中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)在ANCA相關(guān)性血管炎發(fā)病機(jī)制中的作用

高璇，林江濤

ANCA相關(guān)性血管炎(ANCA-associated vasculitis，AAV)是一種伴隨血清ANCA存在的系統(tǒng)性小血管炎。這組疾病包括顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis，MPA)、肉芽腫性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis，GPA)、嗜酸性肉芽腫性血管炎(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis，EGPA)。AAV患病率為300/100萬(wàn)～421/100萬(wàn)，且存在明顯的地域差異。歐洲國(guó)家以GPA為主，東亞國(guó)家以MPA為主。種族之間差異較大，其中白種人發(fā)病率最高。目前AAV的主要治療手段還是以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主，而長(zhǎng)期使用激素及免疫抑制劑可引發(fā)骨質(zhì)疏松、嚴(yán)重感染、增加腫瘤風(fēng)險(xiǎn)等不良事件。因此尋找新的治療手段，對(duì)于AAV患者的治療和管理有重要意義。研究表明，中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是AAV自身抗原的來(lái)源之一，NETs調(diào)控紊亂可誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生，加重AAV疾病的嚴(yán)重程度。因此，NETs可能成為治療AAV的潛在靶點(diǎn)。本文就NETs生物學(xué)特性、NETs在AAV機(jī)制中的作用以及NETs靶向治療AAV的價(jià)值進(jìn)行綜述。

1 NETs生物學(xué)特性

NETs是由組蛋白和細(xì)胞質(zhì)顆粒蛋白組成的細(xì)胞外DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。其DNA細(xì)絲的直徑為15～17 nm，鑲嵌在DNA細(xì)絲上的蛋白質(zhì)為直徑約為25 nm的球狀結(jié)構(gòu)。NETs的主要蛋白質(zhì)成分是組蛋白，其中核心組蛋白為H2A、H2B、H3和H4，占NETs相關(guān)蛋白質(zhì)的70%，其次是顆粒酶和多肽，包括中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、髓過(guò)氧化物酶、組織蛋白酶G、白細(xì)胞蛋白酶3等，這些蛋白與抗菌活性相關(guān)，參與細(xì)菌、真菌、寄生蟲感染過(guò)程。

NETs形成過(guò)程稱為NETosis。NETosis可引起呼吸爆發(fā)，是繼細(xì)胞凋亡、壞死等之外的一種新的細(xì)胞死亡方式。中性粒細(xì)胞受到白細(xì)胞介素- 8(interleukin- 8，IL- 8)、12-豆蔻酸- 13-乙酸佛波醇(phorbol- 12-myristate- 13-acetate，PMA)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等刺激后，核內(nèi)染色質(zhì)開始解聚，該過(guò)程由肽基精氨酸脫亞酶4(peptidyl arginine deiminase 4，PAD4)介導(dǎo)，PAD4催化組蛋白中的精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，減少組蛋白的強(qiáng)正電荷，從而減弱組蛋白-DNA的相互作用，進(jìn)而加速染色質(zhì)解聚。除了PAD4，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)也在NETs形成過(guò)程中起重要作用，NE通過(guò)裂解組蛋白H4，促進(jìn)染色質(zhì)解聚。隨著核膜和顆粒膜分離并消失，解聚后的DNA、瓜氨酸化的組蛋白以及顆粒蛋白共同組成NETs，最后被排出細(xì)胞外。

NETosis又可分為兩個(gè)循序漸進(jìn)的階段：早期致命NETosis和晚期自殺性NETosis。早期致命NETosis由金黃色葡萄球菌感染通過(guò)補(bǔ)體受體和Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)誘導(dǎo)形成，或由大腸桿菌感染直接或間接通過(guò)Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)活化誘導(dǎo)形成，從而發(fā)揮吞噬和趨化作用；晚期自殺性NETosis由膽固醇晶體誘導(dǎo)形成，可與巨噬細(xì)胞表面蛋白(例如αvβ3，CD14，CD36)結(jié)合形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，心肌梗死和中風(fēng)等疾病發(fā)生。這表明，NETosis在不同的發(fā)生階段起到不同的作用，NETosis是一把雙刃劍，既可以在先天性免疫防御中起到重要的生理作用，又可以促進(jìn)炎癥及自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展。

