分光光度法測定海魚罐頭中組胺含量*

戴志英，楊梅桂，施逸嵐，楊清華

（江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南通 226000）

深海魚金槍魚、秋刀魚、鯖魚、沙丁魚、鮐魚、鰣魚、馬鮫魚等肉質(zhì)柔嫩鮮美，營養(yǎng)元素豐富，這些青皮紅肉深海魚中含有較多的組氨酸，如保存不當(dāng)會發(fā)生質(zhì)量變化，海魚在微生物的組氨酸脫羧酶作用下產(chǎn)生大量組胺，當(dāng)人體攝入過量的組胺時，會引起頭痛、惡心、心悸、血壓變化、呼吸紊亂等反應(yīng)，嚴(yán)重時還會危及生命[5,6]?，F(xiàn)在市場上各類海魚罐頭很多，為確保市民食用安全，本文在GB5009.208-2016國家標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，建立了方便快捷的海魚罐頭中組胺的測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

正戊醇（AR）、HCl（GR）、HClO4（GR）、Na2CO3（AR）、NaNO2（AR），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaOH（GR上海山海工學(xué)團(tuán)實(shí)驗(yàn)二廠）；對硝基苯胺（AR阿拉丁試劑公司）；

組胺二鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（GR德國）；

50g·L-1Na2CO3溶液5g Na2CO3用純水溶解，并用純水稀釋至100mL，混勻；

250g·L-1NaOH溶液25g NaOH用純水溶解并稀釋至100mL，混勻；

1+11（v/v）HCl溶液55mL純水中加5mL HCl，混勻；

甲液（對硝基苯胺溶液） 稱取0.5g對硝基苯胺，加5mL HCl溶解后，再用純水稀釋至200mL，混勻，臨用現(xiàn)配；

乙液（NaNO2溶液）稱取0.5g NaNO2，用純水溶解并稀釋至100mL，混勻，臨用現(xiàn)配；

偶氮試劑 吸取5mL甲液、40mL乙液混合，臨用現(xiàn)配；

1000μg·mL-1磷酸組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取0.0250g組胺二鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，溶于純水，移入25mL容量瓶中，并用純水稀釋至刻度，混勻；

20μg·mL-1磷酸組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液 吸取1mL 1000μg·mL-1磷酸組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液于50mL容量瓶中，加純水至刻度，混勻；

CFAPA-QC056B-1魚肉粉中組胺殘留量檢測質(zhì)控樣品（指定值（452.8±64.9）mg·kg-1，大連中食國實(shí)檢測技術(shù)有限公司）。

WFJ7200型分光度計(jì)（龍尼柯（上海）儀器有限公司）；PRIMOR離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司）；TALB YS振蕩器（Thoemner公司）；50mL塑料離心管。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別吸取20μg·mL-1的磷酸組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mL于10mL具塞比色管中，相當(dāng)含0、4、8、12、16、20μg組胺，加水至1mL，加入1mL（1+11）HCl溶液，混勻，加入50g·L-1Na2CO3溶液3mL，偶氮試劑3mL，加水至刻度，混勻，放置10min，在480nm波長處，用1cm比色皿零管調(diào)零測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 樣品處理 稱取10g已絞碎均勻的樣品于50mL塑料離心管中，加入5%的HClO4溶液40mL浸泡2～3h，將離心管置于電動振蕩器中振蕩10min，然后將離心管放到離心機(jī)以8000r·min-1的速度冷凍離心5min，取2～4mL上清液于50mL的塑料離心管中，用NaOH溶液調(diào)pH值為10～12，加入正戊醇9mL，將離心管置于電動振蕩器中振蕩5min，接著再以8000r·min-1的速度冷凍離心5min，取上層正戊醇提取液2mL于50mL塑料離心管中，加（1+11）HCl溶液9mL在電動振蕩器上振蕩5min，再以8000r·min-1速度冷凍離心5min，用一次性塑料吸管將上層正戊醇棄去，下層HCl提取液供測定。

1.2.3 樣品測定 吸取HCl 2mL提取液于10mL具塞比色管中，以下操作同1.2.1標(biāo)準(zhǔn)系列同法操作，測定吸光度，計(jì)算樣品中組胺含量。

1.2.4 計(jì)算公式

式中X：試樣中組胺的含量，mg/100g；m2：2mL HCl提取液的吸光度值相當(dāng)含組胺質(zhì)量，μg；m1：取樣量，g；v1：HClO4溶液浸提試樣的體積，mL；v2：樣品經(jīng)HClO4溶液浸泡、振蕩、離心后，從上層清液中吸取的體積；9：第一個9是加入正戊醇的體積，mL、第二個9是加入（1+11）HCl溶液的體積，mL；2：第一個2是吸取正戊醇提取液的體積，mL、第二個2是吸?。?+11）HCl提取液的體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 試樣提取試劑的選擇

