芒果中SOD提取工藝的優(yōu)化

范 哲，顧廣源

(魯南技師學院， 山東 臨沂 276000)

1 引言

芒果呈不規(guī)則的橢圓狀，果肉肥厚，有核，口感細膩清甜，有“熱帶水果之王”的稱號[1，2]。芒果中含有大量的糖類、維生素、礦物質(zhì)、多種酶[3，4]等，其中超氧化物歧化酶含量較為豐富，是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶[5～7]。SOD是一種特殊的酶[8～11]，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，具有清除機體超氧陰離子、調(diào)節(jié)機體代謝[12，13]的作用。

目前，芒果的研究主要集中在育種、簡單粗加工，少有文獻報道其抗氧化性。鑒于此，本文通過實驗探究SOD提取的最適條件[14～16]。采用單因素實驗，通過設(shè)置提取溶劑、料液比、浸提時間、超聲功率及時間5個單因素[17～19]，得到最優(yōu)值后利用正交實驗獲得最佳提取工藝[20，21]，為芒果的開發(fā)利用提供方向。

2 材料與方法

2.1 實驗材料與儀器

2.1.1 儀器

KQ-A100DE型數(shù)控超聲波清洗器，KHB-ST360型自動多功能酶標儀，DWF-100型電動植物粉碎機，冰箱、離心機、分析天平、離心管、錐形瓶、移液槍等。

2.1.2 材料及試劑

芒果、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、丙酮、SOD檢測試劑盒(雷根生物)等。

2.1.3 PBS試劑的配制

母液：試劑一：0.05 mol/L Na2HPO4·12H2O ,試劑二：0.05 mol/L NaH2PO4·2H2O (表1)。

表1 不同pH值PBS的配制 mL

2.1.4 SOD試劑盒(NBT核黃素微板法)

NBT工作液的制備及SOD試劑盒加樣表見表2、表3。

表2 NBT工作液的制備 μL

表3 SOD試劑盒加樣 μL

2.2 實驗方法

2.2.1 材料處理

取市售芒果洗凈削皮去核，果肉在粉碎機打碎，經(jīng)多次紗布過濾至無纖維等肉眼可見雜質(zhì)，濾紙進行過濾。濾液至離心管，離心去除雜蛋白和沉淀，得上清液。

2.2.2 SOD的分離提取及純化

2.2.2.1 提取溶劑pH值的篩選

取上清液5 mL于試管中，加入等體積的提取溶劑，0.5 h的時間浸提，提取溶劑為以下 6 種：pH=7.0、pH=7.2、pH=7.4、pH=7.6、pH=7.8、pH=8.0的0.05 mol/L PBS緩沖液。浸提0.5 min后，離心取上清液。加入等體積的預冷丙酮4 ℃條件下冷藏過夜，有白色絮狀物質(zhì)和膠狀物質(zhì)析出，過濾去除雜質(zhì)。離心取上清液，得粗酶液。

2.2.2.2 溶劑的料液比

取上清液5 mL于試管中，以pH為7.2的0.05 mol/L的PBS作為提取溶劑,料液比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7。浸提0.5 h后,離心除去沉淀。取上清液于試管中，預冷丙酮4℃低溫過夜,離心取上清液。

2.2.2.3 提取時間的篩選

取上清濾液3 mL于試管中，以1∶5的比例加入0.05 mol/L PBS緩沖液浸提：分別浸提0.5 h、1 h、 1.5 h、2 h、2.5 h。

2.2.2.4 超聲功率篩選方法

取上清濾液5 mL于多個試管中，分別加入0.05 mol/L PBS緩沖液進行超聲。分別在400 W、500 W、600 W、700 W、800 W、900 W、1000 W的條件下超聲10 min。對7組待測樣離心除渣，取上清液，加入等體積預冷的丙酮，混合后放在冰箱4 ℃的條件下低溫過夜。過濾再進行離心,取上清液。

