基于數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討中藥治療消化性潰瘍的用藥規(guī)律及作用機(jī)制

劉媛，孫輝，許苑南，楊敏，馬志強(qiáng)，李池川，趙雙麗，趙太英，陳潔*

(1. 昆明市第三人民醫(yī)院 云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，云南 昆明 650041；2. 普洱學(xué)院 云南 普洱 665000；3. 昆明醫(yī)科大學(xué) 海源學(xué)院，云南 昆明 650106 )

消化性潰瘍(peptic ulcer, PU)泛指胃腸道黏膜在某種情況下被胃消化液消化造成的表面組織局限性缺損、潰爛，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，PU常見病因與幽門螺桿菌(helicobacter pylori, HP)感染、長期服用非甾體抗炎藥和吸煙飲酒等不良習(xí)慣有關(guān)，這些因素導(dǎo)致黏膜屏障受損，進(jìn)一步發(fā)展為潰瘍。目前臨床西醫(yī)治療以根除HP、抑酸護(hù)胃為主，雖有治療效果，但抗HP 治療存在一定副作用，且易產(chǎn)生耐藥，停用后極易復(fù)發(fā)等[2]。中醫(yī)對于治療PU具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，通過辯證、組方、用藥能夠?qū)ΠY治療消化道潰瘍導(dǎo)致的相關(guān)癥狀。中藥可調(diào)整患者胃腸道內(nèi)環(huán)境，調(diào)節(jié)胃酸、胃蛋白酶的分泌，降低攻擊因子對黏膜的損害[3]，還能增強(qiáng)黏膜自身的防御功能，在提高潰瘍愈合的質(zhì)量，減少并發(fā)癥，降低復(fù)發(fā)率上有很大的優(yōu)勢[4]。但由于臨床使用的復(fù)方中藥配伍靈活，中藥成分復(fù)雜，故闡述中藥治療PU的作用機(jī)制較為困難。數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)兩種方法能夠?qū)χ兴幎喑煞?、多靶點(diǎn)的藥物特性進(jìn)行分析和歸納，揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。因此，本研究基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析歸納中藥治療PU的用藥規(guī)律，探究核心藥對的活性成分及潛在的作用機(jī)制。

1 材料收集

1.1 中藥復(fù)方的收集

查閱中國知網(wǎng)(CNKI)、萬方數(shù)據(jù)，以“中藥”“消化性潰瘍”為關(guān)鍵詞，檢索近5年與PU相關(guān)的文獻(xiàn)，篩選出150篇相關(guān)文獻(xiàn)，233份復(fù)方，使用Excel建立數(shù)據(jù)庫，作為研究的數(shù)據(jù)源。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

(1)2016年至今所有公開發(fā)表的關(guān)于中藥治療PU的期刊文獻(xiàn)；(2)符合中藥辯證(肝胃不和證、脾胃虛寒證等)診斷標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)；(3)具有臨床表現(xiàn)，符合HP感染癥狀，具有明確診斷的文獻(xiàn)；(4)處方完整，用藥劑量明確的文獻(xiàn)；(5)臨床治療效果較好的文獻(xiàn)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)處方不完整，用藥劑量不明確的文獻(xiàn)；(2)綜述類文獻(xiàn)；(3)伴有心腦血管疾病，肝腎功能不全患者的處方；(4)孕婦及哺乳期婦女的處方。

2 數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

2.1 數(shù)據(jù)規(guī)范化

根據(jù)《中國藥典》[5]進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范整理。天冬、天門冬統(tǒng)稱為天冬，麥冬、麥門冬統(tǒng)稱為麥冬，海螵蛸、烏賊骨統(tǒng)稱為海螵蛸，玄胡、延胡索統(tǒng)稱為延胡索，法半夏、姜半夏統(tǒng)稱為半夏，珍珠粉、珍珠，統(tǒng)稱為珍珠粉。

