DNA歷險記
——氧化損傷篇

關(guān)喆，宋紅杰，劉睿

四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院，成都 610064

DNA是由脫氧核糖核苷酸為單體組成的生物大分子，而脫氧核糖核苷酸則由脫氧核糖、磷酸和堿基構(gòu)成。其中正常的堿基有4種，分別為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)，4種堿基的結(jié)構(gòu)如圖1所示。在DNA反向平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，堿基間通過氫鍵進行互補配對，位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)；磷酸和脫氧核糖通過磷酸二酯鍵相連，位于雙螺旋的外側(cè)，構(gòu)成了DNA的骨架。DNA嚴格的堿基互補配對原則以及精巧的雙螺旋結(jié)構(gòu)保障著遺傳信息的傳遞和表達。

圖1 DNA中正常堿基的結(jié)構(gòu)

但DNA結(jié)構(gòu)的完整性受到外界環(huán)境因素和機體內(nèi)在因素的影響，在某些不利因素發(fā)生時，DNA結(jié)構(gòu)很容易被破壞。據(jù)統(tǒng)計每個細胞內(nèi)的DNA在24小時內(nèi)會發(fā)生10000次損傷[1]。盡管機體存在著DNA損傷修復(fù)機制，降低了損傷DNA對機體生命活動的影響，但如果損傷未被修復(fù)，在機體內(nèi)累積起來，便有可能導(dǎo)致基因突變、細胞死亡，引發(fā)癌癥、個體衰老等疾病[2,3]。肝癌即是由乙、丙型肝炎病毒(HBV, HCV)、黃曲霉毒素B1 (AFBl)、亞硝胺等因素誘導(dǎo)肝細胞DNA發(fā)生損傷并直接或間接影響損傷修復(fù)系統(tǒng)而造成的[4]。

我們生存在一個富氧的環(huán)境中，人和動物的各種生命活動都離不開氧氣的參與。但與此同時，氧活潑的化學(xué)性質(zhì)也常導(dǎo)致生物大分子發(fā)生損傷，DNA也包括在內(nèi)。在眾多的DNA氧化損傷產(chǎn)物中，8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)因其特殊的化學(xué)性質(zhì)，往往被認為是DNA氧化損傷的生物標志物[5]。DNA小核最近就遭遇了活性氧的攻擊，它的一個鳥嘌呤堿基被氧化修飾……

1 不速之客ROS搶奪電子致DNA氧化受損

小核是一條DNA，有一天，它正在細胞內(nèi)認真地完成自己的工作，但是來了一名不速之客。只見那名不速之客對小核的一個鳥嘌呤堿基的第8位碳原子進行了猛烈攻擊，隨后以羥基的形式結(jié)合在8位碳原子上[5]，整個過程如圖2所示。小核的這個鳥嘌呤被修飾成了8-羥基鳥嘌呤，8-羥基脫氧鳥苷也由此生成。由于不速之客的攻擊太過突然，當小核反應(yīng)過來時只覺得自己身體的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[5]，它感受到了陣陣的難受和絲絲的恐懼。

圖2 8-OHdG的形成

這個不速之客即是活性氧(reactive oxygen species, ROS)，DNA氧化損傷就是由活性氧自由基如羥基自由基(·OH)、超氧陰離子自由基·O2-等對DNA分子結(jié)構(gòu)的攻擊引起的[1,6]。ROS是生物體各種代謝過程的正常產(chǎn)物，一般情況下，機體的氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)之間保持著動態(tài)平衡[1,5]。但當機體受到內(nèi)部或外界環(huán)境的刺激(內(nèi)源性因素如氧化劑的過度生成，外源性因素如吸煙、紫外線輻射等)，這種平衡被打破，過量產(chǎn)生的ROS就可能直接或在細胞內(nèi)經(jīng)金屬催化轉(zhuǎn)化后攻擊機體內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等生物分子，最終導(dǎo)致生物分子氧化受損[1,5,6]。

