馬鈴薯帚頂病毒基因組克隆與侵染性克隆構(gòu)建

劉 野，高艷玲，劉佳慧，方 月，馬廷帥，毛彥芝，張麗莉，白艷菊，程曉非*

（1.寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是世界第四大糧食作物，2019年全球馬鈴薯產(chǎn)量高達(dá)3.68億t，中國(guó)是馬鈴薯產(chǎn)量最大的國(guó)家，年產(chǎn)量為9 000萬(wàn)t[1]。病毒病是影響馬鈴薯產(chǎn)量與品質(zhì)的重要因素之一，也是馬鈴薯種薯退化的主要原因。據(jù)報(bào)道有40余種植物病毒可侵染馬鈴薯，并造成危害[2]。馬鈴薯帚頂病毒（Potato mop-top virus，PMTV）是帚狀病毒科（Virgaviridae）馬鈴薯帚頂病毒屬（Pomovirus）的代表成員[3]。感染PMTV的馬鈴薯植株上部葉片出現(xiàn)倒V型黃化斑紋，基部葉片出現(xiàn)不規(guī)則黃色斑塊或線狀紋，塊莖出現(xiàn)壞死弧紋或條紋，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量、品質(zhì)及商業(yè)價(jià)值[4]。PMTV主要通過(guò)塊莖、粉痂菌（Spongospora subterranea）傳播，也可通過(guò)機(jī)械摩擦傳播[5]。PMTV曾在廣東、云南和四川等地的塊莖中被零星檢測(cè)到，但尚無(wú)在中國(guó)馬鈴薯產(chǎn)區(qū)大面積流行和傳播的報(bào)道[6-8]。鑒于該病毒的強(qiáng)致病性和危害性，中國(guó)已將其列入進(jìn)境植物檢疫禁止進(jìn)境物名錄。PMTV的病毒粒子為直桿狀，基因組由三條正義單鏈RNA組成，根據(jù)長(zhǎng)度分別命名為RNA1、RNA2和RNA3[7]。三條RNA的3′末端沒(méi)有mRNA類(lèi)似的多聚腺苷酸尾巴，但含有一個(gè)類(lèi)似tRNA的結(jié)構(gòu)[9]。RNA1長(zhǎng)約6.1 kb，編碼兩個(gè)復(fù)制相關(guān)蛋白；RNA2長(zhǎng)約3.1 kb，編碼兩個(gè)病毒外殼蛋白（Coat protein，CP）；RNA3長(zhǎng)約2.9 kb，編碼四個(gè)閱讀框（Open reading frame，ORF），其中ORF1-3部分重疊，組成保守的三基因盒（Triplegene block，TGB），編碼3個(gè)運(yùn)動(dòng)蛋白，ORF4編碼一個(gè)具有RNA沉默抑制子功能的富含半胱氨酸蛋白（Cysteine-rich protein，CRP）[10]。本研究報(bào)道了一株采自河北省馬鈴薯塊莖的PMTV全基因組序列，對(duì)其遺傳進(jìn)化進(jìn)行了分析，并構(gòu)建了其侵染性克隆，以期為研究PMTV的致病和傳播機(jī)制、馬鈴薯的抗病機(jī)制以及建立科學(xué)防控策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

感染PMTV的馬鈴薯塊莖采自河北省張北縣（由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院馬鈴薯資源研究所提供）。

1.1.2 菌株與載體

大 腸 桿 菌（Escherichia coli）DH5α、酵 母（Saccharomyces cerevisiae）Y2H Gold、農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）GV3101均 由 本 實(shí) 驗(yàn) 保存；pCB301-2u-HDV載體來(lái)自浙江大學(xué)[11]。

1.1.3 培養(yǎng)基與生化試劑

本研究所用培養(yǎng)基及普通生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 植物培養(yǎng)條件

野生型本氏煙（Nicotiana benthamiana）種植于植物生長(zhǎng)箱中，溫度為白天25℃，夜間18℃，相對(duì)濕度50%和光周期16∶8（光照∶黑暗）。接種病毒以后，N.benthamiana置于溫度18℃的植物生長(zhǎng)箱，濕度和光周期不變。馬鈴薯品種‘大西洋’‘中薯5號(hào)’和‘Favorita’組培苗在16℃無(wú)菌操作間培養(yǎng)，組培苗移至土里后在23℃的植物生長(zhǎng)箱中，相對(duì)濕度50%和光周期16∶8。

1.2.2 植物總RNA提取

采用普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司的Eastep?Super總RNA提取試劑盒進(jìn)行，具體操作根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

從GenBank下載已報(bào)道的PMTV全基因組序列，用Clustal Omega[12]進(jìn)行多序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果在保守位置設(shè)計(jì)引物（表1）。