2.2 數(shù)據(jù)分析

(1)將中藥復(fù)方統(tǒng)計(jì)并錄入Excel表格，進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)；(2)運(yùn)用SPSS Modeler 14.1軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，以最高支持度為標(biāo)準(zhǔn)，獲得核心藥對；(3)通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]檢索核心藥對的所有活性成分，并以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)(OB≥30%)和類藥性(drug-likeness,DL)(DL≥0.18)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)活性成分。在TCMSP和PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中檢索核心藥對活性成分作用于PU的潛在作用靶點(diǎn)；(4)使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以“peptic ulcer”為關(guān)鍵詞，檢索出PU的潛在靶點(diǎn)，并利用VENNY 2.1軟件將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得核心藥對治療PU的潛在作用靶點(diǎn)；(5)利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)用交集靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型；(6)將STRING 11.0數(shù)據(jù)庫中的保留節(jié)點(diǎn)(node1，node2)和結(jié)合率評分(combine score)信息，導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.0軟件，分析靶點(diǎn)相關(guān)的拓?fù)鋮?shù)；(7)通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)將交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/gp/index.html)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)而路富集分析；(8)基于藥物-成分-靶點(diǎn)-信號通路，將上述得到的核心靶點(diǎn)和KEGG通路富集分析的結(jié)果所選取的主要信號通路建立聯(lián)系，并與成分-靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系整合并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件中，從而得到成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。

3 數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果

3.1 藥物頻數(shù)分析結(jié)果

從知網(wǎng)、萬方等數(shù)據(jù)庫收集到150篇中藥治療PU文獻(xiàn)，選取其中233份治療PU的復(fù)方，共計(jì)216味中藥，每味中藥至少使用一次，其中排列在前20位的中藥分別為補(bǔ)虛藥(甘草、白術(shù)、白芍、黃芪、黨參)、理氣藥(陳皮、木香、香附、枳殼)、化濕藥(厚樸、砂仁)、清熱藥(黃連、黃芩、蒲公英)、止血藥(白及、延胡索)、解表藥(柴胡)、化痰止咳平喘藥(半夏)、利水滲濕藥(茯苓)、收澀藥(海螵蛸)。出現(xiàn)次數(shù)降序排列，見表1。

表1 排名前20位治療PU的中藥分布

3.2 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果

利用IBM SPSS Modeler 18.0數(shù)據(jù)庫對前20個(gè)治療PU的高頻核心藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，見圖1。設(shè)置最低條件支持度≥20%、最小規(guī)則置信度≥60%、提升度>1，數(shù)值由高至低排列，關(guān)聯(lián)規(guī)則表示為“后項(xiàng)-前項(xiàng)”，得出治療PU的前十組常見藥對，見表2。其中茯苓-白術(shù)支持度最高，為治療PU的核心藥對。

圖1 治療PU的中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則分析圖Fig.1 Results of the analysis of the association rules of traditional Chinese medicine for the treatment of PU

表2 治療PU 的高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

4.1 茯苓-白術(shù)藥對活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)篩選核心藥對茯苓-白術(shù)的化學(xué)成分，得到茯苓的活性成分15個(gè)，白術(shù)的活性成分7個(gè)，共22個(gè)活性成分，具體見OSID附表1，主要成分見表3。使用TCMSP數(shù)據(jù)庫和PubChem獲得潛在活性成分的相應(yīng)靶點(diǎn)，最終獲取茯苓-白術(shù)藥對相關(guān)的靶點(diǎn)143個(gè)。

表3 茯苓-白術(shù)主要化學(xué)成分

4.2 茯苓-白術(shù)藥對治療PU相關(guān)靶點(diǎn)收集

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索“peptic ulcer”，從數(shù)據(jù)庫中檢索獲得PU靶點(diǎn)712個(gè)。將篩選的活性成分靶點(diǎn)與PU靶點(diǎn)取交集，最終得到53個(gè)茯苓-白術(shù)藥對治療PU的相關(guān)靶點(diǎn)，并通過VENNY 2.1軟件繪制維恩圖，見圖2。

注：紫色代表茯苓-白術(shù)靶點(diǎn)；黃色代表PU靶點(diǎn)；深黃色代表交集靶點(diǎn)。圖2 茯苓-白術(shù)與PU交集基因靶點(diǎn)Fig.2 Intersection gene targets of Poria-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae and PU

