5種藥食兼用菊花揮發(fā)性有機(jī)物的HS-GC-IMS與指紋圖譜

丁云龍 王浩東,2 唐國(guó)瑋 田 星,3

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2. 湖南口味王集團(tuán)有限責(zé)任公司，湖南 益陽(yáng) 413056；3. 湖南省康德佳林業(yè)科技有限責(zé)任公司，湖南 永州 425600)

菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)是一種傳統(tǒng)的藥食同源植物，有著悠久的食用歷史，含有豐富的維生素、礦物質(zhì)及微量元素。目前，市場(chǎng)上的菊花加工產(chǎn)品種類繁多(如菊花茶餅、菊花醬、菊花釀、菊花茶等)，但關(guān)于菊花的研究主要集中在藥用菊花生物活性、營(yíng)養(yǎng)繁殖和栽培技術(shù)等方面，而對(duì)于食用菊花的風(fēng)味品質(zhì)研究則鮮有報(bào)道[1-2]。

目前，揮發(fā)性風(fēng)味成分檢測(cè)的技術(shù)主要有固相微萃取—?dú)庀嗌V—質(zhì)譜(SPME-GC-MS)[3]、電子鼻和聯(lián)用技術(shù)[3-4]、全二維氣相色譜—質(zhì)譜技術(shù)(GC×GC/TOFMS)[5-6]、氣相色譜嗅聞分析(GC-O)[7-8]、高效液相色譜(HPLC)[9]以及頂空固相微萃取和氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME/GC-MS)[10]等技術(shù)，但上述方法或存在氣體傳感器陣列漂移現(xiàn)象，或存在檢測(cè)靈敏度易受溫度、濕度、樣品性狀穩(wěn)定性等外界環(huán)境因素影響，或存在前處理復(fù)雜及應(yīng)對(duì)復(fù)雜樣品分析復(fù)雜、對(duì)未知成分無(wú)法較好地定性等問(wèn)題[11-13]。

頂空氣相色譜—離子遷移譜(HS-GC-IMS)是一種基于氣相色譜法和離子遷移譜儀聯(lián)用的新技術(shù)，可以檢測(cè)未經(jīng)預(yù)處理的液體或固體樣品中揮發(fā)性有機(jī)物的指紋，并能更全面地保留樣品的風(fēng)味物質(zhì)[14]。由于其具有靈敏度高、響應(yīng)快、分析高效、樣品無(wú)需預(yù)處理以及操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，已被用于食品中揮發(fā)性化合物的檢測(cè)[15-16]，而在菊花揮發(fā)性成分分析中的應(yīng)用較少，尤其是在對(duì)不同品種菊花揮發(fā)性成分的指紋圖譜分析中的應(yīng)用方面尚未見(jiàn)報(bào)道。

研究擬以5種不同品種藥食兼用菊花(金絲皇菊、皇菊、杭白菊、亳菊、貢菊)為研究對(duì)象，采用HS-GC-IMS技術(shù)對(duì)菊花中復(fù)雜揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行采集和痕量分析，以期為菊花品種和產(chǎn)地鑒別、揮發(fā)性風(fēng)味成分特性的研究和品質(zhì)控制提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

金絲皇菊、皇菊：湖南省康德佳林業(yè)科技有限公司；

杭白菊：杭州巨佳茶葉有限公司；

亳菊、貢菊：安徽常富國(guó)藥有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

頂空氣相色譜—離子遷移譜儀器：FlavourSpec?型，山東海能科學(xué)儀器有限公司；

分析天平：E02140型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取1 g樣品置于20 mL頂空瓶中，80 ℃ 孵育20 min后進(jìn)樣。每個(gè)樣本進(jìn)行3次平行測(cè)定。

