刺梨多糖改善肥胖大鼠胰島素抵抗的作用和機(jī)制

張帥軍 唐月梅 牛英鵬 張 錦

(1. 贛南師范大學(xué)科技學(xué)院，江西 贛州 341000；2. 河南大學(xué)，河南 開封 475001；3. 平頂山市第一人民醫(yī)院，河南 平頂山 467000)

肥胖是一種普遍存在且嚴(yán)重危害人類健康和生活質(zhì)量的疾病，可加劇胰島素抵抗(IR)的產(chǎn)生[1]，誘發(fā)2型糖尿病(T2DM)的發(fā)生、發(fā)展[2]，增加心血管系統(tǒng)疾病的危險性[3]。IR是許多內(nèi)分泌代謝失調(diào)相關(guān)疾病的重要發(fā)病基礎(chǔ)，可引起T2DM、高脂血癥、動脈硬化等代謝失調(diào)性疾病的發(fā)生、發(fā)展[4]。刺梨(Rosaroxburghii)是薔薇科落葉灌木刺梨的果實(shí)，具有藥食同源屬性[5]。刺梨多糖(Rosaroxburghiipolysaccharide，PRR)是刺梨最主要的活性成分之一[6]，其抗氧化、降血糖等生理活性已被證實(shí)，但具體作用機(jī)制還不夠明確。研究擬采用高脂膳食誘導(dǎo)大鼠肥胖胰島素抵抗模型，通過補(bǔ)充不同劑量的PRR，觀察PRR對模型大鼠體質(zhì)量和血清生化指標(biāo)的影響，從PI3K/AKT/GLUT4信號通路方面探究PRR改善IR的作用機(jī)制，以期為刺梨作為功能性食品、醫(yī)藥、保健品的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨果粉：陜西盛恒生物有限公司；

SD雄性大鼠：SPF級，8周齡，體質(zhì)量210～220 g，河南省實(shí)驗(yàn)動物中心；

西格列他鈉：規(guī)格16 mg，成都微芯藥業(yè)有限公司；

超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；

葡萄糖、胰島素檢測試劑盒：上?？祈樕锟萍加邢薰荆?/p>

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)檢測試劑盒：合肥知恩生物技術(shù)有限公司；

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)檢測試劑盒：武漢科斯坦生物科技有限公司;

超聲波清洗機(jī)：JM-03D-40型，深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司；

紫外可見分光光度計：721N型，上海儀電分析儀器有限公司；

電子分析天平：FA2004型，上海精密儀器儀表有限公司；

血糖測定儀：GA-3型，上海聚慕醫(yī)療器械有限公司；

全自動生化分析儀：AU480型，貝克曼庫爾特商貿(mào)中國有限公司；

熒光定量PCR反應(yīng)儀：HH222-LD-PCR型，山東萊恩德智能科技有限公司；

轉(zhuǎn)印電泳儀：DYCZ-40K型，北京六一生物科技有限公司；

凝膠成像分析系統(tǒng)：WD-9413B型，北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 刺梨多糖的提取和純化 取刺梨果粉，參照唐健波等[7]超聲輔助提取法，液料比(m刺梨果粉∶V水)為1∶40 (g/mL)，功率120 W、溫度80 ℃、4 000 r/min下離心10 min，提取濾液，重復(fù)上述操作2次，合并3次提取液，減壓濃縮，用80%的乙醇4 ℃下醇沉24 h，Sevag法除蛋白(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)、AB-8大孔樹脂脫色(60～16目)、過濾收集濾液，上DEAE-纖維素柱，依次用蒸餾水和不同濃度梯度的NaCl洗脫，用瓊脂糖凝膠CL-6B純化，洗脫液分部收集，再用0.2 mol/L NaCl洗脫，經(jīng)苯酚硫酸法檢測，收集多糖高峰部分，真空干燥得PRR-1 (蒸餾水洗脫)、PRR-2 (0.1 mol/L NaCl洗脫)、PRR-3 (0.2 mol/L NaCl洗脫)、PRR-4 (0.3 mol/L NaCl洗脫)等多糖干品。