1.2.4 cDNA合成、PCR擴(kuò)增與克隆

反轉(zhuǎn)錄采用南京諾唯贊生物科技股份有限公司HiScriptⅢ1stStrand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper），具體操作根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增采用50 μL體系，包括25 μL的2×Phanta高保真DNA聚合酶（用于目的片段擴(kuò)增）或2×Taq Plus Master Mix（用于菌落鑒定），10 mmol/L上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL。PCR程序設(shè)為95℃預(yù)變性3 min，30個(gè)熱循環(huán)（95℃變性30 s，60℃退火15 s，72℃延伸時(shí)間為：15 s每1 kb），72℃延伸7 min。pCB301-2μ-HDV載體的線性化PCR后，加入1 μLDpnI（NEB北京有限公司），混勻，37℃處理1 h，以降解模板質(zhì)粒。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit回收擴(kuò)增片段，回收的片段插入北京全式金（Transgen）生物技術(shù)有限公司pEASY-Blunt Zero載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定陽(yáng)性菌落，用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的FastPure Plasmid Mini Kit提取質(zhì)粒，并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，每個(gè)擴(kuò)增片段最少測(cè)序4個(gè)克隆。

1.2.5 序列分析

克隆的DNA片段用Lasergene DNAstar7.0軟件包（DNAstar公司）Seqman Pro7.1.0進(jìn)行拼接，用Seqbuilder Pro7.1.0進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)和蛋白翻譯。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)采用MEGA-X軟件中的最大似然法（Maximum-likelihood method），分支支持率采用1 000次重復(fù)檢測(cè)。

1.2.6 酵母同源重組

將線性化的pCB301-2μ-HDV載體與目的片段以等摩爾比混合后，用北京酷來(lái)搏科技有限公司的畢赤酵母感受態(tài)制備與轉(zhuǎn)化試劑盒轉(zhuǎn)化酵母。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)低速離心后，全部涂布于缺色氨酸的SD固體培養(yǎng)基，用Parafilm封好口后，倒置于30℃培養(yǎng)2～4 d。

1.2.7 酵母質(zhì)粒提取

采用北京酷來(lái)搏科技有限公司酵母質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行，具體操作根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.8 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與侵染

將pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTV-RNA2和pCB301-PMTV-RNA3通過(guò)電擊法分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。取15 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素（Kanamycin）和50 μg/mL利福平（Rifampicin）的LB固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2 d；挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。用槍頭將含有正確質(zhì)粒的農(nóng)桿菌用牙簽接種于3 mL含有50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床中120 r/min過(guò)夜培養(yǎng)；室溫下，9 000 r/min離心1 min收集菌體。用1 mL浸潤(rùn)緩沖液（10 mmol/L MES，pH 5.6；10 mmol/L MgCl2；100 μmol/L乙酰丁香酮）懸浮菌體，9 000 r/min離心1 min收集菌體；再用1 mL浸潤(rùn)緩沖液懸浮與離心一次，用可見(jiàn)分光光度計(jì)將農(nóng)桿菌稀釋至OD600=0.5；取等量含有pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTV-RNA2和pCB301-PMTV-RNA3的農(nóng)桿菌懸浮混勻后，用1 mL無(wú)針頭注射器注射接種本氏煙草與馬鈴薯葉片。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組克隆與同源性分析

研究所用的馬鈴薯塊莖品種未知，內(nèi)部呈現(xiàn)壞死弧紋癥狀，經(jīng)ELISA檢測(cè)為PMTV陽(yáng)性。根據(jù)GenBank中PMTV的序列設(shè)計(jì)表1引物以擴(kuò)增該P(yáng)MTV分離物的全基因組。經(jīng)克隆、測(cè)序和拼裝發(fā)現(xiàn)該P(yáng)TMV的RNA1全長(zhǎng)6 042 nt，RNA2全長(zhǎng)3 134 nt，RNA3全長(zhǎng)2 964 nt（GenBank序列號(hào)為OP221272-OP221274）。RNA1-3的編碼框與報(bào)道完全一致，但RNA3編碼的CRP前兩個(gè)密碼子分別為GTG和GTG。分析發(fā)現(xiàn)，GenBank中所有33條PMTV全長(zhǎng)RNA3僅有3個(gè)PMTV分離物（Sw、Yunnan和C52_P11）編碼CRP的第二個(gè)密碼子為ATG，而非GTG，因此CRP可能通過(guò)非ATG起始翻譯。將本PMTV的RNA1、RNA2和RNA3分別與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中不同PMTV分離物的相應(yīng)RNA片段進(jìn)行多序列比對(duì)，并分析計(jì)算同源性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本PMTV的RNA1與RNA2和中國(guó)Yunnan分離物的核苷酸同源性最高，分別為99.80%和99.90%，RNA3與哥倫比亞的CO3核苷酸同源性最高，為99.90%（表2）。

