)，對(duì)大豆和小麥過敏原成分可達(dá)到0.01%質(zhì)量水平的檢測(cè)限。

表5 混合樣品檢測(cè)結(jié)果?

2.4 市售加工樣品檢測(cè)

采用自建的雙重?zé)晒釶CR方法對(duì)市售的10批次加工食品進(jìn)行了大豆、小麥過敏原檢測(cè)。由表6可知，內(nèi)參基因通道擴(kuò)增正常，Ct值均<35.0，說明反應(yīng)過程正常運(yùn)行，檢測(cè)體系對(duì)加工食品適應(yīng)良好。編號(hào)1、2、5、8以及10號(hào)樣品檢出小麥成分，而3、4、6、7、9以及10號(hào)樣品檢出大豆成分，檢測(cè)結(jié)果與樣品的標(biāo)簽成分相符，說明所建方法適用于加工食品。

表6 市售加工食品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

建立了一種基于TaqMan探針雙重?zé)晒釶CR的檢測(cè)方法，通過在同一反應(yīng)管內(nèi)設(shè)置內(nèi)參照基因和兩種目標(biāo)基因進(jìn)行同步擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)食品中大豆和小麥過敏原的同時(shí)檢測(cè)。所建立的方法僅對(duì)大豆和小麥過敏原DNA有特異性的擴(kuò)增，最低檢測(cè)限為0.03 ng，在混合樣品的檢測(cè)中也表現(xiàn)出很好的抗干擾能力。相較于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫等抗體檢測(cè)方法，更適用于大批量樣品的多成分同步篩選。相較于基因芯片等技術(shù)，操作簡便，使用成本低。該法可以為其他過敏原成分的檢測(cè)提供參考，適用于大批量樣品的篩查，具有一定的推廣價(jià)值，為食品過敏原監(jiān)管提供有效依據(jù)。