多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)不同采收期對(duì)北五味子質(zhì)量影響

范三鵬，陳巍，齊壯博，魏江春，楊用成，胡高升，賈景明

(沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016)

北五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)為木蘭科(Magnoliaceae)五味子屬(Schisandra)藥用植物，藥用部位為干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱(chēng)北五味子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》被列為上品中藥材[1-2]。五味子果實(shí)進(jìn)入秋季后果實(shí)顏色逐漸由青綠色變?yōu)榧t色或暗紅色，成熟的五味子果肉質(zhì)地比較柔軟，將果實(shí)曬干并除去摻雜的葉片、果梗等雜質(zhì)，即為五味子藥材。五味子種子呈腎形，每顆果實(shí)有1～2粒種子，將種子搗碎后有油狀物并伴有特殊香氣，味辛、微苦。中國(guó)藥典收載五味子有兩種：五味子(S.chinensis(Turcz.)Baill.)(即北五味子)及華中五味子(S.sphenantheraRehd. Et Wils.)(即南五味子)[1]?！侗静菥V目》有記載指出：“五味子今有南北之分，南產(chǎn)者紅北產(chǎn)者黑，入滋補(bǔ)藥，必用北者為良”[3]。五味子是一種廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和保健食品的藥材，可作為滋補(bǔ)、鎮(zhèn)靜和促進(jìn)劑。常用于治療久嗽虛喘、尿頻、久瀉、盜汗、心悸、失眠等[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，木脂素是五味子果實(shí)中重要的活性成分，具有保護(hù)肝臟、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化等豐富的生物活性[5-7]。有機(jī)酸也是五味子的主要成分之一，具有止咳化痰的有益藥理作用[8]。木脂素的含量受果實(shí)成熟度、采收時(shí)間、生長(zhǎng)環(huán)境和產(chǎn)地的影響。原料采收時(shí)間的確定多以民間傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)為依據(jù)，缺乏科學(xué)依據(jù)，導(dǎo)致木脂素含量變化較大[9]。不同的生態(tài)環(huán)境會(huì)導(dǎo)致植物產(chǎn)生和積累各種特殊的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致五味子的品質(zhì)參差不齊[10]。有研究表明，同一種中草藥質(zhì)量差異的主要原因是藥用成分的數(shù)量或比例的差異[12]。五味子的藥理作用是由其多種化學(xué)成分決定的[13-14]，例如，木脂素、多酚、多糖、有機(jī)酸等都有藥理作用，但作用不同 。對(duì)于五味子的質(zhì)量控制，2020年版《中國(guó)藥典》將五味子醇甲作為五味子的唯一質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。目前許多五味子化學(xué)分析研究大多集中于某些化合物或某些活性成分[15]。為了進(jìn)一步研究五味子的質(zhì)量控制，確定合理的采收期，僅對(duì)特定的木脂素進(jìn)行分析是不夠的。尤其在五味子果實(shí)成熟期，果實(shí)生物量的積累遠(yuǎn)大于活性成分的積累，現(xiàn)有研究表明[15]五味子在成熟時(shí)期，五味子中木脂素的含量都出現(xiàn)明顯的降低，因此僅以木脂素的含量來(lái)確定五味子的采收期存在一定的片面，應(yīng)通過(guò)多指標(biāo)，多角度綜合分析，確定五味子的采收期。通過(guò)測(cè)定不同采收期五味子中多種生物活性成分的積累情況，綜合評(píng)價(jià)五味子質(zhì)量。主要目的是研究不同采收時(shí)期對(duì)五味子中木脂素、有機(jī)酸、總多酚、和花色苷的影響，對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)一步確定了最佳采收時(shí)期。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與前處理

研究中使用的五味子采自中國(guó)本溪市“關(guān)門(mén)”山區(qū)(124°53′39.2″E 41°14′24.9″N)。采收時(shí)間于6月底開(kāi)始。從五味子開(kāi)始結(jié)果到果實(shí)成熟，每隔約15 d采集1次果實(shí)。6月29日(HV1)，7月14日(HV2)，8月5日(HV3)，8月23日(HV4)，9月8日(HV5)，9月20日(HV6)。