ROS導(dǎo)致的DNA氧化損傷類型有很多種，包括DNA鏈斷裂、堿基修飾、堿性位點和DNA蛋白質(zhì)交聯(lián)等[7]。在眾多的活性氧自由基中，羥基自由基(·OH)是造成生物分子氧化受損最活潑的自由基，其在細胞有氧代謝過程中通過Fenton反應(yīng)生成[8]，其化學(xué)反應(yīng)式為Fe2++ H2O2→ Fe3++ ·OH + OH-。由于鳥嘌呤的氧化電位最低，分子軌道能級較高，很容易受到·OH的攻擊而形成加合物[5]。小核所遭遇的這次損傷即是·OH攻擊鳥嘌呤的第8位碳原子生成C8-OH加合物自由基，而后自由基的一個電子被氧化生成的。除了生成8-羥基鳥嘌呤，C8-OH加合物自由基的電子也可能被還原生成甲酰氨基嘧啶[8,9]，其反應(yīng)機制如圖3所示。

圖3 鳥嘌呤與·OH的反應(yīng)機理[8,9]

2 酶醫(yī)生各司其職全力搶救

DNA Damage Hospital的酶醫(yī)生感受到了事故的發(fā)生，連忙對小核進行治療。它們各司其職，有條不紊。首先上手術(shù)臺的醫(yī)生是DNA糖基化酶(OGG1)，它準確地識別了被修飾的鳥嘌呤在小核身體中的位置。隨后，它將N-糖苷鍵水解，使得損傷堿基8-羥基鳥嘌呤從小核身體中移除，在損傷處產(chǎn)生無堿基位點(AP位點)。就此，DNA糖基化酶的工作完成，醫(yī)生AP核酸內(nèi)切酶(APE1)開始工作。它負責(zé)剪切AP位點處的磷酸二酯鍵，為堿基的進一步修復(fù)做準備。之后，醫(yī)生DNA聚合酶(DNA pol)和DNA連接酶(DNA ligase)合作在DNA鏈空缺處補上正常的鳥嘌呤[6,10,11]。手術(shù)順利完成，小核的損傷被修復(fù)，手術(shù)過程如圖4所示。

圖4 堿基切除修復(fù)過程

生物體存在著DNA損傷修復(fù)機制，可以對DNA的各類損傷進行修復(fù)。修復(fù)過程中的酶就好比是醫(yī)生，不同的酶可以對DNA不同的損傷進行診斷和治療。在DNA損傷應(yīng)答中，酶醫(yī)生主要通過堿基切除修復(fù)(BER)途徑對堿基修飾損傷進行診斷和治療，即小核被醫(yī)治的過程。

該途徑所涉及酶的種類是多樣且復(fù)雜的。DNA糖基化酶就有很多種類型，在不同的生物當中也有所差異，原核生物中針對8-OHdG的糖基化酶主要為甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶(Fpg，也稱MutM)，真核生物中主要為8-羥基鳥嘌呤-DNA糖基酶(OGG1)。一些糖基化酶還具有AP裂解酶活性，可以使DNA鏈斷裂。DNA聚合酶和DNA連接酶的不同種類會導(dǎo)致BER途徑所經(jīng)歷步驟的多少有所差異[10,12,13]。