4.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，構(gòu)建茯苓-白術(shù)藥對與PU的靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)包括53個(gè)節(jié)點(diǎn)，118條邊，見圖3。Cytoscape 3.7.0軟件對41個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，其中網(wǎng)絡(luò)度值(degree)越大則節(jié)點(diǎn)越大，表示該核心藥對通過此靶點(diǎn)治療PU的可能性越大。治療PU的靶點(diǎn)中度值排在前10位的靶基因依次為JUN、IL6、TP53、AKT1、VEGFA、MAPK1、CASP3、EGFR、RB1、IL1B。說明這些基因在茯苓-白術(shù)藥對治療PU的作用機(jī)制中發(fā)揮了相對重要的作用。見表4。

圖3 茯苓-白術(shù)與PU交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram of the intersection target of Poria-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae and PU

表4 茯苓-白術(shù)治療PU關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

4.4 茯苓-白術(shù)治療PU的靶點(diǎn)功能富集通路分析

GO富集分析結(jié)果顯示，茯苓-白術(shù)藥對潛在活性成分對應(yīng)的41個(gè)交集靶點(diǎn)，主要涉及的分子功能包括相同蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性等；細(xì)胞組分方面涉及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)等；生物過程包括對藥物的反應(yīng)、一氧化氮生成合成過程正調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控等，結(jié)果見圖4。

圖4 茯苓-白術(shù)治療PU關(guān)鍵靶點(diǎn)GO富集分析Fig.4 Results of the GO enrichment analysis of the key targets of Poria-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae for the treatment of PU

KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，與茯苓-白術(shù)藥對治療PU的相關(guān)靶點(diǎn)具有顯著相關(guān)性的信號通路主要是IL-17 信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶信號通路、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、活化核因子-κB信號通路。結(jié)果見圖5。

圖5 茯苓-白術(shù)治療PU關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG富集分析Fig.5 Results of the KEGG enrichment analysis of the key targets of Poria-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae for the treatment of PU

4.5 成分-靶點(diǎn)-信號通路構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.7.0 軟件構(gòu)建茯苓-白術(shù)藥對活性成分-作用靶點(diǎn)-代謝通路網(wǎng)絡(luò)，圖中包含藥物活性成分22種、茯苓-白術(shù)藥對與PU的交集靶點(diǎn)41個(gè)，信號通路15條，篩選出的茯苓-白術(shù)藥對活性成分作用靶點(diǎn)分布在不同的信號通路，相互協(xié)調(diào)，通過調(diào)控不同的信號通路發(fā)揮治療PU的作用，結(jié)果見圖6。

圖6 茯苓-白術(shù)治療PU活性成分-作用靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Component-target-signaling pathway network of Poria-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae in the treatment of PU

5 討論

PU屬于中醫(yī)“胃脘痛” “嘈雜” “吞酸” “痞滿”等范疇[8]?！拔鸽渫础睂倨⑽覆∽C，其主要由外邪犯胃、飲食傷胃、情志不暢和脾胃素虛等病機(jī)，導(dǎo)致胃氣郁滯，胃失和降，不通則痛。中醫(yī)治療以理氣和胃止痛為主，審證求因，辨證施治。近年來，中醫(yī)藥治療PU有較好的臨床療效，但對于所用中藥治療PU的機(jī)制研究尚欠缺。因此，本研究通過數(shù)據(jù)挖掘總結(jié)中藥治療PU的用藥規(guī)律，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選核心藥對的活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)生物學(xué)通路來探討中藥治療PU的作用機(jī)制。