GB5009.208-2016中用三氯乙酸提取液浸泡樣品，但三氯乙酸極易潮解變成液態(tài)而影響使用，本文選用5%～10%的HClO4溶液代替三氯乙酸溶液浸泡魚樣[4]，在樣品中加入組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液做回收率試驗(yàn)，組胺添加濃度為3.6mg/100g，回收率結(jié)果見表1[2]。

表1 不同濃度提取液的回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Recovery test results of different concentrations of extract（n=6）

由表1可知，溶液HClO4含量分別為5%、8%和10%時，提取回收率均在90%以上，說明提取效果比較理想，考慮到HClO4是強(qiáng)酸，濃度高、腐蝕性強(qiáng)，故本文選用5%的HClO4溶液作為樣品提取液。

2.2 HClO4提取液、偶氮顯色反應(yīng)酸堿度的控制

用正戊醇提取HClO4提取液中的組胺時，HClO4提取液必須用NaOH溶液調(diào)pH值至堿性在10～12之間[1]，以便于組胺能游離而被正戊醇提取。

組胺與偶氮試劑反應(yīng)必須在弱堿性條件中進(jìn)行，且反應(yīng)時間必須控制在10min[1]，若酸堿度控制不當(dāng)，過酸時部分組胺與酸反應(yīng)，組胺減少，則與偶氮試劑反應(yīng)后導(dǎo)致結(jié)果偏低；過堿時，偶氮試劑的量會減少，也會導(dǎo)致結(jié)果偏低，只有在弱堿條件下，組胺與偶氮試劑方可完整反應(yīng)，結(jié)果才會準(zhǔn)確。

2.3 振蕩方法和提取次數(shù)的選擇

GB5009.208-2016中采用分液漏斗手動振搖方法來提取待測組份，手動振蕩每次只能振蕩兩個樣品，工作效率低，本文用50mL塑料離心管代替分液漏斗，手動振搖改為電動振搖，電動振蕩一次可同時處理數(shù)十個樣品，振蕩充分，提取效率高。GB5009.208-2016中用正戊醇和（1+11）HCl溶液分別提取樣液中待測組分時，每次3mL，共3次，這種提取方法步驟多，操作繁瑣，本法用9mL正戊醇和9mL（1+11）HCl溶液各提取待測組份一次，該方法步驟少，節(jié)省檢測時間[3]，本文用GB5009.208-2016法與本法同時對魚罐頭進(jìn)行組胺測定，結(jié)果見表2。

表2 GB5009.208-2016法與本法檢測樣品中組胺結(jié)果（n=6）（mg/100g）Tab.2 Results of histamine by GB5009.208-2016 and this method（n=6）（mg/100g）

由表2可知，本法的提取效果優(yōu)于GB5009.208-2016法，本法省時省力，可同時處理多個樣品。

2.4 方法的線性范圍及檢出限

在本實(shí)驗(yàn)條件下，組胺含量在0～20μg/10mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)γ=0.9999，線性方程Y=0.007275X+0.0211。測定11個樣品空白溶液的吸光度，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，方法的檢出限為0.121μg·mL-1。

2.5 方法的精密度試驗(yàn)

用3種魚罐頭做精密度試驗(yàn)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.74%～5.23%，結(jié)果見表3。

表3 樣品精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Sample precision test results（n=6）

2.6 方法的準(zhǔn)確度

采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)法，分別稱取2.5g鮐魚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)6份，按1.2.2方法同法處理，按1.2.3方法測定吸光度，計(jì)算組胺含量，測得的組胺含量為44mg/100g，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的參考值為（452.8±64.9）mg·kg-1，可見方法具有較好的準(zhǔn)確性。

2.7 樣品測定

稱取各類海魚罐頭10g，按試驗(yàn)方法測定組胺含量，同時加入1000μg·mL-1磷酸組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液0.36mL（含360μg組胺）進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)回收率為92.2%～96.7%，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定及回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Sample determination and recovery test results（n=6）

3 結(jié)論

本文用5%的HClO4溶液代替國標(biāo)方法中三氯乙酸溶液浸泡魚樣，手動振搖改為電動振蕩將樣品中的組胺浸提出來，正戊醇、（1+11）HCl溶液振蕩提取待測組份各一次，該方法的精密度和準(zhǔn)確度均符合檢測要求，操作方便，工作效率高，可同時檢測大批量樣品中組胺含量。