2.2.2.5 超聲時間的篩選方法

取上清濾液5 mL于多個試管中，分別加入0.05 mol/L PBS緩沖液后超聲。超聲功率900 W，超聲時間10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、50 min、60 min。

2.2.3 SOD的鑒定

將SOD試劑盒中各試劑按照說明書加入點樣板后，分別加入20 uL待測樣液作為實驗組。將待測液換為SOD酶溶液進行點樣作為光照對照組。強光直射30 min，出現(xiàn)明顯的顏色變化，在酶標儀上進行測定。

2.2.4 正交試驗的設(shè)計

根據(jù)每個單因素試驗，得到相對較優(yōu)的提取條件，進行多水平的實驗設(shè)計選擇較為敏感的水平和因素(表4、表5)[13]。

表4 正交設(shè)計實驗因素水平

表5 正交設(shè)計實驗因素

2.2.5 數(shù)據(jù)處理

本實驗的數(shù)據(jù)處理及圖表制作均采用Excel和SPSS等軟件整理。

3 結(jié)果與分析

3.1 實驗結(jié)果及分析

3.1.1 提取溶劑pH值的確定

pH值為7.2的PBS溶液OD值最大，后隨著pH值的增加，OD值反而越來越小。所以pH值為7.2的PBS為較好的提取溶劑,并用于后續(xù)單因素試驗(圖1)。

圖1 提取溶劑pH對SOD值的影響

3.1.2 提取料液比的確定

料液比在1∶1～1∶5時，隨著浸取液的增加OD值不斷增加，并在1∶5處得到最大值0.411。料液比為1∶5～1∶7的OD值呈現(xiàn)下降趨勢，可選擇在料液比為1∶5或1∶6。為節(jié)約試劑,可選擇料液比1∶5用于后續(xù)正交實驗(圖2)。

圖2 料液比對SOD值的影響

3.1.3 浸提時間的確定

從圖3中可得，浸提時間從0.5 h到1.5 h，OD值不斷向上增長，在1.5 h出現(xiàn)最高點，值為0.485，1.5 h后呈現(xiàn)下降趨勢。所以浸提時間選擇1.5 h。

圖3 溶劑浸提時間對SOD值的影響

3.1.4 超聲功率的確定

隨著超聲功率的升高OD值出現(xiàn)緩慢上升的趨勢，這是因為通過超聲機械振動可加快分子間的運動速度和頻率，增加提取溶劑的提取效果率。但隨著超聲功率升高到900 W，OD值下降。綜上，在900 W處有最大值,為最優(yōu)的超聲提取功率(圖4)。

圖4 超聲功率對SOD值的影響

3.1.5 超聲時間的確定

隨著超聲時間的延長，OD值呈上升趨勢，30 min達到最大值0.469，之后隨時間的延長呈下降趨勢。因此選擇超聲時間30 min進行后續(xù)實驗(圖5)。

圖5 超聲時間對SOD值的影響

3.2 正交試驗確定最優(yōu)提取條件

正交實驗得出SOD的最佳提取條件為：以pH值為7.1，0.05 mol/L的PBS緩沖液為提取溶劑，在料液比為1∶4，用超聲進行輔助提取，超聲時間和功率為28 min、800 W。正交試驗得到最佳組合為A1B1C1D1以及各因素的關(guān)鍵性對比為D(超聲時間)>B(料液比)>A(提取溶劑)>C(超聲功率)(表6)。

表6 正交設(shè)計實驗因素結(jié)果

4 結(jié)論

在芒果SOD的提取及抗氧化能力的實驗中，考察了提取溶劑pH值、超聲功率、超聲時間、料液比、浸提時間5個影響因素。正交實驗得到最佳的組合為pH值為7.1，0.05 mol/L的PBS緩沖液為提取溶劑，料液比為1∶4，超聲時間和功率為28 min、800 W進行輔助提取。通過實驗得到最佳的提取條件，為芒果SOD的提取提供了參考。