表2 河北分離物與其他分離物核苷酸序列同源性Table 2 Nucleotide sequence identities between Hebei and other PMTV isolates

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為明確該P(yáng)MTV分離物與其他PMTV分離物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了所有PTMV RNA1、RNA2和RNA3全長(zhǎng)序列（表1），并構(gòu)建了RNA1、RNA2以及RNA3的最大似然系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PMTV的RNA1可明顯分為兩個(gè)分支，本PMTV分離物的RNA1處于第一個(gè)分支中，與PMTV云南分離物關(guān)系最近（圖1A）；RNA2分為三個(gè)分支，絕大多數(shù)分離物處于第一分支，而分支III僅包括秘魯?shù)腏20_J203一個(gè)分離物，本PMTV分離物的RNA2處于第一個(gè)分支中，與中國(guó)Yunnan、日本Hiroshima、丹麥54-8、54-11、54-21以及54-26聚于同一小分支（圖1B）；RNA3分為四個(gè)分支，分支III包括瑞典Sw和云南分離物，而分支IV僅包括秘魯?shù)腏20_P157一個(gè)分離物，本PMTV分離物的RNA3處于第一個(gè)分支中，與丹麥Rn23分離物關(guān)系最近（圖1C）。

圖1 PMTV最大似然系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 1 Maximum likelihood phylogenetic trees of PMTV

表1 試驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primers used in the study

2.3 侵染性克隆構(gòu)建

根據(jù)PMTV RNA1、RNA2和RNA3的5′和3′最末端非編碼區(qū)的保守序列，設(shè)計(jì)引物以直接擴(kuò)增RNA2和RNA3全長(zhǎng)序列，RNA1分為2個(gè)約3 000 bp的片段（分別記為RNA1-F1和RNA1-F2）擴(kuò)增（圖2A）。用引物RZ-F和CaMV 35S-R，以pCB301-2μ-HDV為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得線性化的pCB301-2μ-HDV載體（圖2A）。所有片段兩端與載體含有20 bp左右的同源臂。將線性化的pCB301-2μ-HDV載體分別與RNA2、RNA3、以及RNA1-F+RNA1-F2共轉(zhuǎn)化酵母。用引物35SF和RNA1-5360R對(duì)隨機(jī)選擇的15個(gè)轉(zhuǎn)化RNA1-F+RNA1-F2的酵母克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6個(gè)克隆能擴(kuò)增到5 000 bp大小的目的條帶（圖2B），用引物RNA2-620F和NOS-R對(duì)隨機(jī)選擇的15個(gè)轉(zhuǎn)化RNA2的酵母克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，結(jié)果表明其中有5個(gè)克隆能擴(kuò)增到2 500 bp左右的目的條帶（圖2C），用引物RNA3-800F和RNA3-2200R對(duì)隨機(jī)選擇的15個(gè)轉(zhuǎn)化RNA3的酵母克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有13個(gè)克隆能擴(kuò)增到1 400 bp左右的目的條帶（圖2D）。分別選取PCR擴(kuò)增條帶最亮的3個(gè)克隆，提取酵母質(zhì)粒，直接轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。經(jīng)再次菌落PCR驗(yàn)證后，提取質(zhì)粒送于公司測(cè)序，獲得含有PMTV河北省馬鈴薯分離物RNA1、RNA2和RNA3的質(zhì)粒，并命名為pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTV-RNA2和pCB301-PMTV-RNA3。

圖2 PMTV侵染性cDNA克隆的構(gòu)建Figure 2 Construction of PMTV infectious cDNA clone

2.4 PMTV侵染性克隆在本氏煙上的侵染性測(cè)定

用本氏煙驗(yàn)證所構(gòu)建PMTV侵染性克隆的活性。將含有pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTVRNA2和pCB301-PMTV-RNA3的農(nóng)桿菌菌液等比例混合后，注射6株4周大小的本氏煙。接種后9 d時(shí)，本氏煙的系統(tǒng)葉片開(kāi)始出現(xiàn)褪綠癥狀，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，癥狀逐漸加重，并出現(xiàn)明顯的花葉和葉片輕微皺縮的癥狀（圖3A）。在接種14 d，采集本氏煙帶有癥狀的葉片，提取總RNA，分別用引物RNA1-730F+RNA1-5360R、RNA2-620F+RNA2-2800R、RNA3-800F+RNA3-2200R進(jìn) 行RT-PCR，以 檢 測(cè)RNA1、RNA2和RNA3。RT-PCR結(jié)果顯示，在6株本氏煙葉片中均可以檢測(cè)到病毒RNA1、RNA2和RNA3的存在（圖3B～D），表明PMTV的侵染效率達(dá)到100%（圖3B～D）。