NETs結(jié)構(gòu)包含多種可以成為自身抗原的組分，各組分間的分子間作用力限制了自身抗原對(duì)機(jī)體的傷害。但是，如果NETs生成過(guò)度活躍或清除機(jī)制出現(xiàn)異常，其也可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害，并參與多種自身免疫病的致病過(guò)程。例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、AAV、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病。

2 NETs在AAV發(fā)病中的作用

中性粒細(xì)胞表面自身抗原暴露后與被激活/損傷的內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，形成NETs。ANCA可通過(guò)腫瘤壞死因子-α，脂多糖，或補(bǔ)體因子5a等細(xì)胞因子激活中性粒細(xì)胞脫顆粒，產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，釋放DNA染色質(zhì)形成NETs。這些細(xì)胞因子通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮選擇素的表達(dá)，使中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)及細(xì)胞間遷移，增加中性粒細(xì)胞表面自身抗原的表達(dá)，如髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、蛋白酶 3(proteinase 3，PR- 3)和其他中性粒細(xì)胞顆粒蛋白。隨之，ANCA與自身抗原結(jié)合形成可溶性免疫復(fù)合物，自身抗體的Fc部分與FcgRs結(jié)合，最終導(dǎo)致中性粒細(xì)胞激活，驅(qū)動(dòng)MPO、NE和PR3脫顆粒，核小體染色質(zhì)從細(xì)胞中解聚并排出，導(dǎo)致NETs形成，最終導(dǎo)致中性粒細(xì)胞死亡。從而導(dǎo)致小血管壞死性炎癥，內(nèi)皮細(xì)胞死亡、血管通透性增加、纖維蛋白沉積，隨后引起單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集，最終演變?yōu)槿庋磕[。

如前所述，NETs是中性粒細(xì)胞介于凋亡與壞死之間的一種程序性死亡方式，NETs的形成和分解受到嚴(yán)格控制，過(guò)量暴露的NETs會(huì)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管病變，參與AAV疾病的發(fā)生發(fā)展。體外研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均進(jìn)一步證明了NETs可誘導(dǎo)ANCA生成，參與AAV疾病的病理過(guò)程：(1)AAV患者的腎活檢樣本以及皮膚和血栓樣本中可檢測(cè)到NETs的存在。Kessenbrock等研究發(fā)現(xiàn)在ANCA-IgG孵育的中性粒細(xì)胞中觀察到活躍的NET形成，但在與對(duì)照組IgG孵育的中性粒細(xì)胞中沒(méi)有觀察到NET的形成。(2)AAV患者的中性粒細(xì)胞比健康獻(xiàn)血者的中性粒細(xì)胞更容易自發(fā)釋放NETs。中性粒細(xì)胞亞群中的低密度中性粒細(xì)胞(Low density granuloctyes，LDGs)已被證明能夠自發(fā)釋放NETs，明顯多于正常密度中性粒細(xì)胞，這些LDGs被認(rèn)為是AAV中NETs的主要來(lái)源。(3)Sangaletti等發(fā)現(xiàn)將被NETs激活的骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞(Marrow-Derived Dendritic Cells，MDCs)注射到幼稚小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)ANCA形成。該機(jī)制為NETs增強(qiáng)MDCs對(duì)PR3和MPO分子的攝取，從而激活自身反應(yīng)性B細(xì)胞，誘導(dǎo)ANCAs的生成。(4)NETs的內(nèi)容物會(huì)破壞對(duì)特定自身抗原的耐受性，MPO和PR3等自身抗原通過(guò)樹突細(xì)胞提呈給CD4+T細(xì)胞，誘導(dǎo)B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞，通過(guò)產(chǎn)生IL- 21最終導(dǎo)致ANCA產(chǎn)生。(5)NETs還可以TLR- 9依賴的方式激活pDC和自身反應(yīng)性B細(xì)胞。激活的pDC分泌干擾素-α和IL- 8，進(jìn)一步誘導(dǎo)NETs的過(guò)度激活，而激活的B細(xì)胞可產(chǎn)生ANCA。(6)NETs中的內(nèi)源性抗菌肽LL37可激活漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid Dendritic Cells，pDCs)，pDCs激活后產(chǎn)生大量干擾素(IFN)-α、caspase- 1和炎癥分子，LL37的高表達(dá)與AAV全身和腎臟炎癥有關(guān)。這些研究表明NETs主要來(lái)源于LDGs，其組成成分可作為AAV中的自身抗原，并通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)ANCA的生成，在AAV的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

