BALB/c小鼠多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌肺部感染模型的建立和評(píng)估

柴媛，王俊瑞，英蘭，王繼春，朝魯門其其格

1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護(hù)病房， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050； 2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050； 3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)第四醫(yī)院病理科， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110； 4. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii，A.baumannii)作為機(jī)會(huì)性致病菌是戰(zhàn)爭傷的常見病原菌，易導(dǎo)致危重患者呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、腦膜炎和菌血癥[1-2]。它是醫(yī)院感染中多重耐藥菌ESKAPE群的成員[3]，盡管表現(xiàn)為低毒力[4]，但對(duì)亞胺培南、美羅培南等抗生素明顯耐藥，致使感染者死亡率上升[5-7]。鮑曼不動(dòng)桿菌通過形成生物膜、黏附和侵入細(xì)胞以及獲取鐵而致病，致病性依賴外膜蛋白等毒力因子，故認(rèn)為其毒力和致病性隨抗生素、致病因子和宿主免疫反應(yīng)等多種條件而變化。本研究在評(píng)估攜帶不同毒力基因譜多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株的基礎(chǔ)上，選用攜帶毒力基因多、致病力強(qiáng)的菌株構(gòu)建免疫抑制小鼠肺炎模型，觀察肺炎進(jìn)程及炎癥介質(zhì)變化，旨在建立易操作、成本低、重復(fù)性好的小鼠肺炎模型，分析其感染或致病特征，為解釋鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎的發(fā)病機(jī)制及致病原因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑與儀器如下。DNA提取盒、引物、MasterMix、染料、DNA Marker購自天根生化科技(北京)有限公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖購自美國Genetech公司；TAE緩沖液購自Thermo公司；N2野生型秀麗隱桿線蟲、尿嘧啶缺陷型大腸埃希菌OP50購自上海南方模式生物科技股份有限公司；線蟲生長培養(yǎng)基(nematode growth medium，NGM)的配制參考相應(yīng)文獻(xiàn)[8]、線蟲M9緩沖液、瓊脂粉、蛋白胨購自Sino公司；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)購自北京百靈威科技有限公司；舒泰購自北京寵必威生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購自北京索萊寶科技有限公司；血平板購自天津市金章科技發(fā)展有限公司；細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自泉州市科諾迪生物科技有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀購自北京領(lǐng)宇科技有限公司；電泳儀、Gel DocXR+凝膠成像分析系統(tǒng)購自北京六一生物科技有限公司；DENSIMAT麥?zhǔn)媳葷醿x購自法國梅里埃公司；魚躍超聲霧化器420B購自江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；邁瑞B(yǎng)C-5000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；離心機(jī)、病理切片機(jī)HM325購自美國Thermo公司；Nexcope NE950正置熒光顯微鏡購自寧波永新光學(xué)股份有限公司；萊特體視顯微鏡LS745購自廣州市萊特光電技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)雄性BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，6～8周齡，體重18～20 g，已通過動(dòng)物福利倫理認(rèn)證[許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006]。小鼠自由進(jìn)食，飲無菌水，于溫度18～25 ℃、濕度50%～70%、光照與黑暗交替12 h的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)于中國疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

1.3.1 菌株復(fù)核和耐藥性檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌A4株分離自腦出血患兒腦脊液標(biāo)本，A5株分離自病毒性腦炎患兒下呼吸道分泌物標(biāo)本。采用micro-Typer MALDI-TOF質(zhì)譜儀(江蘇天瑞儀器股份有限公司)對(duì)A4株和A5株進(jìn)行鑒定。依據(jù)CLSI M100-S28 藥敏指南，利用微量肉湯稀釋法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性。

1.3.2 毒力基因檢測(cè)采用DNA試劑盒提取A4、A5株DNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為 25 μL，包括MasterMix 12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、DNA模板1 μL、蒸餾水 10.5 μL。引物序列、產(chǎn)物長度及反應(yīng)條件[9]如表1所示。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(180 V，20 min)，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，結(jié)果通過美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網(wǎng)站Blast比對(duì)分析。

