劉 野,高艷玲,劉佳慧,方 月,馬廷帥,毛彥芝,張麗莉,白艷菊,程曉非*
(1.寒地糧食作物種質創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點實驗室/東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所,黑龍江 哈爾濱 150086)
馬鈴薯(Solanum tuberosum)是世界第四大糧食作物,2019年全球馬鈴薯產(chǎn)量高達3.68億t,中國是馬鈴薯產(chǎn)量最大的國家,年產(chǎn)量為9 000萬t[1]。病毒病是影響馬鈴薯產(chǎn)量與品質的重要因素之一,也是馬鈴薯種薯退化的主要原因。據(jù)報道有40余種植物病毒可侵染馬鈴薯,并造成危害[2]。馬鈴薯帚頂病毒(Potato mop-top virus,PMTV)是帚狀病毒科(Virgaviridae)馬鈴薯帚頂病毒屬(Pomovirus)的代表成員[3]。感染PMTV的馬鈴薯植株上部葉片出現(xiàn)倒V型黃化斑紋,基部葉片出現(xiàn)不規(guī)則黃色斑塊或線狀紋,塊莖出現(xiàn)壞死弧紋或條紋,嚴重影響馬鈴薯的產(chǎn)量、品質及商業(yè)價值[4]。PMTV主要通過塊莖、粉痂菌(Spongospora subterranea)傳播,也可通過機械摩擦傳播[5]。PMTV曾在廣東、云南和四川等地的塊莖中被零星檢測到,但尚無在中國馬鈴薯產(chǎn)區(qū)大面積流行和傳播的報道[6-8]。鑒于該病毒的強致病性和危害性,中國已將其列入進境植物檢疫禁止進境物名錄。PMTV的病毒粒子為直桿狀,基因組由三條正義單鏈RNA組成,根據(jù)長度分別命名為RNA1、RNA2和RNA3[7]。三條RNA的3′末端沒有mRNA類似的多聚腺苷酸尾巴,但含有一個類似tRNA的結構[9]。RNA1長約6.1 kb,編碼兩個復制相關蛋白;RNA2長約3.1 kb,編碼兩個病毒外殼蛋白(Coat protein,CP);RNA3長約2.9 kb,編碼四個閱讀框(Open reading frame,ORF),其中ORF1-3部分重疊,組成保守的三基因盒(Triplegene block,TGB),編碼3個運動蛋白,ORF4編碼一個具有RNA沉默抑制子功能的富含半胱氨酸蛋白(Cysteine-rich protein,CRP)[10]。本研究報道了一株采自河北省馬鈴薯塊莖的PMTV全基因組序列,對其遺傳進化進行了分析,并構建了其侵染性克隆,以期為研究PMTV的致病和傳播機制、馬鈴薯的抗病機制以及建立科學防控策略提供理論基礎。
1.1.1 植物材料
感染PMTV的馬鈴薯塊莖采自河北省張北縣(由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院克山分院馬鈴薯資源研究所提供)。
1.1.2 菌株與載體
大 腸 桿 菌(Escherichia coli)DH5α、酵 母(Saccharomyces cerevisiae)Y2H Gold、農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)GV3101均 由 本 實 驗 保存;pCB301-2u-HDV載體來自浙江大學[11]。
1.1.3 培養(yǎng)基與生化試劑
本研究所用培養(yǎng)基及普通生化試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2.1 植物培養(yǎng)條件
野生型本氏煙(Nicotiana benthamiana)種植于植物生長箱中,溫度為白天25℃,夜間18℃,相對濕度50%和光周期16∶8(光照∶黑暗)。接種病毒以后,N.benthamiana置于溫度18℃的植物生長箱,濕度和光周期不變。馬鈴薯品種‘大西洋’‘中薯5號’和‘Favorita’組培苗在16℃無菌操作間培養(yǎng),組培苗移至土里后在23℃的植物生長箱中,相對濕度50%和光周期16∶8。
1.2.2 植物總RNA提取
采用普洛麥格(北京)生物技術有限公司的Eastep?Super總RNA提取試劑盒進行,具體操作根據(jù)產(chǎn)品說明書進行。
1.2.3 引物設計
從GenBank下載已報道的PMTV全基因組序列,用Clustal Omega[12]進行多序列比對,根據(jù)比對結果在保守位置設計引物(表1)。
1.2.4 cDNA合成、PCR擴增與克隆
