一株G4P[X]型豬A群輪狀病毒的分離與鑒定

傅安靜,黃名英*,張斌

一株型豬A群輪狀病毒的分離與鑒定

傅安靜1,黃名英1*,張斌2**

1. 成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院, 四川 成都 610041 2. 西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院, 四川 成都 610041

為了分離并鑒定一株A群豬輪狀病毒(PoRV)。本文通過MA-104細胞分離培養(yǎng)、間接免疫熒光鑒定、RT-PCR鑒定以及全基因序列遺傳進化對一份PoRV陽性糞便樣本進行了分離與鑒定。經(jīng)RT-PCR和間接免疫熒光證實為PoRV，命名為JC-3，基因型為G4-P[X]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T7-E1-H1，根據(jù)同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，JC-3株、、、、和基因與PoRV相似性最高，高達95.4%～99.7%，而、、、與人源A群輪狀病毒(GAR)相似性最高，達94.6%～98.5%，表明該病毒基因組發(fā)生了重排。本研究成功分離一株豬源PoRV，基因型為，為以后對該毒株的致病性研究奠定了基礎。

豬; A群輪狀病毒; 分離; 鑒定

輪狀病毒（Rotavirus，RV）屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，為雙股RNA病毒[1]。輪狀病毒首次于1969發(fā)現(xiàn)存在于腹瀉的犢牛糞便中，隨后在人、豬、綿羊、馬、犬、貓、兔、鼠、猴及家禽均有發(fā)現(xiàn)，全球均有相關報道[2,3]。豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PoRV）是引起仔豬病毒性腹瀉的常見病原體之一，主要臨床癥狀為黃色水樣糞便并伴有嘔吐。由于其流行范圍廣且發(fā)病率高，如果與其他病原體混合感染會導致病情加重，死亡率升高，給畜牧業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[4,5]。

輪狀病毒包含6種結構蛋白（VP1～4，VP6～7）和5種非結構蛋白（NSP1～5）[6]。衣殼抗原VP6是一種群體特異性抗原，決定了RV血清群的特異性，是一種關鍵的免疫原性蛋白。根據(jù)VP6，輪狀病毒被分為七個血清群和血清型，包括A-G。其中A群又被稱為典型輪狀病毒，其余6個血清群又稱為非典型性輪狀病毒或副輪狀病毒（Pararotavirus）。此前，豬輪狀病毒被分為四個血清群（A、B、C和E）[7]。VP4結構蛋白由RV基因組的第4號基因編碼，它是一種非糖基化的胰蛋白酶敏感蛋白，具有血凝特性。它使一種病毒粘附蛋白會使病毒具有致病性。在有胰蛋白酶的情況下，VP4會裂解成兩個亞單位蛋白，從而增強輪狀病毒感染宿主細胞的能力，增加豬輪狀病毒對體外細胞的適應性，并增強病毒自身的生長和復制能力。VP7結構蛋白由RV基因組的第7、8或9號基因編碼（取決于不同的病毒株）[8]。它是病毒外膜的一個主要糖蛋白，也是輪狀病毒的一個重要中和抗原。它包含一個開放閱讀框（ORF），長度約為1062 bp，約占病毒蛋白總量的30%。此外，VP7有糖基化位點，其作用和糖基化位點對VP7的抗原性可能有不同的影響，VP7的糖基化可能會降低抗體結合能力。由于VP7是Ca2+結合的主要蛋白，對PoRV的形狀、包膜蛋白的穩(wěn)定性和病毒的成熟度非常重要[9]，VP7抗原決定簇多為構象性，空間形態(tài)復雜，對開發(fā)針對豬輪狀病毒的疫苗構成了挑戰(zhàn)。

輪狀病毒的感染具有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生于晚秋、冬季和早春。在少數(shù)地區(qū)全年流行，在世界范圍內廣泛存在[10]。A群輪狀病毒存在I型、P型和G型三種基因型，其中I型18種，P型37種，G型27種。中國報道的I型有3種，以I5型最為普遍，P型有6種，以P[13]型、P[23]型和P[19]型為主，G型7種[11]。本研究從仔豬腹瀉糞便樣本中檢測出一株豬A群輪狀病毒，對其開展分離、鑒定和進化分析，為后續(xù)PoRV的流行病學、病原學、分子生物學和疾病防控研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

疑似輪狀病毒陽性腹瀉仔豬的糞便樣本；恒河猴腎細胞系（MA-104細胞）；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIbco；胰蛋白酶購自Sigma；氯仿和異丙醇購自天津智源化學試劑有限公司。PrimescriptTM、pMD19-T克隆載體、TrizolTM Reagent、和2×Taq PCR Master Mix均購自TaKaRa；DNA Marker II購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料處理及病毒的分離培養(yǎng)對來自四川省某養(yǎng)殖場所送檢的疑似PoRV感染的仔豬糞便樣本參照1:5的比例與PBS預混液渦旋混勻，置于-80 ℃冰箱反復凍融3次，使細胞破裂析出病毒。1000 rpm/min 4 ℃離心10 min，去沉淀，3000 rpm/min 4 ℃離心10 min，取上清過0.22 μm濾器除去細菌。接毒前，將MA-104細胞在細胞瓶中鋪滿約90%單層細胞，接毒時，在處理后的樣本上清液中加入10 μg/μL的胰蛋白酶，放入37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱激活1 h后，用滅菌后的PBS將鋪好單層細胞的培養(yǎng)瓶清洗2遍后，將已激活的樣本添加進培養(yǎng)瓶，在恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h后將有胰蛋白酶的無血清DMEM培養(yǎng)液補足5 mL。最后，在細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天觀察細胞病變，當CPE達到80%以上時收集病毒液，反復凍融3次，重復以上操作連續(xù)傳代5次后，再進行3次蝕斑純化，成功得到單一病毒，收集后置于-80 ℃保存。

