乳酸菌發(fā)酵茶花粉對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

羅粵鵬 楊遠(yuǎn)帆,2,3 于洋君 何君竹 伍 菱,2,3

(1. 集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2. 福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021; 3. 廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

抑制α-葡萄糖苷酶活性是控制餐后血糖及降低糖尿病的重要手段[1]。蜂花粉是蜜蜂采集的花粉與蜜蜂特殊的腺體分泌物天然凝集形成的一種不規(guī)則扁圓混合物，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素和多酚等活性成分[2]，具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，能夠有效控制餐后血糖升高，達(dá)到延緩和控制糖尿病的效果[3]，使用蜂花粉抑制α-葡萄糖苷酶是近年來的熱點(diǎn)研究[4]。

蜂花粉包括茶花粉、荷花粉、油菜花粉和玉米花粉等，其中茶花粉是中國(guó)大宗蜂花粉之一，營(yíng)養(yǎng)豐富、功效全面，備受消費(fèi)者青睞，其還原糖含量為36.25%，蛋白質(zhì)含量為31.53%，脂肪含量為7.27%，多酚、黃酮含量豐富[5-6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，蜂花粉表層具有堅(jiān)固的花粉壁，壁上的萌發(fā)孔通常為封閉狀態(tài)，導(dǎo)致花粉細(xì)胞中活性成分難以溶出，造成花粉活性物質(zhì)的生物利用率較低。此外，蜂花粉中還存在風(fēng)媒花粉、昆蟲唾液中的蛋白質(zhì)及霉菌等致敏性物質(zhì)，導(dǎo)致易敏人群產(chǎn)生花粉過敏癥，制約蜂花粉的質(zhì)量安全[8]。目前提高花粉活性物質(zhì)生物利用度的研究方法主要有粉碎破壁法[9]、酶處理法[10]及微生物發(fā)酵法[11]等，其中微生物發(fā)酵法發(fā)酵條件溫和、高效、容易操作、安全性高，能夠在發(fā)酵過程中產(chǎn)生分泌酶，通過酶的作用打通花粉壁的萌發(fā)孔，促進(jìn)生物活性物質(zhì)的溶出。同時(shí)，微生物發(fā)酵可通過代謝水解蛋白質(zhì)過敏原，減少或消除食物過敏原[12]。因此，微生物發(fā)酵是提高蜂花粉活性及降低其致敏性的重要方法。

乳酸菌是能從碳水化合物發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的一類細(xì)菌的總稱，主要包括乳桿菌屬、雙歧桿菌屬及乳球菌屬等[13]，目前被廣泛應(yīng)用于乳制品、果蔬發(fā)酵制品及釀酒工業(yè)中[14]。Vilma等[15]研究表明，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵蜂花粉對(duì)于花粉中的酚類化合物具有顯著的促進(jìn)作用。Sun等[16]認(rèn)為微生物發(fā)酵水解植食性植物原料后，其酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性的改變可能受到微生物種類、發(fā)酵溫度及原料種類等多種因素的影響。課題組[6]前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌發(fā)酵后，茶花粉的水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的 IC50值由49.09 mg/mL降至38.79 mg/mL，表明乳酸菌發(fā)酵后的茶花粉能提高α-葡萄糖苷酶抑制活性。王聰?shù)萚17]采用蜂糧來源的乳酸菌Lactobacillussp. strain 2-3發(fā)酵油菜花粉，在最優(yōu)感官評(píng)分發(fā)酵條件下其總酚含量和DPPH自由基清除能力相較于對(duì)照組顯著提高，楊文超等[18]以乳酸菌活菌數(shù)和感官評(píng)分為試驗(yàn)指標(biāo)優(yōu)化蜂花粉的發(fā)酵工藝，優(yōu)化后其適口性得到改善。目前以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)的蜂花粉發(fā)酵工藝優(yōu)化研究尚未見報(bào)道。

研究擬以茶花粉為原料，考察復(fù)合乳酸菌粉(干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、青春雙歧桿菌、乳雙歧桿菌)接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響，旨在為發(fā)酵法提高茶花粉對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

茶花粉：北京市華林蜂業(yè)有限公司；

α-葡萄糖苷酶(G0660-750UN)、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)：美國(guó)Sigma公司；

磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

復(fù)合乳酸菌菌粉[1×1010CFU/g，包括干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、嗜酸乳桿菌(LactobacillusAcidophilus)、鼠李糖乳桿菌(LactobacillusRhamnosus)、嬰兒乳桿菌(Bifidobacteriuminfantis)、青春雙歧桿菌(BifidobacteriumAdolensentis)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)]：陜西森弗天然制品有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

分析天平：BS223型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

高速萬能粉碎機(jī)：FW80型，天津市泰斯特儀器有限公司；

分光光度計(jì)：Unico?7200型，上海尤尼柯儀器有限公司；

臺(tái)式離心機(jī)：TDL-40B型，上海飛鴿儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶花粉發(fā)酵工藝 茶花粉低溫干燥后，粉碎過80目篩備用，準(zhǔn)確稱取茶花粉2.0 g，以料液比(m茶花粉∶V無菌水)1∶20 (g/mL)加入無菌水，115 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至室溫，接種一定比例的乳酸菌菌粉進(jìn)行發(fā)酵， 100 ℃滅菌，5 000 r/min 離心20 min，取上清液[6]。

1.2.2 乳酸菌接種量對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響 固定發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間3 d，考察乳酸菌菌粉接種量(0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響。

1.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響 固定乳酸菌菌粉接種量0.8%，發(fā)酵時(shí)間3 d，考察發(fā)酵溫度(28，31，34，37，40 ℃)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響。