反轉錄采用南京諾唯贊生物科技股份有限公司HiScriptⅢ1stStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper),具體操作根據(jù)產(chǎn)品說明書進行。PCR擴增采用50 μL體系,包括25 μL的2×Phanta高保真DNA聚合酶(用于目的片段擴增)或2×Taq Plus Master Mix(用于菌落鑒定),10 mmol/L上下游引物各1 μL,cDNA 1 μL。PCR程序設為95℃預變性3 min,30個熱循環(huán)(95℃變性30 s,60℃退火15 s,72℃延伸時間為:15 s每1 kb),72℃延伸7 min。pCB301-2μ-HDV載體的線性化PCR后,加入1 μLDpnI(NEB北京有限公司),混勻,37℃處理1 h,以降解模板質粒。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit回收擴增片段,回收的片段插入北京全式金(Transgen)生物技術有限公司pEASY-Blunt Zero載體,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,PCR鑒定陽性菌落,用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的FastPure Plasmid Mini Kit提取質粒,并送至上海生工生物工程有限公司進行序列測定,每個擴增片段最少測序4個克隆。
1.2.5 序列分析
克隆的DNA片段用Lasergene DNAstar7.0軟件包(DNAstar公司)Seqman Pro7.1.0進行拼接,用Seqbuilder Pro7.1.0進行ORF預測和蛋白翻譯。系統(tǒng)進化樹采用MEGA-X軟件中的最大似然法(Maximum-likelihood method),分支支持率采用1 000次重復檢測。
1.2.6 酵母同源重組
將線性化的pCB301-2μ-HDV載體與目的片段以等摩爾比混合后,用北京酷來搏科技有限公司的畢赤酵母感受態(tài)制備與轉化試劑盒轉化酵母。轉化產(chǎn)物經(jīng)低速離心后,全部涂布于缺色氨酸的SD固體培養(yǎng)基,用Parafilm封好口后,倒置于30℃培養(yǎng)2~4 d。
1.2.7 酵母質粒提取
采用北京酷來搏科技有限公司酵母質粒小提試劑盒進行,具體操作根據(jù)產(chǎn)品說明書進行。
1.2.8 農(nóng)桿菌轉化與侵染
將pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTV-RNA2和pCB301-PMTV-RNA3通過電擊法分別轉入農(nóng)桿菌GV3101。取15 μL轉化產(chǎn)物,涂布于含有50 μg/mL卡那霉素(Kanamycin)和50 μg/mL利福平(Rifampicin)的LB固體培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)2 d;挑取單克隆進行菌落PCR驗證。用槍頭將含有正確質粒的農(nóng)桿菌用牙簽接種于3 mL含有50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL利福平的LB液體培養(yǎng)基中,28℃搖床中120 r/min過夜培養(yǎng);室溫下,9 000 r/min離心1 min收集菌體。用1 mL浸潤緩沖液(10 mmol/L MES,pH 5.6;10 mmol/L MgCl2;100 μmol/L乙酰丁香酮)懸浮菌體,9 000 r/min離心1 min收集菌體;再用1 mL浸潤緩沖液懸浮與離心一次,用可見分光光度計將農(nóng)桿菌稀釋至OD600=0.5;取等量含有pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTV-RNA2和pCB301-PMTV-RNA3的農(nóng)桿菌懸浮混勻后,用1 mL無針頭注射器注射接種本氏煙草與馬鈴薯葉片。