表1 PCR所用引物序列和反應(yīng)條件

1.3.3 菌液配制將鮑曼不動(dòng)桿菌接種于血平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h復(fù)蘇，傳代過夜。挑取血平板表面生長的菌落，充分混于50 mL體積分?jǐn)?shù)為0.9% NaCl中，用比濁儀將菌液密度調(diào)至3 Mcfarland(109CFU/mL)，梯度稀釋至1/10(108CFU/mL)備用。

1.3.4 篩選建模菌株選取2株攜帶不同毒力基因的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(A4和A5株)感染秀麗隱桿線蟲，觀察毒力基因差異是否影響菌株毒力，從而選取建模菌株，實(shí)驗(yàn)基本流程參考文獻(xiàn)[28]。將20只小鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，所有小鼠連續(xù)2 d每日腹腔注射CTX 3 mg。3 d后，2組小鼠分別腹腔注射108CFU/mL的A4、A5株菌液各0.5 mL，正常喂養(yǎng)7 d，選取致死劑量最大的菌株用于建模。

1.4 小鼠肺部感染模型制備

將45只小鼠飼喂3 d適應(yīng)環(huán)境后，連續(xù)2 d每只小鼠腹腔注射3 mg CTX，再飼喂3 d，建立免疫抑制，隨機(jī)分為高密度(109CFU/mL)組、低密度(108CFU/mL)組與對(duì)照組，每組15只。小鼠腹腔注射舒泰1 mg/只麻醉后，放入30 cm×15 cm×20 cm的密閉塑料盒，墊高頸部，入口連接霧化管，出口連接活性炭收集殘余氣體。分別將高密度菌液、低密度菌液以及生理鹽水(對(duì)照組)各50 mL置于霧化器中霧化30 min(小鼠平均呼吸頻率120次/min，平均潮氣量0.15 mL)，速度2 mL/min，高、低密度組霧化吸入細(xì)菌接種量約分別為3×109CFU/只、3×108CFU/只，霧化后豎立小鼠。所有操作在生物安全柜中進(jìn)行。

1.5 小鼠體重及狀態(tài)監(jiān)測(cè)

每日正常飼喂小鼠并稱重，間隔4 h 觀察小鼠精神、活動(dòng)等情況，若死亡則記錄并解剖。根據(jù)小鼠狀態(tài)評(píng)分(0～-5分)。0分：正常，活動(dòng)佳且健康；-1分：精神反應(yīng)略差，被毛略粗糙；-2分：精神反應(yīng)差，被毛粗糙，呼吸促，行動(dòng)少；-3分：精神反應(yīng)極差，嗜睡，被毛粗糙，行動(dòng)很少，蜷縮，閉眼；-4分：瀕死狀態(tài)；-5分：死亡。

1.6 外周血常規(guī)指標(biāo)及細(xì)胞因子檢測(cè)

于霧化后0、24、48、72和96 h，每組隨機(jī)取3只小鼠行眼眶靜脈叢采血2份，一份行全血細(xì)胞分析，另一份 1 000 g 離心20 min，取血清于-20 ℃冷藏，檢測(cè)血清白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)水平。

1.7 肺組織形態(tài)、細(xì)菌定量及肺組織蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色

取血后將小鼠處死，無菌條件下取小鼠肺組織并觀察，結(jié)扎右主支氣管，將0.5 mL 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)注入左肺緩慢沖洗3次，回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。將左肺剪碎，加2 mL PBS充分研磨，70 μm濾膜過濾，用無菌PBS進(jìn)行10倍稀釋。各取100 μL BALF及肺組織勻漿，均勻平涂于血平板，置37 ℃培養(yǎng)18 h，計(jì)菌落數(shù)。無菌操作條件下將小鼠右肺固定，石蠟包埋，連續(xù)5 μm切片，進(jìn)行HE染色，鏡檢。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mean±SD表示，采用方差分析，P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A4株和A5株的耐藥特點(diǎn)及毒力基因檢測(cè)

A4株和A5株對(duì)頭孢曲松、頭孢唑林、頭孢吡肟、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、阿米卡星、磺胺甲惡唑+甲氧芐啶(復(fù)方新諾明)、亞胺培南、美羅培南均耐藥，均為多重耐藥株；對(duì)替加環(huán)素均敏感。菌株毒力基因檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2 A4株和A5株的毒力基因檢測(cè)結(jié)果

