大黃蒽醌類成分在不同煎煮時間內(nèi)的含量變化分析*

唐艷，張永，潘翔玲，程鋼

1 安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

2 國家中醫(yī)藥管理局中藥化學三級實驗室 安徽合肥 230032

3 安徽省長豐縣中醫(yī)院 安徽合肥 231199

大黃為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatumL.）、唐古特大黃（Rheum tanguticumMaxim. ex Balf.）、藥用大黃（Rheum officinale Baill.）的干燥根及根莖，為傳統(tǒng)中醫(yī)藥瀉下劑中的主要藥味，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)等功效[1]。中國藥典以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚五種蒽醌類成分為指標性成分，藥理研究表明，結合型蒽醌是大黃發(fā)揮瀉下作用的主要化學成分[2-4]，結合蒽醌在溫度過高或受熱過久時易分解為游離型蒽醌，故煎煮時間的合理控制對臨床大黃入湯劑發(fā)揮瀉下作用影響較大。目前，已有多篇文獻以蒽醌類成分含量為大黃質(zhì)量控制的檢測指標[5-7]，比較不同煎煮時間內(nèi)不同大黃炮制品對大黃蒽醌類成分的影響，煎煮時間與蒽醌類成分含量的變化的相關實驗研究尚未有明確結論。

本研究擬使用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC），以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚五種成分為檢測指標性成分，比較在不同煎煮時間內(nèi)大黃飲片和粗粉的總蒽醌和游離蒽醌的含量變化趨勢，以期為臨床大黃入湯劑的煎煮時間和煎煮方式提供參考。

材料與方法

1 儀器及試劑

1.1 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀（美國Agilent公 司），超 聲 清 洗 器（BiosaferSB-3200DT-6L，南京賽飛生物科技有限公司），電子天平（BT25S，1/100000，賽多利斯科學儀器北京有限公司），電熱恒溫水浴鍋（H.H.S21-4上海醫(yī)療器械五廠），調(diào)溫電熱套（PTHW，鞏義市予華有限責任公司）。

1.2 藥品及試劑 對照品蘆薈大黃素（純度98%，批號B20772）、大黃酸（純度98%，批號B20245）、大黃素（純度98%，B20240）、大黃酚（純度98%，批號B20238）、大黃素甲醚（純度98%，批號B20242），均購買于上海源葉生物科技有限公司。生大黃飲片購于安徽井泉中藥飲片有限公司，經(jīng)安徽醫(yī)藥高等專科學校方前波副教授鑒定為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.的干燥根及根莖。三氯甲烷、鹽酸、磷酸為分析純，甲醇（批號17095089，色譜純，Tediacompaing，Inc）。

2 實驗方法

2.1 傳統(tǒng)飲片、最粗粉煎煮液的制備 用量筒量取450 ml純水，至不銹鋼量杯中，武火煮沸后，改用文火保持微沸，分別取大黃切制飲片與最粗粉末（全部過一號篩，但混有能通過三號篩的粉末不超過20%）50g，分 別 煎 煮 至5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、40 min時關火取出，煎煮液趁熱用紗布過濾，放至室溫，轉移至500ml容量瓶中，加水稀釋搖勻至刻度，即得。

2.2 雙頸燒瓶回流提取飲片、最粗粉 用量筒量取500 mL純水，至1000 mL雙頸燒瓶中，電熱套中加熱回流至水沸騰，改用文火保持微沸，分別取大黃切制飲片與最粗粉末50g加入，繼續(xù)煎煮，分別在5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min時各取10 mL，每次取完水煎液后立即加入10 mL熱水，分別將各時間點樣品離心5 min，取上清液，即得。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆薈大黃素1.74mg、大黃酸2.05 mg、大黃素2.00 mg、大黃酚3.60 mg、大黃素甲醚0.84 mg，至25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，超聲20 min，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即為混合對照品儲備液。

2.3.2 總蒽醌供試品溶液的制備 精密量取大黃水煎液5 mL，至50 mL圓底燒瓶中，加16%的鹽酸5 mL，超聲2 min，加三氯甲烷10 mL，電熱恒溫水浴鍋中水浴回流1h，放至室溫，轉移至分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌燒瓶，洗滌液并入分液漏斗中，振搖分層，取三氯甲烷層，上層酸液再用三氯甲烷洗滌兩次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，60～70 ℃水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 游離蒽醌供試品的制備 精密量取大黃水煎液2 mL，至10 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，超聲10 min，加甲醇補足至刻度，即得。

2.4 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 nm×4.6 mm），流 動 相：甲醇-0.1%磷 酸（85：15），檢測波長：254 nm，流速：1.0 mL/min，進樣量：10μL，柱溫：30℃。色譜圖見圖1，1-5色譜峰分別為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚。

圖1 對照品溶液（A）及供試品溶液（B）的色譜圖

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 分別精密吸取2.6項下混合對照品儲備液0.3 mL，0.5 mL，1mL，2 mL，5 mL，10 mL至10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成不同濃度的對照品溶液，按2.5項下色譜條件進行分析，觀察色譜圖，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，得到線性回歸方程。見表1。

表1 五種蒽醌類成分回歸方程和線性范圍

2.5.2 精密度試驗 吸取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算RSD分別為0.91%、1.23%、0.98%、1.40%、1.37%，均＜3%。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 吸取同一供試品溶液，分別在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，進樣，記錄峰面積，計算RSD分別為1.25%、1.01%、1.29%、1.70%、1.72%。。