每個(gè)采收期隨機(jī)采集3組樣品，每組隨機(jī)選取10個(gè)果實(shí)，人工將其果肉和種子分離，并用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干樣品，用研缽研成粉末保存于10 mL EP管中。精密稱(chēng)取樣品粉末50 mg并加入1.5 mL甲醇，精密稱(chēng)取重量。將上述樣品超聲(功率250 w，頻率40 khz)30 min，冷卻至室溫，再次精密稱(chēng)重，并加入甲醇溶液以補(bǔ)足失重。常溫下離心10 min(12000 r/min)，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾備用。

1.2 生物量測(cè)定

果實(shí)的橫徑、縱徑采用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量。果實(shí)的濕重使用萬(wàn)分之一電子天平稱(chēng)重，在冷凍干燥機(jī)去除水分，直至樣品重量不發(fā)生變化時(shí)將樣品取出，并測(cè)定其干重質(zhì)量，含水率測(cè)定采用重量差比法。每個(gè)采收期隨機(jī)選取3株，每株選取10個(gè)果實(shí)進(jìn)行測(cè)量，求得平均值以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3 木脂素含量測(cè)定

利用配備二極管陣列檢測(cè)器(DAD)的Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀對(duì)五味子果肉和種子提取物中的四種木脂素進(jìn)行定量分析。色譜柱為Agilent Poroshell120EC-C18(4.6 mm × 150 mm，4 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫條件為：0 min，51% A；35 min，61% A；37 min，100% A；47 min，100% A；49 min，51% A；59 min，51% A；流速為1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm，柱溫：30 ℃。五味子醇甲的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.0233X-3.4612；五味子酯甲的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.0244X+2.501；五味子甲素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.0193X+3.2112；五味子乙素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.0184X+3.018。

1.4 花色苷含量和有機(jī)酸含量測(cè)定

采用pH示差法測(cè)定總花色苷的含量[18]。采用電位滴定法測(cè)定五味子中總有機(jī)酸的含量[19]。

1.5 總酚含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu’s法測(cè)定總多酚含量[20]。用甲醇將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為68.47、102.76、154.07、231.1、346、520、1170 μg/mL。取30μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入600 μL碳酸鈉溶液，搖勻靜置5 min。然后加入30 μL Folin-Ciocalteu’s試劑, 搖勻后靜置30 min，在750 nm處測(cè)定吸光度，回歸方程為y=0.0005x + 0.0484,R2= 0.9993。結(jié)果表明，綠原酸在68.47～1170 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

1.6 抗氧化活性測(cè)定

對(duì)五味子的抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)測(cè)定方法做了一些調(diào)整[21]。將20 μL的提取液加入到280 μL的DPPH乙醇溶液(終濃度為100 mmol/L)中，混合均勻，避光30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。甲醇為空白對(duì)照。將抗壞血酸母液用甲醇稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為1、5、25、50、124、166(μg·mL-1)。回歸方程為：y = 0.0047x-0.0205，R2=0.9961。結(jié)果表明，抗壞血酸(Vc)在1～166 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 果實(shí)體積、生物量和含水量動(dòng)態(tài)測(cè)定

五味子果實(shí)在成熟過(guò)程中，果實(shí)的體積會(huì)逐漸增大，通過(guò)對(duì)五味子果實(shí)橫縱徑的測(cè)定，來(lái)確定五味子果實(shí)在生長(zhǎng)過(guò)程中體積的變化。五味子果實(shí)發(fā)育曲線呈現(xiàn)出“S”型增長(zhǎng)趨勢(shì)(圖1)，HV1時(shí)期到HV3時(shí)期果實(shí)生長(zhǎng)很緩慢，HV3時(shí)期至HV4時(shí)期果實(shí)進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，平均每天橫、縱徑凈增長(zhǎng)量均約≥0.1 mm，進(jìn)入HV4時(shí)期以后，果實(shí)的體積變化逐漸減小，增長(zhǎng)趨于平緩。五味子果肉在整個(gè)生長(zhǎng)周期含水率無(wú)明顯變化，并且含水率較大，含水率始終保持在85%～90%之間。種子含水率在HV1至HV3時(shí)期呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，在HV3至HV6時(shí)期種子含水量趨于穩(wěn)定(圖1)。

