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    糖絡(luò)寧調(diào)控miR-211 對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠背根神經(jīng)元凋亡的影響

    2022-10-20 13:39:50辛競妍朱雨菲吳長江謝文瑩張濤靜
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2022年27期
    關(guān)鍵詞:血清

    張 晨 陳 楓 辛競妍 朱雨菲 李 矜 吳長江 謝文瑩 張濤靜

    1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院內(nèi)分泌科,北京 100078

    背根神經(jīng)元(dorsal root ganglion neurons,DRGn)是人體內(nèi)重要的感覺神經(jīng)元,位于血神經(jīng)屏障之外的特殊生理位置使其暴露在全身代謝和缺氧應(yīng)激下,在高糖環(huán)境中更容易受到損害[1]。DRGn 細胞凋亡是糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)發(fā)生發(fā)展的重要因素[2-3]。既往研究發(fā)現(xiàn),高糖能抑制DPN 大鼠DRGn 細胞活性,糖絡(luò)寧可以降低高糖引起的細胞凋亡水平[4-5],其作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)凋亡通路有關(guān)[6],而更深層的介導(dǎo)基因尚未明確。微RNA(microRNA,miRNA)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下是調(diào)控細胞從保護性的未折疊蛋白反應(yīng)轉(zhuǎn)至激活凋亡的關(guān)鍵因子[7-8],其中miR-211 依賴PERK 誘導(dǎo)而作用于促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP 的表達[9]。本研究以miR-211 為切入點,通過體外實驗觀察糖絡(luò)寧對大鼠DRGn 凋亡的影響及miR-211 在其中的作用,探討其治療DPN 的作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    用于制備含藥血清和空白血清的SPF 級SD 大鼠[60 只,8 周齡雄性,體重(200±30)g]及用于提取DRGn 細胞的SPF 級SD 懷孕大鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,實驗室環(huán)境為國標GB14925-2001[10]規(guī)定的動物實驗設(shè)施及大鼠SPF 級屏障環(huán)境。本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(201811)。實驗中心溫度(20±2)℃,濕度45%~65%,12 h 明暗交替。

    1.2 實驗用藥

    糖絡(luò)寧制劑(由生黃芪、丹參、川牛膝、狗脊、全蝎組成)為北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥房提供,濃度為生藥0.5 g/ml。

    1.3 主要試劑及儀器

    BeyoRTTMⅡcDNA 第一鏈合成試劑盒(碧云天公司,批號:D7168S)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(MDL,批 號:MD913053)、Annexin V-FITC/PI Kit/凋亡檢測試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司,批號:FXP018)、Neurobasal 培養(yǎng)基(Gibco,批號:21103049)、兔抗PERK、轉(zhuǎn)錄激活因子4(activator of transcription 4,ATF4)、真核細胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)(abcam,批號:ab186284、ab216839、ab32157)、兔抗CHOP(Cell Signaling 公司,批號:L63F7)、低溫離心機(德國Sigma 公司,型號:3-30K)、熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀(美國Applied biosystems,型 號:StepOne Softwar),電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司,型號:BG-subMIDI)。

    1.4 研究方法

    1.4.1 糖絡(luò)寧含藥血清的制備 雄性SD 大鼠60 只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,采用隨機數(shù)字表法將其分為糖絡(luò)寧含藥血清組(30 只)和空白血清組(30 只),分別以糖絡(luò)寧組方生藥2.5 g/(kg·d)灌胃和等體積蒸餾水灌胃,連續(xù)給藥10 d,末次給藥后2 h 內(nèi)以2%戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,腹主動脈取血,3000 次/min重復(fù)10 min(半徑95 mm,溫度4℃)離心,分離血清水浴滅活,過濾除菌后,-80℃環(huán)境中冷凍保存。

    1.4.2 DRGn 細胞分離培養(yǎng)及分組 DRGn 細胞分離培養(yǎng)參照既往實驗[11-12],神經(jīng)元專用培養(yǎng)基中細胞貼壁達70%~80%后,進行分組。將細胞分為正常組、高糖組、糖絡(luò)寧組、miR-211 抑制劑陰性組和miR-211 抑制劑組。正常組給予10%空白血清+神經(jīng)元專用培養(yǎng)基;高糖組給予10%空白血清+高糖神經(jīng)元專用培養(yǎng)基(含50 mmol/L 葡萄糖);糖絡(luò)寧組予10%糖絡(luò)寧含藥血清+高糖神經(jīng)元專用培養(yǎng)基;miR-211 抑制劑陰性組和miR-211 抑制劑組分別先予空載體和miR-211 抑制劑載體轉(zhuǎn)染DRGn 細胞,再予10%空白血清+高糖神經(jīng)元專用培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組細胞干預(yù)24 h,隨后收集細胞進行相關(guān)檢測。

    1.4.3 流式細胞儀檢測 經(jīng)胰酶消化、1 000 次/min 重復(fù)5 min 二次離心(離心半徑95 mm,溫度4℃)及稀釋(調(diào)節(jié)濃度為1×105~5×105個/ml)后收集細胞懸液于流式管中。室溫避光孵育,孵育5 min 后加入10 μl碘化丙錠溶液、400 μl PBS,立刻進行流式檢測,用Cell Quest 軟件進行分析,繪制雙色散點圖。