1.2.2 間接免疫熒光細胞在96孔板中形成CPE后，棄細胞維持液，用PBS（pH=7.4）沖洗3次，每次1 min；每孔加入1 μL 80%冰丙酮，在4 ℃下固定10 min；棄80%冰冷的丙酮，用PBS沖洗3次，每次1 min；每孔加入1 μL 3% BSA，室溫下放置30 min。棄BSA液體，用PBS沖洗3次，每次1 min；在每個孔中加入1 μL1:400稀釋的一抗（抗輪狀病毒基因多克隆抗體），在37 ℃孵育45 min。孵育后，用PBS清洗3次，每次1 min；加入1:1000稀釋的FITC標記的兔抗羊IgG第二抗體。孵化后，用PBS洗3次，每次3 min，用熒光倒置顯微鏡觀察細胞核周圍的有無特異性綠色熒光。

1.2.3 PoRV的全基因擴增用TRIzol法提取病毒總RNA，用PrimeScriptTM RT試劑盒逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)參考文獻[12]中發(fā)表的豬輪狀病毒A組全基因的擴增引物合成引物。PCR反應體系和PCR反應條件（表1），用純化的PCR產(chǎn)物連接pMD19-T載體，轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將陽性重組質粒在生物工程（上海）有限公司進行測序。全基因組在NCBI進行了比對和分型。

PCR的反應條件：94 °C 欲變性 2 min；94 °C變性15 s，51 °C退火20 sec，68 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃ 8 min，16 ℃（或4 ℃）保存。

表 1 RT-PCR 擴增全基因的反應體系

1.2.4 分離病毒分子特征分析使用SimPlot、MEGA X、Megalign、RDP4和其他程序將序列與從GenBank下載的完整PoRV基因序列比較；使用RotaC V2.0在線分型工具對病毒分離物進行基因分型，使用MEGA X用接近法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用RDP4和SimPlot重組分析程序進行重組分析。

2 結果與分析

2.1 病毒的分離與鑒定

將疑似PoRV感染仔豬糞便樣本用胰酶處理后，用MA-104細胞接種，盲傳五代。接毒48 h后，出現(xiàn)典型的CPE，主要表現(xiàn)為細胞變圓和拉網(wǎng)現(xiàn)象，細胞脫落隨時間增加。正常的MA-104細胞沒有發(fā)生CPE，經(jīng)過三代噬斑純化和RT-PCR檢測，初步確定分離出了一個PoRV菌株。對照組MA-104細胞生長良好，細胞形態(tài)清晰。經(jīng)過三代噬斑純化后，通過RT-PCR檢測結果，初步確定分離出一株PoRV毒株。對病毒進行間接免疫熒光檢測（IFA），并在倒置的熒光顯微鏡下觀察。在背景干凈的正常細胞中沒有檢測到熒光（圖1A），這說明陰性對照成立；在分離株感染細胞胞漿中發(fā)現(xiàn)了特定的綠色熒光（圖1B）。結果表明，成功從仔豬糞便中分離出一株PoRV。為了進一步觀察分離出的病毒的形態(tài)，用2%的磷鎢酸對濃縮的細胞培養(yǎng)物進行負染，進行電子顯微鏡檢查，在透射電鏡下觀察到有直徑約為70 mm的似典型的車輪狀病毒顆粒（圖2）。

圖 1 PoRV分離株IFA鑒定

圖 輪狀病毒電鏡圖

2.2 分離株全基因組遺傳分子特征分析

根據(jù)參考文獻[12]設計引物，采用RT-PCR對分離株全基因進行擴增，經(jīng)轉化克隆測序后，得到全基因全長17453 bp，將該毒株命名為JC-3，對分離株的全基因分段進行序列分析，并利用在線分型工具RotaC v2.0對其基因型進行鑒定，結果顯示分離株的基因型為G4-P[X]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T7-E1-H1。選取不同G4譜系的GAR株，利用MEGA7.0中臨近法構建進化樹，結果表明，JC3與RVA/Pig-wt/VNM/14226_39越南株親緣關系最近，同源性最高，可達到98.3%，同為G[4]型。通過遺傳進化樹分析（圖3），分離株的與GenBank上公布的序列同源性最高僅85%，不足以確定其P型，所以暫定為P[X]。而分離株的、、、、、與豬源的、、、、、同源性更高，分別為98%、94.6%、95.4%、97.2%、99%、99.7%。而、、節(jié)段與人源、、的同源性更高，同源性分別為98.5%、96.2%、97.3%，提示JC3可能為人豬重配毒株。利用RDP4和SimPlot軟件對分離株JC3的全基因組進行重組分析，發(fā)現(xiàn)該毒株不滿足重組毒株條件，所以為非重組毒株。