反之，ANCA和其他體液因子(如損傷相關(guān)的分子模式)會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)NETs形成，在發(fā)病機(jī)制中形成NETs-ANCA惡性循環(huán)。(1)高遷移率基團(tuán)蛋白1(High Mobility Group Protein 1，HMGB1)參與ANCA誘導(dǎo)NETs形成。HMGB1可通過(guò)增加ANCA抗原易位來(lái)啟動(dòng)中性粒細(xì)胞，從而激活NETs，促進(jìn)ANCA介導(dǎo)的呼吸爆發(fā)和脫顆粒。研究表明，HMGB1通過(guò)TLR2、TLR4和RAGE途徑以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶依賴性方式增加NETs的釋放。(2)Tang等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，ANCA可通過(guò)溶酶體膜相關(guān)蛋白2誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)NETosis，過(guò)度的NETs暴露損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥發(fā)生。

綜上所述，外源性抗原(如藥物或微生物等)及自身抗原(產(chǎn)生變異或細(xì)胞內(nèi)成分)的過(guò)度暴露可導(dǎo)致無(wú)致病性的天然ANCA在基因、環(huán)境的作用下轉(zhuǎn)化為致病性的ANCA，可引起中性粒細(xì)胞裂解死亡形成NETs導(dǎo)致血管損傷。NETs又可以通過(guò)免疫耐受性喪失激活A(yù)NCAs。在發(fā)病機(jī)制中形NETs-ANCA惡性循環(huán)。因此，ANCA可誘導(dǎo)NETosis過(guò)程損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞引起血管炎，NETs的過(guò)度激活又可誘導(dǎo)ANCA的產(chǎn)生，彼此形成惡性循環(huán)。ANCA與NETs相互作用，互為因果，是導(dǎo)致AVV發(fā)生發(fā)展兩個(gè)重要因素。

3 靶向NETs治療AAV

AAV的治療分為誘導(dǎo)緩解與維持緩解2個(gè)階段。糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑仍為治療AAV的主要方法，但激素及免疫抑制治療可增加機(jī)會(huì)性感染和惡性腫瘤的易感性。隨著人們對(duì)AAV發(fā)病機(jī)制的深入研究，中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、細(xì)胞因子和補(bǔ)體等成分在AAV發(fā)病機(jī)制中都起了關(guān)鍵作用，針對(duì)以上靶點(diǎn)，已有相關(guān)藥物進(jìn)入臨床及臨床試驗(yàn)。但目前還沒(méi)有專門針對(duì)NETs靶點(diǎn)的治療方法。通過(guò)阻斷NETs形成，或者通過(guò)DNase酶降解NETs，可治療NETs水平過(guò)高所致的相關(guān)疾病。利用現(xiàn)代生物技術(shù)，制備針對(duì)NETs或者NETs組分的特異性配體，有助于治療中性粒細(xì)胞炎癥性疾病。因此，研發(fā)以NETs為靶點(diǎn)的藥物，有望為治療自身免疫疾病等非感染性疾病帶來(lái)新的愿景。

目前，已有針對(duì)NETs為靶點(diǎn)的藥物在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及AAV動(dòng)物模型中進(jìn)行研究。CI-amidine作為新的靶點(diǎn)藥物是一種PAD4抑制劑，PAD4在NETosis中起著關(guān)鍵作用。Rao等證明在MPO-ANCA小鼠模型中證明PAD抑制劑可以通過(guò)降低組蛋白瓜氨酸化減少NETs的形成，改善血管功能，降低血清MPO-ANCA水平，抑制血管炎發(fā)病。