1.2.2 刺梨多糖含量和相對分子量的測定

(1) 刺梨多糖含量：采用苯酚—硫酸法[8]，取刺梨純多糖各組分樣品，溶于0.2 mol/L NaCl中，上瓊脂糖凝膠CL-6B凝膠柱，分部收集，在紫外可見分光光度計上記錄491 nm處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算刺梨多糖含量。

(2) 相對分子量：采用凝膠滲透色譜法[9]，以標(biāo)準(zhǔn)品的相對分子質(zhì)量對數(shù)為縱坐標(biāo)，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，對曲線進(jìn)行回歸擬合得標(biāo)準(zhǔn)品分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線下的樣品洗脫體積求刺梨多糖組分的相對分子量。

1.2.3 刺梨多糖溶液的配制 稱取1 g刺梨多糖溶于20 mL去離子水中，配置質(zhì)量濃度為50 mg/mL的刺梨多糖溶液。

1.2.4 分組、建模與給藥

(1) 分組：按體質(zhì)量大小采用區(qū)組化分組的方法，分為正常對照組(NC)、模型組(M)、陽性對照組(PC)、低劑量刺梨多糖組(SM)、高劑量刺梨多糖組(HM)，每組10只。

(2) 建模：參照張曉圓等[10]高脂飼料誘導(dǎo)大鼠肥胖胰島素抵抗方法建模，以口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)為基準(zhǔn)，計算曲線下面積(AUC)，以AUC高于NC組AUC均值為IR造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

(3) 給藥：參照《實(shí)驗(yàn)動物學(xué)》中人與動物劑量的換算標(biāo)準(zhǔn)，SM組、HM組分別以100，200 mg/kg的劑量灌胃刺梨混懸液，NC組、M組以SM組劑量灌胃0.9% NaCl溶液，PC組以0.11 g/kg的西格列他鈉片(常人用量為32 mg/d，通過體表面積法換算SD大鼠等效劑量約為2.82 mg/d)溶解灌胃，每天1次，直至第12周次末。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 大鼠體質(zhì)量的測量 試驗(yàn)期間，每周專人定時用分度值為0.1 g秤稱量大鼠體質(zhì)量。

1.3.2 大鼠血清脂代謝指標(biāo)和氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定

12周末大鼠禁食12 h，麻醉下腹部主動脈取血3 mL，離心、分離血清，-20 ℃冰箱保存。取待測血清，比色法檢測血清TC、TG的含量、黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD的活性、微量酶標(biāo)法測定血清GSH的濃度，硫代巴比妥酸法測定血清MDA含量。

1.3.3 大鼠血清葡萄糖、胰島素含量的測定 取待測血清，以葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(FBG)值，酶聯(lián)免疫吸附法檢測空腹胰島素(FINS)的含量，按試劑盒說明進(jìn)行測試。按式(1)[11]計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。

HOMA-IR=FBG×FINS/22.5，

(1)

式中：

HOMA-IR——胰島素抵抗指數(shù)；

FBG——空腹血糖值，mmol/L；

FINS——空腹胰島素含量，mU/L。

1.3.4 骨骼肌組織中PI3K、GLUT4蛋白表達(dá)的檢測

采用蛋白免疫印跡(Western blot)法。用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取腓腸肌組織蛋白，二辛可寧酸(BCA)法測各組待測液蛋白濃度，稀釋到相同濃度，蛋白定量后加上述混合液，按照分離膠為12%、積層膠為4%的SDS-PAGE電泳(120 V，35 min)、轉(zhuǎn)膜(70 V，60 min)，5%脫脂奶粉于37 ℃封閉2 h，置一抗稀釋液中4 ℃孵育24 h，TBST洗膜，滴加HRP標(biāo)記的二抗室溫下孵育1 h，以增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑曝光，在WD-9413型凝膠成像系統(tǒng)顯影，測量目的蛋白條帶的積分光密度。