本研究對近5年臨床治療PU的中藥復(fù)方進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘分析，結(jié)果表明治療此病多以補(bǔ)虛藥為基礎(chǔ)，再加以理氣藥、燥濕藥進(jìn)行聯(lián)合施治。對高頻藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析得出，茯苓-白術(shù)為治療PU的核心藥對。白術(shù)、茯苓是治療脾胃氣虛及水濕內(nèi)停證的常用藥對，兩藥配伍最早出現(xiàn)于張仲景《傷寒論》和《金匱要略》[9]。茯苓具有滲濕利水、益脾和胃、寧心安神等功效，藥理研究顯示具有抗炎、保護(hù)胃腸道、降低胃液分泌、增強(qiáng)免疫力及保護(hù)肝臟的作用[10]。白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，現(xiàn)代研究表明其具有胃黏膜保護(hù)(改善腸胃功能)、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗菌以及神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)等藥理學(xué)作用[11-12]。大量臨床研究顯示，使用茯苓-白術(shù)作為基礎(chǔ)方治療PU可取得較好的臨床療效。葛陽等[13]觀察白術(shù)益脾湯治療HP陽性消化性潰瘍患者，結(jié)果顯示白術(shù)益脾湯可改善胃酸分泌功能，促進(jìn)潰瘍愈合。李朋娟等[14]研究結(jié)果表明，歸脾湯加味合西藥治療PU，能提高再生黏膜功能學(xué)成熟度和潰瘍愈合質(zhì)量，預(yù)防潰瘍再次復(fù)發(fā)。因此，以上臨床數(shù)據(jù)結(jié)果為茯苓-白術(shù)藥對治療PU的作用機(jī)制進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析提供了理論依據(jù)。

茯苓-白術(shù)藥對共得到22個(gè)目標(biāo)活性成分及143個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，與PU相關(guān)靶點(diǎn)映射后得到潛在預(yù)測靶點(diǎn)41個(gè)。通過數(shù)據(jù)庫和軟件分析得出，對茯苓-白術(shù)治療PU具有重要意義的前10個(gè)靶點(diǎn)分別是JUN、IL6、TP53、AKT1、VEGFA、MAPK1、CASP3、EGFR、RB1、IL1B。KEGG富集通路分析結(jié)果顯示，茯苓-白術(shù)藥對治療PU主要與IL-17信號通路、PI3K-AKT 信號通路、NF-κB信號通路、HP感染中的上皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，這些通路之間往往共同發(fā)揮作用來達(dá)到治療PU的效果。IL-17在幽門螺桿菌感染的炎癥反應(yīng)中起重要作用，并最終影響消化性潰瘍的轉(zhuǎn)歸[15]。陳強(qiáng)等[16]研究結(jié)果顯示，HP感染的消化性潰瘍患者IL-17水平升高，IL-17通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌IL-6、IL-8等多種細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥發(fā)生。PI3K-AKT 信號通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，是潰瘍愈合和再上皮化的關(guān)鍵因素[17]。AKT磷酸化后，可抑制凋亡基因Bax的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)[18]。AKT活化后會對磷酸化激活I(lǐng)κB激酶產(chǎn)生核易位，從而促進(jìn)其下游的核因子中的IκBa的磷酸化，進(jìn)一步從NF-κB上脫落降解，導(dǎo)致NF-κB從抑制狀態(tài)被激活。NF-κB信號通路被認(rèn)為是胃潰瘍的靶分子途徑，可導(dǎo)致炎癥級聯(lián)啟動損害胃黏膜的免疫反應(yīng)而誘導(dǎo)胃潰瘍[19]。幽門螺桿菌通過激活胃上皮細(xì)胞的NF-κB信號通路，誘導(dǎo)多種炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)[20]。

綜上所述，本研究從數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度出發(fā)，從文獻(xiàn)中挖掘治療PU的中藥用藥規(guī)律，篩選得到治療PU的核心藥對茯苓-白術(shù)的潛在活性成分、作用靶點(diǎn)及發(fā)揮治療效果的主要信號通路，從而更加全面地了解治療PU的作用機(jī)制。從數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度分析中藥治療PU的用藥規(guī)律和作用機(jī)制可能存在一定的不足之處，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以及臨床驗(yàn)證，從而更加系統(tǒng)、科學(xué)地闡述茯苓-白術(shù)藥對治療PU的作用機(jī)制，為臨床治療PU提供有力的理論依據(jù)。