1.2.2 HS-GC-IMS測(cè)定條件 參考梁天一等[17]的方法并稍作修改，采用頂空氣相色譜—離子遷移譜(HS-GC-IMS)對(duì)不同品種菊花中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析。色譜柱類型：MXT-5 (15 m×0.53 mm，1 μm)，分析時(shí)間30 min，色譜柱溫度60 ℃，載氣/漂移氣：N2(純度≥99.999%)。載氣流量：初始流量2.0 mL/min，20 min內(nèi)線性升至100.0 mL/min，保持7 min，運(yùn)行時(shí)間15 min。漂移氣流量150 mL/min，IMS溫度45 ℃。采用自動(dòng)頂空進(jìn)樣，其條件為：進(jìn)樣體積200 μL，孵育時(shí)間20 min，孵育溫度80 ℃，進(jìn)樣針溫度85 ℃，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 使用HS-GC-IMS儀器自帶的分析軟件VOCal分析譜圖，應(yīng)用軟件內(nèi)置的NIST 2014保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)(美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所)和IMS 2019數(shù)據(jù)庫(kù)(山東海能科學(xué)儀器有限公司)對(duì)5種菊花的特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析。采用Reporter插件對(duì)5種菊花樣品的譜圖進(jìn)行直接比對(duì)，分析品種間的差異性。運(yùn)用Gallery Plot插件對(duì)5種菊花樣品的指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，定量比較不同品種菊花之間的揮發(fā)性有機(jī)物差異。采用Dynamic PCA插件生成動(dòng)態(tài)主成分分析圖和相似度分析圖，根據(jù)樣品相似度利用TBtools軟件得出關(guān)系矩陣，進(jìn)行5種菊花樣品間的動(dòng)態(tài)主成分分析和相似度分析以及快速區(qū)分種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性有機(jī)物的HS-GC-IMS譜圖對(duì)比分析

如圖1所示，不同品種菊花的特征揮發(fā)性物質(zhì)具有不同的HS-GC-IMS特征圖譜，其表現(xiàn)為在相同保留時(shí)間和漂移時(shí)間的情況下，揮發(fā)性有機(jī)物累積含量以及種類具有明顯差異，可以作為區(qū)分不同品種菊花指紋特征的依據(jù)。李冬玲[18]研究發(fā)現(xiàn)，菊花的種源或種是對(duì)其揮發(fā)性成分含量影響最大的因素。中國(guó)菊花品類多，分布廣，其生長(zhǎng)的地域差異會(huì)帶來(lái)溫度、濕度、光照等外界生長(zhǎng)環(huán)境的差異，從而影響菊花生長(zhǎng)過(guò)程中的次生代謝反應(yīng)以及其中小分子揮發(fā)性有機(jī)物的累計(jì)含量和組成，進(jìn)而導(dǎo)致其品質(zhì)、成分的差異[19]。因而可通過(guò)揮發(fā)性有機(jī)物的種類增減及含量識(shí)別不同品種的菊花。若要進(jìn)一步對(duì)不同品種菊花的揮發(fā)性物質(zhì)變化情況及其差異進(jìn)行研究，還需對(duì)各品種菊花的指紋圖譜進(jìn)行分析[20]。

圖1 5種菊花揮發(fā)性有機(jī)物的HS-GC-IMS定性分析

2.2 揮發(fā)性有機(jī)物的HS-GC-IMS定性分析

由圖1和表1可知，5種菊花中可識(shí)別出的揮發(fā)性物質(zhì)共有87種(74種單體及部分物質(zhì)的二聚體)，對(duì)87種物質(zhì)進(jìn)行分類，可分為10大類，其中酯類有22種(含4種二聚體)、醇類14種(含2種二聚體)、酮類8種、醛類17種(含4種二聚體)、羧酸類2種、醚類3種、呋喃類3種、噻唑類1種、吡嗪類1種、烯烴類16種(含3種二聚體)。

87種物質(zhì)中，1,8-桉葉素、莰烯、α-蒎烯等物質(zhì)在杭白菊和亳菊中含量較低，而在金絲皇菊、皇菊和貢菊中含量較高。其中屬于醇類的1,8-桉葉素，有類似樟腦氣味的特異芳香味，具有抗炎、抗菌殺菌、抗腫瘤等作用[21-22]，被廣泛應(yīng)用于中藥制劑中[23]，同時(shí)也可作為食品添加劑使用。屬于烯烴類的莰烯具有抗氧化作用，α-蒎烯有顯著的松香味[1]，α-松油烯可用作橘子香精香料的調(diào)配[24]。