2010年NE首次被證明能與MPO協(xié)同工作，溶解核膜并幫助裂解組蛋白。最近的研究表明，GSDMD和NE也有協(xié)同作用，破壞核膜和細(xì)胞膜，再次強(qiáng)調(diào)了NE在NETs形成中的重要性。針對(duì)NE為靶點(diǎn)的兩個(gè)藥物為Alvelestat和Bay85- 8501。Alvelestat是第三代NE抑制劑，在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征小鼠模型中，Alvelestat已有效抑制了NETosis，并顯著降低炎癥反應(yīng)。Bay 85- 8501是第五代NE抑制劑，與前一代抑制劑相比，它的安全性及有效性更強(qiáng)。在體外試驗(yàn)中，觀察到Bay85- 8501有效減少了NET的形成。這兩種藥物在治療呼吸道疾病的臨床試驗(yàn)中都被證明良好的安全性和耐受性，已成為阻斷AAV中NETs形成的候選藥物。在MPO-ANCA相關(guān)性血管炎(MPO-ANCA-associated vasculitis，MPO-AAV)小鼠模型中使用Alvelestat和BAY 85- 8501抑制NETs形成取得了良好的效果，證明能夠減少腎小球NETs積聚和MPO沉積從而減少腎小球損傷，減少腎小球CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的聚集，從而抑制了MPA的發(fā)展及腎臟損害。且經(jīng)Bay85- 8501處理的小鼠ANCA滴度顯著降低。

磷脂酰肌醇3激酶γ(Phosphatidylionsitol 3-kinaseγ，PI3K-γ)能增強(qiáng)T細(xì)胞活動(dòng)，增加IL- 17水平，參與ANCA的自身免疫反應(yīng)。PI3K-γ的基因消融可減少NETosis和ANCA的產(chǎn)生。在MPA模型小鼠中應(yīng)用PI3k-γ特異性抑制劑進(jìn)行治療，結(jié)果顯示MPA小鼠模型中的ANCA滴度、腎和肺損傷的嚴(yán)重程度均降低，表明通過(guò)PI3K-γ阻斷抑制體內(nèi)NETosis可有效改善MPA，從而阻止腎臟和肺損傷。Kimura等研究揭示了通過(guò)阻斷PI3K-γ可抑制NETosis，進(jìn)而阻止ANCA的產(chǎn)生，從而阻止腎和肺損傷。目前已有PI3K-γ抑制劑有效地改善了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的癥狀，PI3K-γ/δ雙重抑制劑已經(jīng)在腫瘤和哮喘疾病中開展了1- 3期臨床試驗(yàn)。Schreiber 等報(bào)道了ANCA通過(guò)RIPK1/3和依賴混合系激酶結(jié)構(gòu)域樣(mixed-lineage kinase domain-like，MLKL)壞死性凋亡誘導(dǎo)NETs的形成。目前RIPK1抑制劑處于第二期臨床試驗(yàn)中，用于治療炎癥性腸道疾病、牛皮癬、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病。由此可見，通過(guò)抑制PAD4、NE、PI3K-γ、RIPK1的生成可有效減少AAV患者中NETs的產(chǎn)生，可成為AAV潛在的治療靶標(biāo)。

NETs主要通過(guò)血清中的脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)降解；然而自身免疫病患者體內(nèi)普遍存在DNase水平或活性降低的現(xiàn)象，因此可以在體內(nèi)持續(xù)存在。Schreiber等在AAV模型中證實(shí)DNase I可抑制ANCA誘導(dǎo)的NETs形成、減少腎小球損傷，延展疾病發(fā)展。通過(guò)給予外源性DNase I以加速NETs的降解，可能會(huì)緩解疾病的發(fā)展，但由于DNase I半衰期短，治療仍存在困難。腺病毒相關(guān)載體(adeno-associated virus vectors，AAVec)可以持續(xù)傳遞DNase I為AAV提供一次性治療。目前，AAVec技術(shù)已經(jīng)成功地用于治療人類失明、凝血障礙和神經(jīng)肌肉疾病。因此，AAVec技術(shù)有望用于治療AAV?？傊?，NETs的生成與降解在AAV發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，通過(guò)抑制NETs的激活或促進(jìn)其降解為AAV治療提供新的方向。

綜上所述，NETs在AAV中的作用已在臨床樣本和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證，NETs作為治療靶點(diǎn)的研究也得到廣泛開展。進(jìn)一步探索NETosis的相關(guān)途徑，以及NETs參與ANCA形成的分子信號(hào)通路，對(duì)闡明自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制，以及發(fā)現(xiàn)新的臨床治療手段具有重要意義。今后需要更多的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)證實(shí)，以期為AAV治療方案和特異性靶點(diǎn)藥物的開發(fā)提供新的思路，以便為疾病治療提供更有針對(duì)性的指導(dǎo)。