1.3.5 骨骼肌組織PI3K、GLUT4mRNA表達(dá)的檢測

采用實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法。用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取腓腸肌組織蛋白，Trizol法提取總的RNA，單樣本以2 μg RNA作為初始模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照魏祎[12]設(shè)計的基因引物序列(表1)，按照試劑盒說明配置20 μL的反應(yīng)體系，每組樣本檢測3個復(fù)孔，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR。預(yù)變性95 ℃、30 s，PCR 95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個循環(huán)，根據(jù)各反應(yīng)孔Ct值，以2-△△Ct法分析基因的相對表達(dá)量。

表1 實(shí)時PCR基因引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 刺梨多糖組分、含量和相對分子量

對多糖組分進(jìn)行鑒定，經(jīng)稱量計算PRR-1、PRR-2、PRR-3、PRR-4的得率分別為9.38%，6.57%，22.41%，2.98%(粗多糖干重計)，其中PRR-3為分離純化得到的主要組分。根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即Y=3.956x-0.007 8，R2=0.999 7，計算出PRR-3總糖含量為86.4%，且單糖組分主要為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖等中性單糖。建立PRR-3相對分子量與出峰時間(x)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Mw=-0.000 8x3+0.069 8x2-2.169 2x+27.963 1，R2=0.997 1，經(jīng)分析計算PRR-3的相對分子量大小為56.8 kDa。由于PRR-3分離效果較好，且純度較高，所以后續(xù)以PRR-3為研究對象。

2.2 刺梨多糖PRR-3干預(yù)前后各組大鼠體質(zhì)量和血清脂代謝指標(biāo)的變化

長期高脂膳食干擾脂質(zhì)代謝、能量代謝及腸道微生態(tài)，觸發(fā)脂代謝異常，導(dǎo)致肥胖[13]。由圖1、表2可知，各組大鼠初始體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，試驗(yàn)期間M組體質(zhì)量均顯著高于NC組(P<0.01)，經(jīng)刺梨多糖干預(yù)后，與M組相比，SM組體質(zhì)量顯著下降(P<0.05)，TG、TC含量顯著下降(P<0.05)；HM組體質(zhì)量顯著下降(P<0.01)，TG、TC含量顯著下降(P<0.01)，且HM組療效好于SM組，接近于PC組。已有研究[14]表明，刺梨多糖可通過降低全身低度系統(tǒng)性炎癥，改善脂代謝紊亂，減少脂肪的儲存，降低體質(zhì)量。試驗(yàn)中，不同劑量的刺梨多糖干預(yù)后，各組大鼠均出現(xiàn)體質(zhì)量和TG、TC含量的下降，且與陽性藥物西格列他鈉組具有相似的效果。西格列他鈉是中國新一代胰島素增敏劑類候選藥物、國家1類新藥，臨床顯現(xiàn)出良好的綜合治療效果及臨床安全性特征[15]。說明PRR-3能通過降低炎癥從而調(diào)節(jié)脂代謝，減少脂肪過多儲存，有效降低IR大鼠體質(zhì)量。

**與NC組比較P<0.01；#與M組比較P<0.05;##與M組比較P<0.05

表2 各組大鼠體質(zhì)量和血清脂代謝指標(biāo)的變化?

2.3 刺梨多糖PRR-3干預(yù)后各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化

肥胖可觸發(fā)代謝異常，引起免疫細(xì)胞激活和浸潤，誘發(fā)炎癥，觸發(fā)過氧化應(yīng)激[16]。由表3可知，M組與NC組相比具有顯著性差異(P<0.01)，經(jīng)刺梨多糖干預(yù)后能顯著提高SOD的活性(P<0.01)、GSH的濃度(P<0.01)和降低MDA的含量(P<0.01)，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。主要原因可能與多糖的結(jié)構(gòu)成分有關(guān)。研究[17]顯示，植物多糖結(jié)構(gòu)多糖環(huán)上的羥基可與產(chǎn)生羥自由基等必需的金屬離子(Fe2+、Cu2+)發(fā)生絡(luò)合，使其不能產(chǎn)生啟動脂質(zhì)過氧化的羥自由基或不能分解脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的脂過氧化物，抑制活性氧的生成，發(fā)揮抗氧化作用。PRR-3屬于植物多糖中的組分，具有植物多糖的結(jié)構(gòu)成分，所以說PRR-3也具有抗氧化作用。

表3 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化?