根據(jù)物質(zhì)分類，對(duì)87種物質(zhì)的峰體積數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類加和，得圖2。由于物質(zhì)的峰體積與含量呈正比，因此峰體積值越大，物質(zhì)的含量越高。根據(jù)圖2可知，貢菊中揮發(fā)性物質(zhì)的總量明顯(P<0.05)高于其他4種菊花，主要是烯烴類物質(zhì)明顯(P<0.05)高于其他4種菊花，這些物質(zhì)的大量存在使得貢菊具有獨(dú)特濃郁的香氣。由此可知，5種菊花揮發(fā)性物質(zhì)含量由高到低的順序?yàn)椋贺暰?、金絲皇菊、皇菊、亳菊和杭白菊。

圖2 5種菊花中各類揮發(fā)性物質(zhì)峰體積數(shù)據(jù)柱狀圖

2.3 揮發(fā)性有機(jī)物的HS-GC-IMS指紋圖譜分析

為了進(jìn)一步研究不同品種菊花揮發(fā)性有機(jī)物變化情況及其差異，基于HS-GC-IMS分析軟件中的Gallery Plot插件，利用5種菊花樣品的二維圖譜中的待分析峰生成指紋圖譜見(jiàn)圖3。由圖3及表1可知，5種菊花的特征性風(fēng)味物質(zhì)差異性較大。對(duì)于不同品種菊花的特征性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行區(qū)域劃分：A區(qū)域?yàn)榻鸾z皇菊的特征峰區(qū)域，主要含有β-欖香烯、順式-石竹烯、肉桂酸乙酯等17種可檢出物質(zhì)；B區(qū)域?yàn)榛示盏奶卣鞣鍏^(qū)域，主要含有α-松油醇、3-蒈烯、香茅醇等22種可檢出物質(zhì)；C區(qū)域?yàn)樨暰盏奶卣鞣鍏^(qū)域，主要含有α-水芹烯、1-辛烯-3-醇、乙偶姻等24種可檢出物質(zhì)；D區(qū)域?yàn)橘窬盏奶卣鞣鍏^(qū)域，主要含有2-蒈烯、檸檬烯、丁酸丙酯等25種可檢出物質(zhì)；E區(qū)域?yàn)楹及拙盏奶卣鞣鍏^(qū)域，與亳菊特征峰區(qū)域有很大的重合部分，主要含有乙酸丁酯、乙酸丙酯、檸檬烯等24種可檢出物質(zhì)。菊花中主要存在的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為烴類及其含氧衍生物(萜類化合物)，與周根等[25]、Yang等[26]的研究結(jié)果基本一致。