研究所用的馬鈴薯塊莖品種未知,內部呈現(xiàn)壞死弧紋癥狀,經(jīng)ELISA檢測為PMTV陽性。根據(jù)GenBank中PMTV的序列設計表1引物以擴增該PMTV分離物的全基因組。經(jīng)克隆、測序和拼裝發(fā)現(xiàn)該PTMV的RNA1全長6 042 nt,RNA2全長3 134 nt,RNA3全長2 964 nt(GenBank序列號為OP221272-OP221274)。RNA1-3的編碼框與報道完全一致,但RNA3編碼的CRP前兩個密碼子分別為GTG和GTG。分析發(fā)現(xiàn),GenBank中所有33條PMTV全長RNA3僅有3個PMTV分離物(Sw、Yunnan和C52_P11)編碼CRP的第二個密碼子為ATG,而非GTG,因此CRP可能通過非ATG起始翻譯。將本PMTV的RNA1、RNA2和RNA3分別與GenBank數(shù)據(jù)庫中不同PMTV分離物的相應RNA片段進行多序列比對,并分析計算同源性。結果發(fā)現(xiàn),本PMTV的RNA1與RNA2和中國Yunnan分離物的核苷酸同源性最高,分別為99.80%和99.90%,RNA3與哥倫比亞的CO3核苷酸同源性最高,為99.90%(表2)。
表2 河北分離物與其他分離物核苷酸序列同源性Table 2 Nucleotide sequence identities between Hebei and other PMTV isolates
為明確該PMTV分離物與其他PMTV分離物的系統(tǒng)進化關系,從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載了所有PTMV RNA1、RNA2和RNA3全長序列(表1),并構建了RNA1、RNA2以及RNA3的最大似然系統(tǒng)進化樹。結果發(fā)現(xiàn),PMTV的RNA1可明顯分為兩個分支,本PMTV分離物的RNA1處于第一個分支中,與PMTV云南分離物關系最近(圖1A);RNA2分為三個分支,絕大多數(shù)分離物處于第一分支,而分支III僅包括秘魯?shù)腏20_J203一個分離物,本PMTV分離物的RNA2處于第一個分支中,與中國Yunnan、日本Hiroshima、丹麥54-8、54-11、54-21以及54-26聚于同一小分支(圖1B);RNA3分為四個分支,分支III包括瑞典Sw和云南分離物,而分支IV僅包括秘魯?shù)腏20_P157一個分離物,本PMTV分離物的RNA3處于第一個分支中,與丹麥Rn23分離物關系最近(圖1C)。
圖1 PMTV最大似然系統(tǒng)進化樹Figure 1 Maximum likelihood phylogenetic trees of PMTV
表1 試驗所用引物序列Table 1 Primers used in the study
根據(jù)PMTV RNA1、RNA2和RNA3的5′和3′最末端非編碼區(qū)的保守序列,設計引物以直接擴增RNA2和RNA3全長序列,RNA1分為2個約3 000 bp的片段(分別記為RNA1-F1和RNA1-F2)擴增(圖2A)。用引物RZ-F和CaMV 35S-R,以pCB301-2μ-HDV為模板,進行PCR擴增,獲得線性化的pCB301-2μ-HDV載體(圖2A)。所有片段兩端與載體含有20 bp左右的同源臂。將線性化的pCB301-2μ-HDV載體分別與RNA2、RNA3、以及RNA1-F+RNA1-F2共轉化酵母。用引物35SF和RNA1-5360R對隨機選擇的15個轉化RNA1-F+RNA1-F2的酵母克隆進行菌落PCR檢測,結果發(fā)現(xiàn)有6個克隆能擴增到5 000 bp大小的目的條帶(圖2B),用引物RNA2-620F和NOS-R對隨機選擇的15個轉化RNA2的酵母克隆進行菌落PCR檢測,結果表明其中有5個克隆能擴增到2 500 bp左右的目的條帶(圖2C),用引物RNA3-800F和RNA3-2200R對隨機選擇的15個轉化RNA3的酵母克隆進行菌落PCR檢測,結果發(fā)現(xiàn)有13個克隆能擴增到1 400 bp左右的目的條帶(圖2D)。分別選取PCR擴增條帶最亮的3個克隆,提取酵母質粒,直接轉化E.coliDH5α。經(jīng)再次菌落PCR驗證后,提取質粒送于公司測序,獲得含有PMTV河北省馬鈴薯分離物RNA1、RNA2和RNA3的質粒,并命名為pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTV-RNA2和pCB301-PMTV-RNA3。
圖2 PMTV侵染性cDNA克隆的構建Figure 2 Construction of PMTV infectious cDNA clone