2.4 刺梨多糖PRR-3干預(yù)后各組大鼠血清葡萄糖、胰島素水平的變化

生理狀態(tài)下，胰島素可通過對葡萄糖的攝入和抑制肝糖原的輸出等措施調(diào)控血糖的穩(wěn)定。由表4可知，M組與NC組相比，血糖水平、胰島素含量和胰島素抵抗指數(shù)方面均有顯著性差異(P<0.01)。與M組相比，刺梨多糖干預(yù)后的IR大鼠血清水平顯著降低(P<0.01)，胰島素含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，胰島素抵抗指數(shù)也顯著降低(P<0.01)，且組間呈劑量效應(yīng)關(guān)系，效果與陽性對照組相當(dāng)。陳超等[14]指出刺梨活性成分(刺梨總多糖提取物)可通過調(diào)節(jié)胰島素改善糖尿病小鼠糖代謝紊亂。汪洋等[18]采用體外化學(xué)和細(xì)胞試驗(yàn)評價了刺梨多糖的降血糖活性。研究結(jié)果與陳超等[14]和汪洋等[18]的具有一致性。PRR-3具有調(diào)控胰島素分泌、調(diào)節(jié)血糖代謝異常等功能。其原因可能是PRR-3抗氧化作用減輕胰腺組織炎癥，提升了胰腺的調(diào)控能力，降低胰島素的分泌，增加胰島素敏感性。

表4 各組大鼠血清FBG、FINS和HOMA-IR的變化?

2.5 刺梨多糖PRR-3干預(yù)后各組大鼠骨骼肌PI3K、GLUT4基因和蛋白相對表達(dá)的變化

PI3K是骨骼肌介導(dǎo)葡萄糖進(jìn)入肌纖維內(nèi)的關(guān)鍵性激酶，可調(diào)節(jié)胰島素信號通路上游因子，調(diào)控骨骼肌GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)[19]。由圖2、圖3可知，M組骨骼肌組織中PI3K、GLUT4mRNA和蛋白表達(dá)與NC組相比具有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。炎癥是胰島素抵抗發(fā)生的重要原因之一，Rosca等[20]指出炎性因子可通過自分泌或旁分泌等方式影響核因子等信號途徑，誘發(fā)胰島素抵抗加劇，與研究結(jié)果一致。經(jīng)刺梨多糖干預(yù)后的大鼠骨骼肌中PI3K、GLUT4mRNA和蛋白表達(dá)都升高，與M組相比有顯著差異(P<0.05或P<0.01)，與陽性藥物組作用相當(dāng)，且效果存在劑量關(guān)系。說明PRR-3可上調(diào)IR大鼠骨骼肌組織中PI3K、GLUT4mRNA和蛋白表達(dá)，提升GLUT4的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)。

*與NC組比較P<0.05；#與M組比較P<0.05

**與NC組比較P<0.01；#與M組比較P<0.05，##與M組比較P<0.01

3 結(jié)論

刺梨多糖主要活性成分為0.2 mol/L NaCl洗脫組分，具有抗氧化作用，能夠降低胰島素抵抗大鼠體質(zhì)量、調(diào)節(jié)糖脂代謝，改善胰島素抵抗，其機(jī)制可能是通過介導(dǎo)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4信號通路提升葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4實(shí)現(xiàn)的。試驗(yàn)中僅對刺梨多糖進(jìn)行了提取并測定其含量和分子量，未對0.2 mol/L NaCl洗脫組分的分子結(jié)構(gòu)、構(gòu)效關(guān)系及0.2 mol/L NaCl洗脫組分通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4信號通路提升葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4，轉(zhuǎn)運(yùn)改善胰島素抵抗的具體機(jī)制進(jìn)行分析，這是后續(xù)將要研究的內(nèi)容。