每一行代表一個(gè)樣品中選取的全部信號(hào)峰 每一列代表同一物質(zhì)在不同樣品中的信號(hào)峰 1. 1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-環(huán)己二烯 2. 2-(4-甲基苯基)丙-2-醇 3. 2,5-二甲基呋喃 4. 2-乙?；秽?5. 正戊酸 6. 4-甲基-1-戊醇 7. α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇 8. 3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇 9. 1-丁醇 10. 異松油烯 11. 3,7,7-三甲基二環(huán)[4.1.0]庚-3-烯 12. 3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯 13. 4-甲基-2-戊酮 14. 2-甲基丁酸乙酯 15. 乙酸戊酯 16. 苯乙酸乙酯 17. 3-苯丙酸乙酯(二聚體) 18. 3-苯丙酸乙酯(單體) 19. 異戊酸甲酯 20. 乙酸冰片酯 21. 2-(4-甲基-3-環(huán)己烯基)-2-丙醇 22. [1R-(1R*,4Z,9S*)]-4,11,11-三甲基-8-亞甲基-二環(huán)[7.2.0]4-十一烯(單體) 23. [1R-(1R*,4Z,9S*)]-4,11,11-三甲基-8-亞甲基-二環(huán)[7.2.0]4-十一烯(二聚體) 24. 2-乙基呋喃 25. 苯甲醛(二聚體) 26. 正庚醛 27. 乙醇(二聚體) 28. 甲醇 29. 2,4,5-三甲基噻唑 30. 乙酸乙酯 31. 乳酸乙酯 32. 異戊酸乙酯 33. β-欖香烯(二聚體) 34. β-欖香烯(單體) 35. 正丁酸 36. 環(huán)己酮 37. 肉桂酸乙酯 38. 2-環(huán)己烯-1-酮 39. 2-乙基吡嗪 40. 乙酸丙酯 41. 乙酸丁酯(二聚體) 42. 乙酸丁酯(單體) 43. 二甲基硫 44. 二丙硫醚 45. 2-甲基丙醛 46. 1,4-二氧己環(huán) 47. 甲基庚烯酮 48. 順式-2-己烯醛 49. 己醛(二聚體) 50. 己醛(單體) 51. 辛醛 52. 戊醛 53. 苯甲醛(單體) 54. 丁酸丙酯 55. 丙酸丁酯(單體) 56. 丙酸丁酯(二聚體) 57. 糠醛(單體) 58. 糠醛(二聚體) 59. 3-甲基丁醛 60. 乙醇(單體) 61. 丙酮 62. 雙戊烯 63. 2-蒈烯 64. 正己醇 65. (2E,4E)-2,4-辛二烯醛 66. 2-甲基丙醇 67. 反式-2-戊烯醛(單體) 68. 反式-2-戊烯醛(二聚體) 69. 反式-2-己烯醛 70. 2-丁酮 71. 三環(huán)萜 72. 檜烯(二聚體) 73. 檜烯(單體) 74. 2-蒎烯 75. 樟腦萜 76. 1,8-環(huán)氧對(duì)孟烷(二聚體) 77. 1,8-環(huán)氧對(duì)孟烷(單體) 78. 3-羥基-2-丁酮 79. 1-烯-3-辛醇 80. 2-庚酮 81. 2-癸烯醛 82. α-水芹烯 83. 2-環(huán)己烯-1-醇 84. 苯甲酸乙酯 85. 乙酸-3-甲基丁酯 86～118. NF(未檢出)

表1 5種菊花HS-GC-IMS圖譜部分揮發(fā)性物質(zhì)定性結(jié)果

2.4 揮發(fā)性有機(jī)物的HS-GC-IMS動(dòng)態(tài)主成分分析及相似度分析

為了更好地呈現(xiàn)和區(qū)分不同品種菊花的揮發(fā)性有機(jī)物的相關(guān)性，采用Dynamic PCA插件程序繪制主成分分析圖。由圖4可知，從菊花的揮發(fā)性成分差異上來(lái)看5種菊花樣品兩兩之間的相似度均基本低于70%，說(shuō)明5種菊花之間的特征性的揮發(fā)性有機(jī)物有一定的差異，每個(gè)樣品均有其獨(dú)特的揮發(fā)性成分。同時(shí)，菊花品種間的差異以數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，PC1的貢獻(xiàn)率為43%，PC2的貢獻(xiàn)率為22%，兩者之和貢獻(xiàn)率達(dá)65%，說(shuō)明這兩部分代表了樣品的絕大部分信息。5個(gè)品種的菊花樣本之間的距離較大，說(shuō)明菊花的品種對(duì)于揮發(fā)性成分的影響較大，與Yang等[26]的結(jié)果，即不同品種菊花的揮發(fā)性成分分布具有顯著性差異保持一致。

圖4 5種菊花揮發(fā)性成分的主成分分析結(jié)果

3 結(jié)論

以5種不同品種的藥食兼用菊花(金絲皇菊、皇菊、杭白菊、亳菊、貢菊)為原料，基于頂空氣相色譜—離子遷移譜對(duì)不同品種菊花的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行了綜合分析，共檢測(cè)出87種揮發(fā)性有機(jī)物，綜合比對(duì)二維差異圖譜和指紋差異圖譜表明5種菊花的揮發(fā)性有機(jī)物累積含量和種類都有顯著性差異，采用動(dòng)態(tài)主成分分析對(duì)各品種樣品進(jìn)行分離，表明5種菊花之間的特征性風(fēng)味物質(zhì)有一定差異。

頂空氣相色譜—離子遷移譜可作為菊花揮發(fā)性成分分析的有效輔助技術(shù)，可通過(guò)指紋圖譜中特征成分的差異精確區(qū)分菊花的品種及地理來(lái)源差異，為菊花品種、產(chǎn)地鑒別提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。