用本氏煙驗證所構建PMTV侵染性克隆的活性。將含有pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTVRNA2和pCB301-PMTV-RNA3的農(nóng)桿菌菌液等比例混合后,注射6株4周大小的本氏煙。接種后9 d時,本氏煙的系統(tǒng)葉片開始出現(xiàn)褪綠癥狀,隨著時間的延長,癥狀逐漸加重,并出現(xiàn)明顯的花葉和葉片輕微皺縮的癥狀(圖3A)。在接種14 d,采集本氏煙帶有癥狀的葉片,提取總RNA,分別用引物RNA1-730F+RNA1-5360R、RNA2-620F+RNA2-2800R、RNA3-800F+RNA3-2200R進 行RT-PCR,以 檢 測RNA1、RNA2和RNA3。RT-PCR結果顯示,在6株本氏煙葉片中均可以檢測到病毒RNA1、RNA2和RNA3的存在(圖3B~D),表明PMTV的侵染效率達到100%(圖3B~D)。
圖3 PMTV侵染性cDNA克隆在本氏煙上的侵染性測定Figure 3 Infectivity analysis of PMTV infectious cDNA clone on N.benthamiana
將含有pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTVRNA2和pCB301-PMTV-RNA3的農(nóng)桿菌菌液等比例混合后,分別注射‘大西洋’‘中薯5號’和‘Favorita’無毒組培苗(每個品種各6株),以進一步檢測PMTV侵染性克隆對馬鈴薯的侵染能力。接種20 d后,‘大西洋’葉片出現(xiàn)輕微的黃化,而‘費烏瑞它’和‘中薯5號’沒有明顯癥狀(圖4A)。接種20 d時,采集組培苗上部帶有癥狀的葉片,提取6株混合樣的總RNA,用引物RNA2-1230F與RNA2-2800R進行RT-PCR檢測,結果發(fā)現(xiàn)‘大西洋’中可以擴增到PMTV RNA2的目的片段,而‘費烏瑞它’和‘中薯5號’中不能擴增到預期大小的目的片段(圖4B)。分別提取接種PMTV的6株‘大西洋’總RNA,用引物RNA2-1230F與RNA2-2800R進行RT-PCR檢測,以分析PMTV的侵染效率。結果發(fā)現(xiàn)4株‘大西洋’可以檢測到病毒的存在,發(fā)病率為66.67%(圖4C)。
圖4 PMTV侵染性cDNA克隆在馬鈴薯上的侵染性測定Figure 4 Infectivity analysis of PMTV infectious cDNA clone on potato
本研究從一個采自河北省張北縣的馬鈴薯薯塊上克隆了一株PMTV的全基因組序列,多序列比對和系統(tǒng)進化樹分析表明,PMTV的RNA1與此前報道一致分為兩個分支[13,14],RNA2分為3個分支,該分離物的RNA1與RNA2均與國內報道的云南分離物關系最近,說明本研究所用馬鈴薯上的PMTV有可能通過云南與河北之間的種薯調運而來,但還需進一步研究確定。值得注意的是,系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)該分離物的RNA3與來自瑞典的Rn23關系最近而與云南馬鈴薯分離物的進化關系較遠,說明本試驗克隆的PMTV的RNA3曾與其他分離物的RNA3發(fā)生過重配,但是重配發(fā)生的時間及地點未知。
PMTV侵染性克隆之前已有報道[15]。本試驗構建的PMTV侵染性克隆與之相比,具有不需要依賴于體外轉錄的優(yōu)點。此外,本侵染性克隆來自于中國本土發(fā)生的帶病馬鈴薯,而不是PMTV代表株系Sw。侵染性試驗表明本分離在本氏煙上造成花葉的癥狀,而Sw造成黃花葉的癥狀[15],說明兩者在致病性方面存在明顯差異。馬鈴薯侵染試驗表明,在本試驗的條件下,該侵染性克隆能侵染‘大西洋’,但不能引起明顯的癥狀,也不能侵染‘中薯5號’與‘費烏瑞它’,說明本侵染性克隆在不同的馬鈴薯品種上侵染力不同。溫度在PMTV致病過程中具有重要的作用,低溫有利于病癥的發(fā)展和顯現(xiàn)[16]。本研究未能在‘大西洋’上觀察到癥狀,可能是由于溫度等條件所限。而不能侵染‘中薯5號’與‘費烏瑞它’的原因未知,還需進一步試驗驗證。
PMTV為三分體病毒,成功侵染需要3條RNA在同一細胞表達。本試驗所構建的侵染性克隆雖然在本氏煙上實現(xiàn)100%的侵染效率,但侵染‘大西洋’時只有66.67%(4/6)的侵染率,后續(xù)可考慮將病毒的兩條RNA整合到一個質粒中,以提高馬鈴薯的侵染效率。本試驗構建的侵染性克隆成功在煙草與馬鈴薯建立侵染,為進一步開展PMTV與寄主互作的研究,揭示其分子致病機制奠定基礎。