2.2 篩選A5株作為建模菌株

用A4株和A5株感染秀麗隱桿線蟲，結(jié)果顯示，菌液密度為109CFU/mL時(shí)，感染A5株的線蟲于第5天出現(xiàn)死亡，感染A4株的線蟲于第5天僅為僵直，于第9天出現(xiàn)死亡。菌液密度為108CFU/mL時(shí)，感染A5株的線蟲于第8天出現(xiàn)死亡，而感染A4株的線蟲在觀察期內(nèi)無死亡。用相同菌液密度感染小鼠時(shí)，感染A4株的小鼠1 d后被毛粗糙，眼裂減小，刺激后活動(dòng)差，7 d后死亡7只；而感染A5株的小鼠1 d后閉眼不動(dòng)，呼吸快，嗜睡，7 d后均死亡(見表3)。在同等菌量感染條件下，A5株致線蟲死亡更早且小鼠死亡數(shù)最多，故選毒力更強(qiáng)的自下呼吸道分離的A5株作為建模菌株。

表3 A4株和A5株致小鼠死亡情況

2.3 小鼠肺部感染A5株后體重及狀態(tài)隨時(shí)間的變化

感染A5株后小鼠的體重減輕。與對(duì)照組相比，從0 h起感染A5株的小鼠體重減輕，24 h達(dá)最低，之后回升，高密度組比低密度組體重減輕更為明顯。感染A5株后小鼠狀態(tài)變差：呼吸急促，被毛粗糙，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，24 h最差，之后好轉(zhuǎn)；高密度組較低密度組狀態(tài)更差，呈蜷縮，閉眼，瀕死狀態(tài)，并死亡1只(見圖1)。

A: before immunization; B: 1 d after immunization; C: 2 d after immunization; D, E, F, G and H: 0, 24, 48, 72 and 96 h after infection.

2.4 接種菌株密度對(duì)小鼠肺組織病理的影響

健康小鼠肺組織光澤好，呈淡粉色(見圖2a)。免疫抑制后對(duì)照組小鼠肺組織略充血(見圖2A)。感染A5株后24 h，小鼠肺組織明顯腫脹充血，顏色晦暗伴融合出血，高密度組肺邊緣較低密度組腫脹嚴(yán)重，呈灰白色(見圖2B、2b)。隨著感染進(jìn)程延長，肺組織逐步好轉(zhuǎn)，充血腫脹減輕，色澤恢逐漸復(fù)(見圖2c、2d、2e、2C、2D、2E)。

a: healthy mice; A: control group; b, c, d and e: lung tissues of mice infected with A5 strain for 24, 48, 72 and 96 h in low density group; B, C, D, and E: lung tissues of mice infected with A5 strain for 24, 48, 72 and 96 h in high density group.

免疫抑制后小鼠肺支氣管壁略厚(見圖3A)。感染后24、48 h肺支氣管壁較對(duì)照組明顯增厚，白細(xì)胞浸潤，單核細(xì)胞滲出并間質(zhì)充血水腫，高密度組小鼠肺組織炎性改變較低密度組更明顯(見圖3b、3c、3B、3C)；48 h后肺組織改變逐漸好轉(zhuǎn)(見圖3d、3e、3D、3E)。

a: healthy mice; A: control group; b, c, d and e: HE staining results of lung tissues of mice infected with A5 strain for 24, 48, 72 and 96 h in low density group; B, C, D, and E: HE staining results of lung tissues of mice infected with A5 strain for 24, 48, 72 and 96 h in high density group.

2.5 不同密度A5株感染后小鼠肺組織與BALF中菌落計(jì)數(shù)的差異

A5株感染小鼠后在BALF和肺組織內(nèi)大量增殖，于0、24 h達(dá)高峰，均>5 logCFU/mL，顯著高于對(duì)照組。感染早期，高密度組小鼠肺組織及BALF中CFU計(jì)數(shù)顯著高于低密度組；隨著時(shí)間推移，高、低密度組小鼠肺組織及BALF中CFU計(jì)數(shù)明顯下降(見表4)。

表4 小鼠肺組織及BALF中菌落計(jì)數(shù)(logCFU/mL，mean±SD)