1.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響 固定乳酸菌接種量0.8%，發(fā)酵溫度37 ℃，考察發(fā)酵時(shí)間(1，2，3，4，5 d)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化 以乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為試驗(yàn)因素，應(yīng)用Design-Expert 8.06軟件中Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定乳酸菌發(fā)酵茶花粉的最適工藝條件。

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定 參照Qi等[19]的方法。按式(1)計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率。

(1)

式中：

R——α-葡萄糖苷酶抑制率，%；

a——樣品組吸光度值；

b——樣品空白組吸光度值；

c——對(duì)照組吸光度值；

d——空白組吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件制圖，采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析，所有試驗(yàn)平行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌接種量對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖1可知，隨著乳酸菌接種量的增加，茶花粉發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率先增大后減小，并在添加量接近0.8%時(shí)達(dá)最高。當(dāng)乳酸菌接種量為1.0%時(shí)，抑制率顯著降低，是由于發(fā)酵體系中的葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以提供乳酸菌生長(zhǎng)所需要的能量，導(dǎo)致乳酸菌生長(zhǎng)變慢。因此，乳酸菌適宜接種量確定為0.8%左右。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，茶花粉發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，抑制率高達(dá)35.28%。因此，適宜發(fā)酵溫度為37 ℃左右。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

由圖3可知，茶花粉發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率隨發(fā)酵時(shí)間的增加先升高后下降。發(fā)酵第3天的抑制率最高(為36.61%)，比未發(fā)酵的提高了92.48%。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間>3 d時(shí)，抑制率隨發(fā)酵時(shí)間的增加而逐漸降低，與韓瑨等[20]的結(jié)果相似，因此適宜的發(fā)酵時(shí)間為3 d左右。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間為響應(yīng)因素，進(jìn)一步采用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)，以α-葡萄糖苷酶抑制率作為響應(yīng)值，對(duì)乳酸菌發(fā)酵茶花粉工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)多元回歸擬合得到α-葡萄糖苷酶抑制率(Y)與各因素的回歸方程為：

Y=38.46+3.56A+2.40B+2.38C+1.22AB+5.10AC-1.84BC-4.23A2-10.28B2-9.38C2。

(2)

表3 方差分析結(jié)果?

由圖4可知，各響應(yīng)曲面向下且頂點(diǎn)均在試驗(yàn)水平范圍之內(nèi)，說明α-葡萄糖苷酶抑制率最強(qiáng)的優(yōu)化條件在試驗(yàn)的水平范圍內(nèi)。所有響應(yīng)面圖皆呈凸面體，表明各因素水平的選擇范圍較合理，且乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用均呈先增大后減小的趨勢(shì)。其中，乳酸菌接種量對(duì)應(yīng)的變化曲面較發(fā)酵溫度的更陡峭，說明乳酸菌接種量比發(fā)酵溫度對(duì)抑制率的影響更顯著。乳酸菌接種量對(duì)應(yīng)的變化曲面比發(fā)酵時(shí)間對(duì)應(yīng)的更陡峭，說明乳酸菌接種量比發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑制率的影響更顯著。發(fā)酵溫度的變化曲面比發(fā)酵時(shí)間的更陡峭，說明發(fā)酵溫度相較于發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑制率的影響更顯著。

圖4 各因素交互作用對(duì)抑制率的影響

乳酸菌接種量與發(fā)酵溫度的交互作用顯著(P<0.05)，兩因素間存在促進(jìn)作用；乳酸菌接種量與發(fā)酵時(shí)間的交互作用極顯著(P< 0.01)；發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度的等高線圖接近于圓形，表明這兩個(gè)因素的交互作用對(duì)抑制率影響不顯著，兩因素間無明顯促進(jìn)作用，與方差分析結(jié)果相符。

2.5 最佳發(fā)酵工藝的確定及驗(yàn)證

利用Design-Expert 8.0.6軟件分析優(yōu)化得到最佳條件為乳酸菌接種量0.92%、發(fā)酵溫度37.38 ℃，發(fā)酵時(shí)間3.28 d，α-葡萄糖苷酶抑制率預(yù)測(cè)值為40.03%。為滿足實(shí)際操作條件，選取最適發(fā)酵工藝為乳酸菌添加量為0.9%，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間3 d，此時(shí)茶花粉發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為38.97%(n=3)，是未發(fā)酵茶花粉的3.11倍，與預(yù)測(cè)值誤差較小，說明以Box-Behnken試驗(yàn)方案優(yōu)化所得的發(fā)酵工藝參數(shù)具有較高的可靠性。Sha等[23]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，發(fā)酵蜂花粉組酚類化合物含量增加了9.3%。Zhang等[24-25]研究表明發(fā)酵提高了蜂花粉中酚類物質(zhì)種類和含量，其中，具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的根皮素含量增加了3倍。因此，優(yōu)化條件下茶花粉發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制率遠(yuǎn)大于未發(fā)酵茶花粉，可能是茶花粉發(fā)酵液中對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用的物質(zhì)大量積累所致，但對(duì)于影響α-葡萄糖苷酶抑制率的物質(zhì)需進(jìn)一步研究和鑒定。

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，乳酸菌接種量對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響最大，其次是發(fā)酵溫度。發(fā)酵茶花粉的最優(yōu)工藝條件為乳酸菌接種量0.9%、發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間3 d，該條件下茶花粉發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為38.97%，是未發(fā)酵茶花粉的3.11倍。后續(xù)可對(duì)乳酸菌發(fā)酵茶花粉引起α-葡萄糖苷酶抑制活性增強(qiáng)的具體物質(zhì)進(jìn)行探索。