    1.4.4 實時熒光定量PCR 提取各組實驗細胞miR-211,使用BeyoRTTMⅡcDNA 第一鏈合成試劑盒將miR-211合成cDNA,根據(jù)引物設(shè)計原則,利用Primer 6 設(shè)計合成引物,引物序列見表1。取上述cDNA 及對應(yīng)引物,開始qRT-PCR 反應(yīng)程序,反應(yīng)體系共20 μl:cDNA 2 μl,master mix 10 μl,正向引物1 μl,反向引物1 μl,ddH2O 6 μl。反應(yīng)條件見表2。每次反應(yīng)均設(shè)陰性平行對照組,實驗重復(fù)3 次,根據(jù)得到的熒光信號計算Ct 值及基因的相對表達量。

    表1 miR-211 引物序列

    表2 聚合酶鏈式反應(yīng)條件

    1.4.5 Western blot 采用細胞懸液5 倍體積的細胞裂解液,提取總蛋白,經(jīng)BCA 試劑盒進行濃度測定后,SDS-PAGE 法分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,5%脫脂奶粉溶液封閉搖動1 h,采用兔PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜,并用HRP 標記山羊抗兔IgG(H+L)室溫下孵育60 min(1∶4 000),最終顯色成像獲得蛋白條帶,Image J 軟件計算灰度值。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 26.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差()表示,比較采用t 檢驗。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 五組細胞凋亡率比較

    高糖組細胞凋亡率高于正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。高糖組與miR-211 抑制劑陰性組細胞凋亡率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。糖絡(luò)寧組和miRNA-211 抑制劑組細胞凋亡率低于高糖組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見圖1~2。

    圖1 各組細胞凋亡率散點圖

    圖2 五組細胞凋亡率比較(n=3)

    2.2 五組miR-211 基因表達情況比較

    高糖組miR-211 基因表達高于正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。高糖組與miR-211 抑制劑陰性組miR-211 基因表達比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。糖絡(luò)寧組和miR-211 抑制組miR-211 基因表達低于高糖組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見圖3。

    圖3 五組miR-211 基因表達情況比較(n=3)

    2.3 五組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達水平比較

    高糖組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達水平高于正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。高糖組與miR-211 抑制劑陰性組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。糖絡(luò)寧組和miRNA-211抑制組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達水平低于高糖組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見圖4~5。

    圖4 五組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達條帶圖

    圖5 五組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達水平比較

    3 討論

    糖尿病周圍神經(jīng)病變屬于中醫(yī)“消渴病痹癥”范疇,以氣虛血瘀或陰虛血瘀,氣陰兩虛夾瘀,陰陽兩虛夾痰瘀,陽虛寒凝,肝腎虧虛的規(guī)律動態(tài)演變[13-15]。高彥彬教授基于絡(luò)病理論,認為其病機本質(zhì)為氣陰兩虛、脈絡(luò)瘀阻,治療上強調(diào)以滋陰補氣、活血化瘀通絡(luò)為要,研制出中藥成方糖絡(luò)寧,臨床療效確切[16]。經(jīng)既往研究證實,糖絡(luò)寧可以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的損害,抑制坐骨神經(jīng)及施萬細胞中PERK/IRE1α-CHOP、PI3K/Akt通路的表達,改善施萬細胞及DRGn 細胞凋亡[17-22]。

    目前臨床普遍認為,血糖升高會激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,長期持續(xù)的應(yīng)激和細胞損傷啟動細胞凋亡,但在應(yīng)激背景下如何協(xié)調(diào)其他通路啟動細胞凋亡,其轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵節(jié)點仍在探索。研究發(fā)現(xiàn),PERK 信號依賴性的miR-211 可以抑制生物鐘協(xié)調(diào)新陳代謝和晝夜節(jié)律,限制蛋白質(zhì)超負荷,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下調(diào)節(jié)凋亡的潛在靶點[23]。本團隊前期通過基因芯片篩選發(fā)現(xiàn),糖絡(luò)寧對DPN 的治療作用與miR-211 的下調(diào)有關(guān)[24],基于前期實驗提出設(shè)想:糖絡(luò)寧可能通過作用于miR-211下調(diào)PERK/CHOP 凋亡通路而保護背根神經(jīng)元。本研究結(jié)果顯示,高糖組細胞miR-211 與PERK/CHOP通路均顯著升高,且呈現(xiàn)出高凋亡率,提示高糖誘導(dǎo)下的背根神經(jīng)節(jié)中,miR-211 顯著過表達可促進DRGn 細胞中PERK/CHOP 通路的表達及細胞凋亡,可能導(dǎo)致細胞功能障礙。糖絡(luò)寧組DRGn 細胞凋亡率降低,miR-211 和PERK/CHOP 通路表達下調(diào),達到與miR-211 基因沉默的相似效果,提示糖絡(luò)寧可能通過作用于miR-211 下調(diào)凋亡通路而保護DRGn細胞,治療DPN。

    DPN 是糖尿病并發(fā)癥中較為特殊的一種,治療局限在預(yù)防性管理與疼痛控制上[25-28],針對病理機制的治療方法仍在探索。目前臨床主要關(guān)注神經(jīng)在營養(yǎng)超負荷下的能量代謝問題,糖尿病營養(yǎng)物質(zhì)代謝紊亂時神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體功能如何調(diào)節(jié)、過量葡萄糖和脂質(zhì)對神經(jīng)能量的作用是否協(xié)同一致等尚未被解釋。針對神經(jīng)的能量利用是開發(fā)DPN 有效療法的途徑,miRNA 被認為是其中的關(guān)鍵靶點[29]。本研究從細胞角度分析糖絡(luò)寧對DPN 模型大鼠背根神經(jīng)元凋亡的作用,結(jié)果顯示其機制與抑制miR-211 表達有關(guān),但miR-211 如何靶向調(diào)控基因抑制凋亡及糖絡(luò)寧如何抑制miR-211 的表達仍需進一步探索。

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