圖1 五味子果實(shí)橫徑、縱徑變化動(dòng)態(tài)與含水量變化動(dòng)態(tài)

其次，測(cè)定了五味子生長(zhǎng)過(guò)程中質(zhì)量的變化，從圖2可以看出，五味子種子的濕重和干重在HV1時(shí)期至HV4時(shí)期增長(zhǎng)變化比較明顯，在HV4(0.63±0.044)g時(shí)期至HV6(0.64±0.0197)g時(shí)期種子的干重增長(zhǎng)緩慢，增長(zhǎng)趨勢(shì)平緩，說(shuō)明在HV1至HV4時(shí)期是五味子種子發(fā)育生長(zhǎng)的主要時(shí)期。五味子果肉的濕重變化隨著時(shí)間的變化逐漸增加(圖2)，在HV6時(shí)期濕重達(dá)到最高值，果肉的干重變化趨勢(shì)與濕重相同，在HV6(0.65±0.065)g時(shí)期達(dá)到最高值。

圖 2 五味子果肉和種子的干重和鮮重

2.2 有機(jī)酸、總酚與花色苷含量

古文記載，五味子“生青熟紅紫”，五味子中花色苷的合成也是五味子品質(zhì)的一個(gè)重要考察指標(biāo)。對(duì)6個(gè)不同采收期的五味子果實(shí)中的花色苷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在五味子種子中并沒(méi)有檢測(cè)到花色苷，其果肉中含有大量的花色苷。隨著五味子果實(shí)的成熟，果肉中的花色苷含量呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)(圖3)，其中在HV1～HV4時(shí)期花色苷含量增加緩慢，但HV5期(1.50 ± 0.039)mg/g花色苷含量急劇增加。同時(shí)，也對(duì)花色苷的積累量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，其中在HV1～HV4時(shí)期花色苷含量增加緩慢，積累較少，在HV4～HV5時(shí)期花色苷積累有較大幅度的增加。由此可見(jiàn)，五味子果實(shí)中花色苷合成主要集中在HV4～HV5期。

在有機(jī)酸的含量測(cè)定中(圖3)，五味子有機(jī)酸分布與花色苷相同，都是主要分布在果肉中，在種子中并沒(méi)有檢測(cè)到。五味子果肉中有機(jī)酸含量隨時(shí)間變化逐漸增加，在HV6期(258.8±11.7)mg/g達(dá)到最高值，其積累量也是在HV6(167.93±7.21)mg階段達(dá)到最高。

圖3 不同采收期五味子果肉中花色苷和有機(jī)酸含量

如圖4所示，單位質(zhì)量下，五味子果肉和種子總多酚含量隨時(shí)間變化呈先上升后下降的趨勢(shì)，果肉中總多酚含量在HV2(32.69±4.13)mg/g階段最高，種子中HV3(44.05±0.89)mg/g階段總多酚含量最高。但是總多酚在五味子果實(shí)中的積累量與含量存在一些差異(圖4)，在果肉中總多酚的積累量逐漸增加，在HV6期(13.26±1.16)mg達(dá)到最大。HV3期(24.76±0.498)mg,HV4期(20.9 ± 1.03)mg種子總多酚含量相對(duì)較高。