3 分析方法各顯神通檢測8-羥基脫氧鳥苷

DNA小核在酶醫(yī)生的救治下恢復(fù)了健康。醫(yī)生對小核說，現(xiàn)實狀況下，由于我們生存環(huán)境的復(fù)雜性以及酶醫(yī)生工作效率的有限性，并不是所有的DNA損傷都能夠得到修復(fù)。你所受到的損傷是很典型的，8-羥基鳥嘌呤無法特異性與胞嘧啶配對，而同時具有與A、T、C配對的能力[5]。假如我們沒有及時發(fā)現(xiàn)你的病情并開展有效的治療，8-OHdG在DNA復(fù)制過程中與其他堿基錯配，便可能導(dǎo)致突變的發(fā)生。我們DNA Damage Hospital的醫(yī)生曾經(jīng)遇到過8-羥基鳥嘌呤與腺嘌呤A錯配而導(dǎo)致G : C →T : A突變的病例，但這種突變被治愈的過程很漫長，甚至無法被治愈[5]。8-OHdG的不斷積累還會促進DNA氧化損傷的發(fā)生，使得某些基因發(fā)生突變，從而導(dǎo)致我們賴以生存的細胞家園衰老死亡，甚至引發(fā)我們身體主人患上癌癥等嚴重的疾病[1]。小核在聽完酶醫(yī)生的話后，感覺自己十分幸運，但也開始擔(dān)憂起自己身體的未來……

DNA損傷的產(chǎn)生和積累可能會引發(fā)各種疾病的產(chǎn)生，準確測量DNA損傷的含量對于發(fā)現(xiàn)潛在的疾病、早期臨床診斷和治療監(jiān)測至關(guān)重要。8-OHdG在生物體內(nèi)具有較為穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，不會被進一步代謝，可以作為DNA氧化損傷的生物標志物，對其進行定量檢測可以反映DNA氧化損傷程度以及細胞對DNA氧化損傷的修復(fù)能力[1,5,6]。

8-OHdG的定量分析方法有很多種，其中利用色譜和檢測器串聯(lián)的檢測方法被報道的較多，如高效液相色譜-電化學(xué)法(HPLC-ECD)、氣質(zhì)聯(lián)用分析法(GC-MS)、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。其檢測原理如圖5所示，將待測樣品用DNA酶水解或其他方式預(yù)處理后，利用色譜將8-OHdG與其他干擾物質(zhì)分離，再利用檢測器對8-OHdG進行定量檢測[14,15]。

圖5 色譜與檢測器串聯(lián)定量分析原理

此外，應(yīng)用較多的還有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)、32P后標記法和PY共振光散射法等。ELISA是利用抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，通過顯色來檢測抗體或抗原的方法。其基本原理如圖6所示，8-OHdG固相抗原與樣品中的8-OHdG競爭一定量的8-OHdG特異性單克隆抗體，再用特異性酶聯(lián)抗體標記與固相抗原結(jié)合的特異性單克隆抗體，加入底物顯色后，測定光密度值，通過計算與固相抗原結(jié)合的特異性單克隆抗體含量來間接計算樣品中8-OHdG的含量[16]。32P后標記法將DNA鏈降解為3’單核苷酸后去磷酸化，被羥基加合的單磷酸核苷可以抵抗去磷酸化作用，使得[γ-32P]ATP的磷酸基團可以在酶的作用下轉(zhuǎn)移到加合物核苷酸上，對[γ-32P]ATP進行檢測可以間接獲得加和物的含量[14,17]。PY共振光散射法利用吡啰紅Y陽離子染料與8-OHdG陰離子形成離子締合物，導(dǎo)致體系的共振光散射增強實現(xiàn)定量檢測[18]。

圖6 ELISA法檢測原理[19]

不同的檢測方法各有特點，在實際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)所需選擇合適的檢測方案，表1總結(jié)了常見8-OHdG檢測方法的相關(guān)參數(shù)。

表1 常見8-OHdG檢測方法的相關(guān)參數(shù)

4 結(jié)語

小核的這次遭遇給它留下了深刻的印象，它忘不了活性氧加合在鳥嘌呤上時給它帶來的痛苦，也忘不了機智的酶醫(yī)生對它精心的照顧和治療，但也擔(dān)心自己可能隨時受到內(nèi)外界的攻擊。它在心里默默許愿：希望身體主人能夠愛護好身體，比如按時休息、不抽煙、減少接觸紫外線輻射或電離輻射等，也希望有更準確、更快速、更便捷的DNA損傷檢測方法被研發(fā)出來。