2.6 不同密度A5株感染后小鼠外周血白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的差異

高、低密度組小鼠感染A5株后24 h外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)開始增高，96 h達(dá)高峰，顯著高于對(duì)照組；高密度組白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)顯著高于低密度組(見表5)。

表5 小鼠感染A5株后白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L，mean±SD)

2.7 不同密度A5株感染小鼠后外周血IL-6和TNF-α水平表達(dá)差異

與對(duì)照組相比，高、低密度組小鼠感染A5株后血清IL-6水平升高并趨向穩(wěn)定；而TNF-α水平持續(xù)升高，低密度組在72 h達(dá)高峰，于96 h出現(xiàn)下降，高密度組在96 h達(dá)高峰，且低密度組TNF-α整體水平高于高密度組(見表6)。

表6 小鼠感染A5株后外周血IL-6和TNF-α水平(pg/mL，mean±SD)

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌在呼吸道等部位長期定植，常引起下呼吸道感染[10-11]，其多重耐藥特性極大增加了臨床治療的難度[12-13]。2021年CHINET監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為71.5%和72.3%。本研究選取的鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株對(duì)包括美羅培南、亞胺培南等在內(nèi)的多種抗菌藥物耐藥。體外研究證實(shí)，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)呼吸道A549上皮細(xì)胞具有明顯的毒力[14]，還可刺激和活化巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子[15-16]。因此，須建立一個(gè)動(dòng)物模型探究鮑曼不動(dòng)桿菌體內(nèi)致病過程，以進(jìn)一步闡明其感染機(jī)制。

鮑曼不動(dòng)桿菌為條件性致病菌，常感染免疫力低下人群，免疫功能正常的動(dòng)物不易感。因此，可通過注射CTX破壞細(xì)胞DNA、阻滯淋巴細(xì)胞增殖抑制小鼠免疫功能，從而增加建模成功率。本研究中，免疫抑制小鼠體重減低，外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞減少，但不影響其生存率，與Manepalli等[17]報(bào)道的一致。當(dāng)然，免疫抑制會(huì)影響細(xì)菌對(duì)正常小鼠的毒力特征，因此本研究結(jié)果僅適用于免疫抑制的BALB/c小鼠。選擇霧化吸入建立肺部感染模型出于如下考慮：經(jīng)氣道直接接種的方法可保證菌量相對(duì)精確[18]，但創(chuàng)傷大，操作難；滴鼻法感染成功率高，但易造成小鼠誤吸導(dǎo)致窒息[19]。本研究選用超聲霧化，通過模擬機(jī)體吸入的過程來保證吸入肺部的菌量恒定。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)選用不同密度的鮑曼不動(dòng)桿菌感染小鼠，結(jié)果顯示密度過高會(huì)導(dǎo)致小鼠過早死亡，達(dá)不到觀察要求，而密度過低又很難使小鼠呈現(xiàn)感染狀態(tài)。鑒于鮑曼不動(dòng)桿菌為條件性致病菌，本研究選用108CFU/mL和109CFU/mL兩個(gè)感染密度進(jìn)行建模。

本研究在篩選鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株時(shí)發(fā)現(xiàn)，分離自不同部位的菌株A4和A5均攜帶毒力基因cvaC、iutA、papC和ibeA，而csfA、sfa/focDE基因僅存在于A5株。研究顯示，cvaC、papC和csfA與鮑曼不動(dòng)桿菌菌毛形成相關(guān)，其中csfA是參與菌毛形成的主要亞基[20-22]。iutA通過鐵載體需氧肌動(dòng)蛋白參與鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜的合成[21]，iutA及cvaC是鮑曼不動(dòng)桿菌致病的主要非黏附性毒力基因[20-22]。sfa/focDE和ibeA則通過參與鮑曼不動(dòng)桿菌定植及形成生物膜等過程增強(qiáng)其致病力[23]。本研究檢測(cè)的9個(gè)毒力基因中，A5株毒力基因攜帶率高于A4株。將A4株和A5株感染線蟲，發(fā)現(xiàn)高感染密度致線蟲死亡早，密度相同時(shí)A5株致線蟲死亡早，與小鼠致死性測(cè)定的結(jié)果一致。提示A5株毒力更強(qiáng)，故將A5株作為實(shí)驗(yàn)菌株。