圖4 不同時(shí)期種子與果肉總多酚含量和積累量變化趨勢(shì)圖

2.3 木脂素含量

現(xiàn)有研究表明，五味子具有多種藥理活性，其中木脂素類(lèi)成分是其中主要的活性物質(zhì)；并且在中國(guó)藥典中，規(guī)定以五味子醇甲作為五味子的一個(gè)成分指標(biāo)。在不同采收期的五味子樣品中，如圖5所示，四種五味子木脂素的含量都出現(xiàn)不同程度的降低，其檢測(cè)結(jié)果于現(xiàn)有文獻(xiàn)中報(bào)道一致，隨著五味子的成熟，其木脂素的含量出現(xiàn)一個(gè)下降的趨勢(shì)。因?yàn)槲逦蹲釉谏L(zhǎng)過(guò)程中，生物的積累量對(duì)其含量有一定的影響，單獨(dú)以含量來(lái)確定五味子的采收期是片面的，需要充分考慮生物量的影響，通過(guò)木脂素的積累量來(lái)規(guī)避其生物量的影響。如圖6所示，五味子種子中，四種木脂素的積累量都是先升高后下降，然后趨于平穩(wěn)，積累量的峰值均出現(xiàn)在HV3～4階段。其中五味子醇甲下降趨勢(shì)不明顯，但是五味子酯甲，五味子甲素和五味子乙素含量下降明顯，推測(cè)可能合成更下游的產(chǎn)物。

圖5 五味子不同收獲期果肉與種子中木脂素含量

圖6 五味子不同收獲期果實(shí)中的木脂素的積累量

2.4 抗氧化活性測(cè)定

如圖7所示，單位質(zhì)量下，五味子果肉的抗氧化活性隨時(shí)間變化并沒(méi)有發(fā)生明顯變化。在HV2(6.1±0.927)mg/g時(shí)期達(dá)到最大值。五味子種子的抗氧化活性隨時(shí)間變化而降低，在HV1期(21.68±0.545)mg/g達(dá)到最大。通過(guò)積累量來(lái)計(jì)算五味子果實(shí)的抗氧化活性后(如圖7)，果肉的抗氧化活性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，并在HV6(10.76±0.12)mg階段達(dá)到最大值。種子的抗氧化活性在HV1～HV3階段呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在HV4階段到HV6階段逐漸趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)關(guān)門(mén)山不同采收期五味子果實(shí)進(jìn)行了多種有效成分的測(cè)定，測(cè)定內(nèi)容包括生物量、木脂素含量、有機(jī)酸、花色苷、總酚和抗氧化活性六個(gè)指標(biāo)。結(jié)果表明，果實(shí)的橫縱經(jīng)在HV4(8月23日)之后沒(méi)有明顯的改變，果肉的含水率一直保持在85%～90%之間，種子含水率呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，在HV3(8月5日)之后含水率保持穩(wěn)定?；ㄉ蘸陀袡C(jī)酸的含量隨時(shí)間變化逐漸增高，在HV5(9月8日)～HV6(9月20日)時(shí)期具有較高的含量，是果實(shí)顏色發(fā)生變化的重要時(shí)期。五味子總酚含量在種子中呈現(xiàn)先增高后降低趨勢(shì)，在果肉中逐漸升高，整體呈現(xiàn)出先增高后趨于穩(wěn)定。五味子木脂素主要分布于種子當(dāng)中，五味子果實(shí)木脂素的累積含量隨時(shí)間變化呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，在HV0～HV3時(shí)期木脂素合成速率都是正值，含量累積增加。在HV3～HV4時(shí)期木脂素合成速率為負(fù)值，木脂素含量在逐漸下降，說(shuō)明8月初是木脂素合成與累積的關(guān)鍵時(shí)期。綜上所述，五味子雖然在HV3～HV4時(shí)期的木脂素含量高，但是果實(shí)并未成熟，在HV4～HV5時(shí)期，果實(shí)色素迅速累積，此時(shí)的花色苷、有機(jī)酸和總酚均處于較高水平，所以9月中旬采集的五味子品質(zhì)較高。