圖3 PMTV侵染性cDNA克隆在本氏煙上的侵染性測(cè)定Figure 3 Infectivity analysis of PMTV infectious cDNA clone on N.benthamiana

2.5 PMTV侵染性克隆在馬鈴薯上的侵染性測(cè)定

將含有pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTVRNA2和pCB301-PMTV-RNA3的農(nóng)桿菌菌液等比例混合后，分別注射‘大西洋’‘中薯5號(hào)’和‘Favorita’無(wú)毒組培苗（每個(gè)品種各6株），以進(jìn)一步檢測(cè)PMTV侵染性克隆對(duì)馬鈴薯的侵染能力。接種20 d后，‘大西洋’葉片出現(xiàn)輕微的黃化，而‘費(fèi)烏瑞它’和‘中薯5號(hào)’沒(méi)有明顯癥狀（圖4A）。接種20 d時(shí)，采集組培苗上部帶有癥狀的葉片，提取6株混合樣的總RNA，用引物RNA2-1230F與RNA2-2800R進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)‘大西洋’中可以擴(kuò)增到PMTV RNA2的目的片段，而‘費(fèi)烏瑞它’和‘中薯5號(hào)’中不能擴(kuò)增到預(yù)期大小的目的片段（圖4B）。分別提取接種PMTV的6株‘大西洋’總RNA，用引物RNA2-1230F與RNA2-2800R進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，以分析PMTV的侵染效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4株‘大西洋’可以檢測(cè)到病毒的存在，發(fā)病率為66.67%（圖4C）。

圖4 PMTV侵染性cDNA克隆在馬鈴薯上的侵染性測(cè)定Figure 4 Infectivity analysis of PMTV infectious cDNA clone on potato

3 討論

本研究從一個(gè)采自河北省張北縣的馬鈴薯薯塊上克隆了一株P(guān)MTV的全基因組序列，多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，PMTV的RNA1與此前報(bào)道一致分為兩個(gè)分支[13,14]，RNA2分為3個(gè)分支，該分離物的RNA1與RNA2均與國(guó)內(nèi)報(bào)道的云南分離物關(guān)系最近，說(shuō)明本研究所用馬鈴薯上的PMTV有可能通過(guò)云南與河北之間的種薯調(diào)運(yùn)而來(lái)，但還需進(jìn)一步研究確定。值得注意的是，系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該分離物的RNA3與來(lái)自瑞典的Rn23關(guān)系最近而與云南馬鈴薯分離物的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，說(shuō)明本試驗(yàn)克隆的PMTV的RNA3曾與其他分離物的RNA3發(fā)生過(guò)重配，但是重配發(fā)生的時(shí)間及地點(diǎn)未知。

PMTV侵染性克隆之前已有報(bào)道[15]。本試驗(yàn)構(gòu)建的PMTV侵染性克隆與之相比，具有不需要依賴于體外轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點(diǎn)。此外，本侵染性克隆來(lái)自于中國(guó)本土發(fā)生的帶病馬鈴薯，而不是PMTV代表株系Sw。侵染性試驗(yàn)表明本分離在本氏煙上造成花葉的癥狀，而Sw造成黃花葉的癥狀[15]，說(shuō)明兩者在致病性方面存在明顯差異。馬鈴薯侵染試驗(yàn)表明，在本試驗(yàn)的條件下，該侵染性克隆能侵染‘大西洋’，但不能引起明顯的癥狀，也不能侵染‘中薯5號(hào)’與‘費(fèi)烏瑞它’，說(shuō)明本侵染性克隆在不同的馬鈴薯品種上侵染力不同。溫度在PMTV致病過(guò)程中具有重要的作用，低溫有利于病癥的發(fā)展和顯現(xiàn)[16]。本研究未能在‘大西洋’上觀察到癥狀，可能是由于溫度等條件所限。而不能侵染‘中薯5號(hào)’與‘費(fèi)烏瑞它’的原因未知，還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

PMTV為三分體病毒，成功侵染需要3條RNA在同一細(xì)胞表達(dá)。本試驗(yàn)所構(gòu)建的侵染性克隆雖然在本氏煙上實(shí)現(xiàn)100%的侵染效率，但侵染‘大西洋’時(shí)只有66.67%（4/6）的侵染率，后續(xù)可考慮將病毒的兩條RNA整合到一個(gè)質(zhì)粒中，以提高馬鈴薯的侵染效率。本試驗(yàn)構(gòu)建的侵染性克隆成功在煙草與馬鈴薯建立侵染，為進(jìn)一步開(kāi)展PMTV與寄主互作的研究，揭示其分子致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。