本研究顯示，感染A5株后小鼠體重較對(duì)照組明顯減輕，精神狀態(tài)變差，甚至死亡。小鼠肺組織于24 h 呈明顯充血水腫，且感染密度越高肺腫脹程度越重，與Yershov等[24]建立的肺部感染模型一致。小鼠肺組織及BALF中菌落計(jì)數(shù)均>1×105CFU/mL，與既往研究相符[25]。小鼠的臨床表現(xiàn)、病理結(jié)果及菌落計(jì)數(shù)結(jié)果充分表明，小鼠感染A5株可發(fā)生肺炎。但不足之處在于未進(jìn)行小鼠外周血菌落計(jì)數(shù)，因而不能準(zhǔn)確獲得同時(shí)段外周血中A5株的分布特征。

同時(shí)，本研究利用外周血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)感染程度。感染A5株的小鼠白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在24 h較對(duì)照組升高，高密度組高于低密度組。結(jié)合小鼠肺及BALF中菌落計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，接種A5株后鮑曼不動(dòng)桿菌顯著增殖，小鼠肺內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集增多，釋放大量的活性氧，造成廣泛的組織損傷，與Lee等[26]的研究結(jié)果一致。在整個(gè)誘導(dǎo)免疫的過程中，小鼠感染A5株的密度越高，炎癥程度越重，與菌株篩選時(shí)感染A5株的密度越高線蟲死亡越早相一致。隨著時(shí)間的延長，小鼠清除細(xì)菌的免疫應(yīng)答能力逐步恢復(fù)，炎性細(xì)胞大量增加，肺及BALF中鮑曼不動(dòng)桿菌被清除，小鼠肺部癥狀減輕，狀態(tài)好轉(zhuǎn)。

通過檢測(cè)IL-6和TNF-α水平進(jìn)一步評(píng)價(jià)小鼠感染A5株后的炎性反應(yīng)。既往研究表明，衰老小鼠感染鮑曼不動(dòng)桿菌野生株后72 h其IL-6水平降低[27]，患者感染多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌后IL-6水平更低[28]。TNF-α是機(jī)體受病原攻擊后活化巨噬細(xì)胞分泌的可溶性細(xì)胞因子，通過各種途徑間接刺激機(jī)體應(yīng)答以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原的反應(yīng)能力。本研究基于免疫抑制，低密度組IL-6、TNF-α水平整體略高于高密度組，這可能是因?yàn)楦呙芏冉M不僅激活肺吞噬細(xì)胞，還能調(diào)動(dòng)血液免疫功能以清除細(xì)菌。同時(shí)，IL-6水平在略升高后趨于穩(wěn)定，表明雖然感染可激發(fā)小鼠的免疫反應(yīng)，但免疫抑制狀態(tài)時(shí)白細(xì)胞的數(shù)量和活性低，感染后略有升高但不明顯。但TNF-α水平有不同的變化趨勢(shì)：低密度組小鼠外周血TNF-α水平明顯升高，在感染后期出現(xiàn)下降，而高密度組則持續(xù)升高。高密度組在感染后期仍能檢測(cè)到少量細(xì)菌存在，同時(shí)白細(xì)胞浸潤現(xiàn)象更加明顯。結(jié)合本研究中外周血白細(xì)胞數(shù)量、肺組織和BALF中菌量及肺部病理的特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，外周血TNF-α比IL-6能更好地動(dòng)態(tài)評(píng)估鮑曼不動(dòng)桿菌感染免疫抑制小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

4 結(jié)語

本研究選取來自下呼吸道標(biāo)本的A5株，成功構(gòu)建了免疫抑制小鼠肺部鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型，證明鮑曼不動(dòng)桿菌可引起明顯的肺部感染表現(xiàn)，提示來自下呼吸道標(biāo)本的鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株對(duì)免疫抑制小鼠具有較強(qiáng)的致病力，且感染程度與初始接種量有一定的相關(guān)性。因此，臨床診療時(shí)，在免疫低下人群呼吸道標(biāo)本中檢出鮑曼不動(dòng)桿菌時(shí)應(yīng)給予更多的關(guān)注。