2.5.4 重復性試驗 取2.1項下某一煎煮時間的水煎液，按照2.3.3項下供試品的制備方法，平行制備6份游離蒽醌供試品溶液，進樣，記錄峰面積，帶入標準曲線計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量，RSD分別為1.91%、1.33%、1.60%、1.53%、1.82%。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取蘆薈大黃素1.20 mg、大黃素1.06 mg，至50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲20 min，即得儲備液A；精密稱取大黃酸3.75 mg，至25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲20 min，即得儲備液B；精密稱取大黃酚1.01mg、大黃素甲醚1.48 mg，至100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲20 min，即得儲備液C。取2.3.3項下制備的供試品溶液，離心5min，精密吸取上清液1mL，至10 mL棕色量瓶中，分別精密加入儲備液A、B、C各1mL，加甲醇稀釋至刻度，超聲5 min，用甲醇補足至刻度，2.4項下的色譜條件進行分析，記錄峰面積，計算加樣回收率分別為100.1%（RSD=1.10%），97.3%（RSD=1.46%），97.6%（RSD=1.70%），7.9%（RSD=1.80%）、101.3%（RSD=1.60）。

2.6 樣品含量測定 將總蒽醌和游離蒽醌供試品溶液，在2.4項下的色譜條件進樣，得到大黃飲片和粗粉的總蒽醌，游離蒽醌的含量，見表2。

表2 大黃總蒽醌及5個游離蒽醌含量表（n=2）

結 果

1 不同提取方法的比較

實驗比較了傳統(tǒng)煎煮法和雙頸燒瓶回流兩種提取方法對大黃飲片和粗粉水煎液蒽醌類成分的影響，結果如圖2所示，圖中AB為飲片提取，CD為粗粉提取，就粗粉提取而言，在不同提取時間點，回流法提取的總蒽醌含量遠高于傳統(tǒng)煎煮法（圖2-A），差異性較為明顯，游離蒽醌含量總體也是回流法略高于傳統(tǒng)煎煮法（圖2-B）。反觀飲片提取，總蒽醌含量在前30min，兩種提取方法無顯著性差異，在40min時，回流法提取率顯著提高（圖2- C）；游離蒽醌在5～10min時，傳統(tǒng)煎煮法提取率更高（圖2-D），之后兩種提取方法對游離蒽醌的含量影響較小。此外，傳統(tǒng)煎煮方法提取在50-60min時總蒽醌和游離蒽醌成分含量驟減，未達到檢測值，而回流法此時兩種成分含量未受到影響。

圖2 大黃不同提取方法的比較

2 大黃不同煎煮時間內(nèi)蒽醌類成分的比較

實驗比較了以傳統(tǒng)煎煮方法提取，大黃飲片和粗粉在不同提取時間內(nèi)總蒽醌和游離蒽醌的含量變化，結果如圖3、圖4所示。結果表明，大黃飲片在5～20分鐘內(nèi)，總蒽醌含量隨著時間增加不斷提高，在20min達到最高值，而游離蒽醌含量在各時間段總體較為穩(wěn)定，無明顯差異；大黃粗粉在5～15min內(nèi)總蒽醌和游離蒽醌變化趨勢一致，含量均不斷降低（圖4），15分鐘之后二者含量不斷增加，但均不超過5分鐘時的總含量。

圖3 大黃飲片不同提取時間內(nèi)蒽醌類成分的含量變化圖

圖4 大黃粗粉不同提取時間內(nèi)蒽醌類成分的含量變化圖

討 論

文獻報道大黃藥材有效成分的含量測定提取過程多是以大黃粉直接提取，比較不同煎煮時間內(nèi)蒽醌類成分的含量變化[8-9]，本實驗基于中藥傳統(tǒng)“后下”之意，于水煎液微沸之后，再加入大黃飲片，最大程度上還原臨床患者在家標準湯劑的煎煮流程，做到在“大黃后下”的基礎上再去比較不同煎煮時間內(nèi)蒽醌類成分含量的高低變化趨勢，更具有合理性和現(xiàn)實性。

經(jīng)過大黃飲片與最粗粉的實驗結果對比發(fā)現(xiàn)，大黃最粗粉煮散提取較飲片而言，總蒽醌、游離蒽醌含量都明顯增高，分析原因為最粗粉和水的接觸面積比飲片大，更易于溶解，故在煎煮過程中，粗粉不僅能煎出更多的蒽醌類成分，還能減少煎煮時間，但是大黃粗粉存在臨床使用煎煮過程中加蓋時大黃容易粘壁，不加蓋時容易煮干等問題，并不適用于粉狀煎煮，故現(xiàn)臨床還是以飲片煎煮入藥為主。

傳統(tǒng)中醫(yī)“后下”的釋義為藥材在煎煮結束之前最后5～10min放入，大黃為后下藥材之一，起源于張仲景的大承氣湯，本實驗結果表明，大黃飲片水煎液結合蒽醌含量在20min時含量最高，與劉永濤[10]等人實驗研究數(shù)據(jù)表明：大黃的瀉下成分蒽醌類成分在15～20min達到最大值，結果相互印證；與傳統(tǒng)中藥材“后下”時間5～10min相差甚遠。生大黃主瀉下作用，結合型蒽醌是大黃發(fā)揮瀉下的主要成分，隨著煎煮時間增加，蒽醌含量的變化規(guī)律與煎煮時間是否存在相關性存在諸多爭議，大黃入標準湯劑的后下時間規(guī)律后期需要更加全面的實驗研究進一步證實。