圖 3 分離株JC3與參考毒株的遺傳進化關系

3 討論

豬輪狀病毒（Porcine rotavirus, PoRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis, TGEV）和豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea, PEDV）是引起仔豬腹瀉的三種重要原因[13]。RV在體內通常是感染絨毛上皮細胞，在體外可用恒河猴腎細胞系(MA-104細胞)培養(yǎng)。Bohi EH等[14]用MA-104細胞成功分離出輪狀病毒。后相繼有學者應用人克隆細胞CaCo-2[15]、Vero細胞[16]、恒河猴胎腎細胞(Marc-145細胞)[17]和豬小腸細胞IRBSⅡ等成功分離出輪狀病毒[18]。

由于其VP4基因編碼的衣殼蛋白阻礙了病毒在細胞培養(yǎng)物上的生長，所以RV在體外不易獲得，并且難以分離培養(yǎng)[19]。而體外分離培養(yǎng)中，胰酶的加入可以使衣殼蛋白VP4裂解為VP5和VP8，從而有助于病毒脫殼感染細胞，因此胰酶的處理對于分離輪狀病毒至關重要。故本實驗先用10 μg/μL的胰蛋白酶與病毒液混合后于37 ℃激活1 h，后接種于本實驗室保存的MA-104傳代細胞，盲傳至出現(xiàn)以細胞界限不清、固縮、破裂為典型的CPE，經(jīng)RT-PCR檢測結果為陽性。該結果證明了，PoRV已經(jīng)成功在MA-104細胞生長繁殖。根據(jù)PoRV的分子流行病學調查，全世界存在不同的豬輪狀病毒A組G和P基因型，在不同的地理區(qū)域發(fā)現(xiàn)了新的PoRV血清群，越來越多的報告表明PoRV的流行病學非常復雜且動態(tài)性很強，現(xiàn)在PoRV的流行率和遺傳多樣性比以前更高。

RV在其進化過程中很容易發(fā)生不同基因段之間的重組。在一些發(fā)展中國家，特別是在人類和動物棲息地相近或相交的地方，RV的種間傳播也很常見。在中國，不同的牲畜養(yǎng)殖方式并存和復雜的生態(tài)環(huán)境為RV物種的傳播和變異創(chuàng)造了條件。根據(jù)JC-3的進化樹和同源性分析結果顯示，該分離株有部分基因與人源輪狀病毒和豬源輪狀病毒同源性非常高，推測進化過程中這些病毒發(fā)生過重組，可能在人與動物之間發(fā)生交叉感染，對于人類一般不感染豬源輪狀病毒的認識給予一定的質疑，可以作為新的研究方向。

4 結論

這項研究成功地分離出了輪狀病毒JC-3，并在MA-104細胞上產(chǎn)生了穩(wěn)定的病變，為豬輪狀病毒A的流行病學、發(fā)病機制和分子生物學奠定了基礎，同時對病毒感染機理和傳播范圍的認識以及對于疾病的防控也具有重要意義。

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Isolation and Identification of One Strain ofPorcine A Group Rotavirus

FU An-jing1, HUANG Ming-ying1*, ZHANG Bin2**

1.610041,2.610041,

To isolate and identify a group A porcine rotavirus (PoRV). A PoRV-positive stool sample was isolated and identified by MA-104 cell isolation and culture, indirect immunofluorescence identification, RT-PCR identification and sequence analysis. After screening the virus strain by ordinary PCR, PoRV was confirmed by RT-PCR and indirect immunofluorescence, named JC-3, and the genotype was G4-P [X] -I5-R1-C1-M1-A8-N1-T7-E1-H1. Homology analysis showed that the gene identities of,,,,andof JC-3 strain were the highest with PoRV, up to 95.4% ～ 99.7%, while,,andhad the highest similarity with human group A rotavirus (GAR), up to 94.6% ～ 98.5%, indicating that the virus may be a human-pig reassortant strain and may have undergone recombination phenomenon. However, no recombination phenomenon was found by recombination analysis. In this study, we successfully isolated a pig-derived PoRV with genotype], which laidthe foundation for subsequent studies on its pathogenicity.

Pig;A group rotavirus; isolation; identification

S828/S852.2

A

1000-2324(2022)04-0629-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.04.020

2022-03-04

2022-04-14

成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院院級孵化(自然科學)重點項目(22ZR107)

傅安靜(1976-),男,碩士研究生,高級獸醫(yī)師,研究方向:預防獸醫(yī)學. E-mail:603006944@qq.com

黃名英(1977-),女,碩士研究生,正高級獸醫(yī)師,研究方向:預防獸醫(yī)學. E-mail:376979067@qq.com

Author for correspondence. E-amil:binovy@sina.com